引物对、红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及红色毛癣菌检测相关技术领域。更具体地说，本发明涉及一种引物对、红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒及检测方法

背景技术

红色毛癣菌是最常见的引起皮肤癣菌病的真菌。目前红色毛癣菌的检测仍然以传统的镜检和培养为主。只要用显微镜在取下的标本中找到菌丝和(或)孢子，诊断即成立。直接镜检检测操作简单，允许临床医生快速获得检测结果制定治疗方案。但是标本制备及检测者的专业水平对结果影响较大，在临床实践中，假阴性率达到15-30％。真菌培养可以明确致病菌及其活力，且可以根据形态学鉴定至种属，但耗时久，需要4周及以上。

近些年开始引入分子生物学技术用于甲真菌病的直接检测，包括PCR扩增联合凝胶电泳、PCR扩增联合酶切电泳、PCR-ELISA、PCR-sequencing和多重real-time PCR，其优势在于敏感性和特异性均较高，并且不易受用药影响，但受到仪器设备的限制。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification assay，RPA)是英国公司TwistDx Inc于2006年开发的核酸等温扩增技术。RPA检测包含三个关键酶：重组酶、单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein，SSB)和DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成核酸蛋白复合体，该复合体在双链DNA中寻找定位同源序列后引发链交换反应形成D环结构，SSB稳定被置换的DNA单链，随后重组酶解离，聚合酶在引物3’-OH端添加碱基启动聚合反应。RPA在37～42℃条件下，实现对目标片段有效等温扩增，20min即可完成反应，且操作简便。RPA技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合形成RPA-LFD检测体系，不需要电泳仪、荧光仪监测设备，可在5min内完成对扩增产物的快速可视化检测。目前国际上尚无基于RPA-LFD检测红色毛癣菌的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种引物对、红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒及检测方法，能够实现红色毛癣菌的快速检测。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述引物对用于检测红色毛癣菌。

本发明还提供了红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒，包括所述的引物对。

进一步地，还包括：SEQ ID No.3所示的探针；侧流层析试纸条。

进一步地，所述探针5’端用FAM修饰，3’端用C3-Spacer修饰。

进一步地，所述侧流层析试纸条的结合垫中设置有胶体金包被的抗FAM抗体。

进一步地，所述侧流层析试纸条上具有检测线和质控线，所述检测线处设置有链霉亲和素，所述质控线处设置有抗FAM抗体。

本发明还提供了红色毛癣菌检测方法，利用所述的红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒检测红色毛癣菌。

进一步地，包括：提取待测样品的DNA；利用所述引物对和所述探针进行RPA扩增反应；利用所述侧流层析试纸条检测扩增产物。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明设计了SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对，成功将RPA和侧流层析试纸条结合，用于检测红色毛癣菌，检测操作简单，具有较好的敏感性和特异性，检测速度快，适用于即时诊断，有较好的应用前景。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为红色毛癣菌assay敏感性检测结果；

图2为红色毛癣菌assay特异性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本申请的实施例提供了引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，所述引物对用于检测红色毛癣菌；引物对的设计无标准流程，需要在满足一下规则的情况下，进行创造性劳动：1)引物长度一般在15-30碱基之间；2)引物GC含量在40％-60％之间，Tm值最好接近72℃；3)引物3′端要避开密码子的第3位；4)碱基要随机分布；5)引物自身及引物之间不应存在互补序列；6)引物应具有特异性。SEQ ID No.1：CTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTCAAGC；SEQ ID No.2：5’-biotin-CCTGAAAAGATATATATATATATAAAGATTGGG；SEQ ID No.2引物的5’端由生物素biotin标记。

本申请的实施例还提供了红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒，包括所述的引物对，利用引物对及RPA反应原料进行RPA反应，实现RPA扩增，随后利用试纸条进行检测。

在另一个实施例中，还包括：SEQ ID No.3所示的探针；侧流层析试纸条；优选地，序列SEQ ID No.3为：

5’-FAM-TCCGGCTTCCTAGGCGAATGGGCAGCCAATT/idSp/AGCGCCCTCAGGACCG-C3Spacer-3’，5’端用FAM修饰，3’端用C3-Spacer修饰，idsp表示碱基缺失；试纸条一般包括：样品垫、结合物释放垫、固定抗体的膜、吸附垫和加样孔，试纸条的各个部分固定在一个惰性的背衬材料上。

在另一个实施例中，所述侧流层析试纸条的结合垫中设置有胶体金包被的抗FAM抗体；试纸条的结合垫中预先固定有胶体金包被的兔来源的抗FAM抗体；胶体金中心为金原子凝聚成的金颗粒，周围吸附了一层负离子，使得胶体金带负电荷，可以在蛋白质/核酸上做标记，且不影响蛋白质/核酸的活性，同时喷涂有胶体金标记兔IgG，为胶体金和兔IgG结合体。

在另一个实施例中，所述侧流层析试纸条上具有检测线和质控线，所述检测线处设置有链霉亲和素，所述质控线处设置有抗FAM抗体；优选地，检测线和质控线利用硝酸纤维膜包被，距离加样孔近端为检测线，包被有能够识别生物素的链霉亲和素(streptavidin，SA)，远端为质控线，包被有鼠抗兔IgG抗体；扩增产物加入加样孔后，样本在毛细作用下沿试纸条由近向远移动，样本中5’端为FAM标记的产物将在结合垫处与胶体金包被的抗FAM抗体结合形成复合物；层析至检测线处(T线)，T线固定的链霉亲和素与3’端为生物素标记的扩增产物结合，胶体金在此处发生聚集沉淀而显示红色，这是由于聚集而颗粒变大的光学效应；未被捕获的胶体金包被的兔来源的抗FAM抗体层析至质控线处(C线)，C线固定的抗兔IgG抗体与之结合，胶体金在此聚集沉淀而显示红色，证明层析过程顺利完成，检测试纸条工作正常。

本申请的实施例还提供了红色毛癣菌检测方法，利用所述的红色毛癣菌RPA试纸条试剂盒检测红色毛癣菌，即利用引物对、探针、试纸条等材料对红色毛癣菌进行检测。

在另一个实施例中，包括：S1：提取待测样品的DNA，可选地，采用有机溶剂提取法或Chelex-100提取法；优选地，采用chelex-100加热煮沸法提取DNA；Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA分离。

S2：利用所述引物对和所述探针进行RPA扩增反应；可选地，将提取的DNA、引物对、探针、缓冲液、模板、无核酸酶水混合进行RPA反应

S3：利用所述侧流层析试纸条检测扩增产物；同时出现T线和C线为阳性(+)，仅出现C线为阴性(-)，只出现T线需考虑试纸条是否有效。

以下以具体实施例说明：

样本处理：利用chelex-100加热煮沸法提取待测样品DNA；

5％ Chelex-100裂解液的配制，称量5g Chelex-100、吸取1mL的TritonX-100溶于100mL 1×TE缓冲液后，混匀后标记备用。收集待测样品加入1.5mL EP管中，放入适量玻璃珠以及200μL的5％ Chelex-100裂解液，震荡10min，置于金属浴中100℃加热10min。加热煮沸的粗提取液12 000rpm/min离心5min，将上清液转移到新的1.5mL，即为待测样品DNA提取产物。

反应体系如表1所示：

表1反应体系试剂用量

反应条件：将表1中共47μL的RPA反应体系混合；手弹使冻干粉(正向引物、反向引物和探针可使用冻干粉形式)充分溶解，并短暂离心；反应盖上加3ul启动剂，盖紧管盖，短暂离心使启动剂加入预混液中，手弹混匀短暂离心；将反应管放入相应恒温加热仪(39℃)20分钟；取96孔板，每孔加入100ul缓冲液(Milenia Hybridtech核酸扩增快速检测试纸条内配备的缓冲液)，加入10ul反应产物充分混匀后，加入试纸条的加样孔内，观察结果。

结果判读：同时出现T线和C线为阳性(+)，仅出现C线为阴性(-)，只出现T线需考虑试纸条是否有效。

敏感性及特异性检测：

选取一株红色毛癣菌价其检测效力，利用DNeasy Plant Mini Kit植物DNA提取试剂盒提取真菌基因组DNA。

提取所得真菌基因组DNA经NanoDrop 2000微量紫外分光光度计准确定量，用灭菌注射用水准确稀释至0.5×10ng/μL后，10倍稀释得到0.5×10ng/μL-0.5×100fg/μL 6个系列稀释标准品，以无菌水作为NTC模板。将0.5×10ng/μL-0.5×100fg/μL的基因组DNA标准品按照上述方法，每个反应体系加入2μL模板(真菌基因组DNA)，即每孔10ng-×100fg基因组DNA标准品按照上述条件在39℃恒温加热仪加热扩增后用测流层析试纸条进行检测，将试纸条拍照记录。结果如图1所示，根据检测结果可知，本申请的检测下限是能够稳定扩增的最低模板量为10pg/反应，具有较好的敏感性。

提取红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、断发毛癣菌、趾间毛癣菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、糠秕马拉色菌、球型马拉色菌、镰刀菌、青霉菌、土曲霉、黄曲霉、烟曲霉、枝顶孢、孢子丝菌、疣状瓶霉等的DNA，进行特异性检测，结果如图2显示，本申请的引物对、探针特异性能够扩增红色毛癣菌，对另外17种非红色毛癣菌真菌无交叉反应。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明引物对、红色毛癣菌RPA侧流层析试纸条试剂盒及检测方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。