一种发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一种发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法。

背景技术

ARTP(atmospheric and roomtemperature plasma，常压室温等离子体)是一种新型而有效的物理微生物诱变工具，用于各种微生物的突变体培育。通过改变等离子体的剂量或处理时间，可以获得具有不同的DNA和寡核苷酸随机断裂的突变菌株。与紫外线或化学诱变相比，ARTP能够有效造成DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株；与分子操作手段相比，具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。目前，ARTP已经成功地应用于单独或联合诱变，以提高各种次级代谢物的产量，增加细胞生长和生物量，提高酶的活性，以及增强微生物对培养基成分或极端条件的耐受性。

脂肪酶(EC3.1.1.3，Triacylglycerol acylhydroiase)，又称三酰基甘油酯水解酶，是指能催化水解脂肪和油脂，并释放出游离的脂肪酸、甘油、甘油单酯或甘油二酯的一类酶。研究表明脂肪酶除能够水解脂肪外，还具有催化发生醇解、氨解、酸解、酯化合成和转酯等反应特性，以及具有对映体选择性、立体选择性和区域选择性的特殊性质。脂肪酶催化反应条件温和，不需要辅酶，副产物少。因此，脂肪酶现在已经成为现代生物催化剂中最为重要成员之一，目前正广泛的应用于食品、洗涤、化工、纺织、制药、生物柴油、化妆品、生物高分子聚合物等领域。

卡门柏青霉菌脂肪酶PCL(Penicillium camembertii lipase)是一种真菌来源的偏甘油脂脂肪酶(mono,di-acylglycerol lipase,MDGL)，这类脂肪酶只对甘油单酯和甘油二酯有水解活力，而无法水解甘油三酯。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种发酵培养基。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种发酵培养基，其包括如下成分：油酸二酯30g、脱脂豆粉40g、糊精5g、K

本发明的另一个目的是提供一种发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种提高脂肪酶活性，其包括如下步骤，

优化培养基：对于发酵培养基进行碳源、氮源、金属离子的优化，得到优化后培养基；

培养基培养：将卡门柏青霉菌丝接种在MEB培养基中，培养至长出孢子；

诱变处理：将孢子制片然后再等离子体发生器下进行诱变处理；

诱变结果验证：将诱变处理后的孢子清洗干净后在MEB培养基上培养，然后转移至二油酸甘油酯罗丹明B平板，根据荧光圈进行比较；

发酵：将卡门柏青霉接种在优化后培养基上，进行发酵，测定产物计算产率。

作为本发明所述发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法的一种优选方案，其中：优化培养基中，所述碳源包括麸皮、大豆油、橄榄油、二油酸甘油酯、橄榄二酯油和油酸甲酯中的一种或几种。

作为本发明所述发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法的一种优选方案，其中：优化培养基中，所述氮源包括脱脂豆粉、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏中一种或几种。

作为本发明所述发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法的一种优选方案，其中：金属离子包括K

作为本发明所述发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法的一种优选方案，其中：ARTP诱变处理中，载片与等离子体发生器射流出口间距为2mm，功率为120W，氦气的气流量12.5L·min

作为本发明所述发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法的一种优选方案，其中：诱变结果验证中，二油酸甘油酯罗丹明B平板为蛋白胨5g，牛肉膏5g，氯化钠5g,(NH

作为本发明所述发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法的一种优选方案，其中：发酵中，在优化后培养基上进行接种，制得卡门柏青霉全细胞催化剂。

作为本发明所述发酵培养基与ARTP诱变结合提高脂肪酶活性的方法的一种优选方案，其中：鉴于卡门柏青霉脂肪酶特殊的催化特性,将其用于催化酯化，反应于茄形瓶中进行，25mL茄形瓶中分别加入5g油酸，6.5g甘油，7.5％的全细胞催化剂(总底物质量计)，1％的含水量。

本发明有益效果：

本发明通过结合发酵培养和ARTP诱变的方法对菌种进行改良，将不同影响脂肪酶活性的培养基成分进行逐步优化，在获得最优培养基的基础上，对原始菌株采用ARTP诱变育种，诱变后的优良菌株挑选出来先用含有13％甲醇浓度的MEB平板进行耐甲醇筛选，将生长的菌株接种到二油酸甘油酯罗丹明B平板，挑选出荧光圈面积明显增大的突变菌株进行发酵培养测脂肪酶活性，表明改进后结合发酵培养基能够显著提升酶活，在实验过程中，发现存在一株具有显著的提升酶活的菌株并且遗传性状稳定的突变菌株卡门柏青霉菌株P42。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为卡门柏青霉在不同碳源下的脂肪酶活性；

图2为卡门柏青霉在不同氮源下的脂肪酶活性；

图3为卡门柏青霉在不同金属离子下的脂肪酶活性；

图4为突变菌株在13％甲醇浓度MEB平板的菌株生长数；

图5为突变菌株在二油酸甘油酯罗丹明B平板上的荧光圈大小的示意图；

图6为突变菌株在优化发酵培养基中的脂肪酶活性；

图7为高脂肪酶活性的卡门柏青霉对合成甘油二酯的优势。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明实施例中使用的突变菌株为卡门柏青霉菌株，使用的突变菌株或者卡门柏青霉菌株均为分类命名为Penicillium camembertii P42，其具体保藏编号参见菌种保藏证明。

本发明实施例中使用的13％甲醇浓度MEB平板为麦芽提取物17g,真菌学蛋白胨3g,琼脂15g，用蒸馏水定容至1000mL，115℃灭菌10min，待冷却至40℃,添加13％(w/w)甲醇；

实施例1

本实施例提供培养基碳源的优化：

本实施例中培养基按照如下培养基进行优化：油酸二酯30g、脱脂豆粉40g、糊精5g、K

发酵培养基碳源的优化：分别在基本培养基中添加麸皮、大豆油、橄榄油、二油酸甘油酯、橄榄二酯油和油酸甲酯作为诱导碳源发酵培养至90h，收集菌体冷冻干燥，测定脂肪酶活性，结果如图1所示。

由图1所示，不同种类的碳源对于脂肪酶的活性存在影响，当选择的碳源为油酸二酯时，能够实现酶活至少为其他任意一种碳源酶活的200％之上。

实施例2

本实施例提供培养基氮源的优化：

本实施例与实施例1相同，其区别如下：

发酵培养基氮源的优化：向实施例1中优化碳源的培养基中添加脱脂豆粉、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏，使用量不变，均为40g，作为氮源发酵培养至90h，收集菌体冷冻干燥，测定脂肪酶活性，结果如图2所示。

由图2可得，不同种类的氮源对于脂肪酶的活性存在影响，当选择的氮源为脱脂豆粉时，相较采用其他氮源酶活至少存在20％的性能优势。

实施例3

本实施例提供培养基金属离子的优化：

发酵培养基金属离子的优化：向实施例2中已经优化碳源和氮源培养基中添加K

由图3可得，加入的不同种类的金属离子时，会带来脂肪酶酶活的变化，当使用的金属离子为钾时，相较其他金属离子的使用具有酶活至少为200％的酶活性能优势。

实施例4

本实施例提供如何进行ARTP诱变筛选：

a.将卡门柏青霉菌丝接种到MEB斜面培养基，30℃恒温培养箱培养5-7d，待其长出孢子，用生理盐水将新鲜斜面上的孢子洗下，配制2×10

b.开启常温常压等离子系统，使载片与等离子体发生器射流出口间距约2mm，功率为120W，氦气的气流量12.5L·min

c.处理结束后，在无菌环境中将载片上的菌物用1ml生理盐水洗脱至EP管，取100μL涂布于含有13％甲醇浓度MEB平板，30℃避光恒温培养5d，菌株生长情况见图4；

由图4可得，随着诱变时间的增加，会带来诱变效果增加的情况下，也会带来菌落数减少的问题，在诱变时间大于150s的情况下，菌株的存活个数急剧下降，在兼顾诱变效果和存活菌落个数的情况下，选择150s为优选的诱变处理时间。

将培养5d的含有13％甲醇浓度MEB平板上长出的菌株分别接种到二油酸甘油酯罗丹明B平板，30℃避光恒温培养72h，然后进行荧光圈大小的比较，结果见图5；

由图5可得，p42的荧光圈最大，脂肪酶活性最好。

二油酸甘油酯罗丹明B平板：蛋白胨5g，牛肉膏5g，氯化钠5g,(NH

将传代培养稳定的菌株在优化的发酵培养基培养至90h，收集菌体冷冻干燥，测定脂肪酶活性，结果如图6所示。

由图6可得，本实施例提供的培养基能够实现对于菌株的培养效果，实现菌株高脂肪酶活性的稳定遗传。

实施例5

本实施例用以进行甲酯化反应的优化：

a、卡门柏青霉接种到优化的发酵培养基，在28℃、180r/min条件下摇瓶培养，过滤分离收集菌体，冷冻干燥得到卡门柏青霉全细胞催化剂。

b、于25mL茄形瓶中分别加入5g油酸，6.5g甘油，7.5％的全细胞催化剂(总底物质量计)，1％的含水量，置于水浴摇床中，40℃，180rpm反应。

c、甘油酯含量采用气相色谱(GC，Aglilent 7890A)分析，取50μL产物与50μL20mg/mL的三癸酸甘油酯内标物和150μL正己烷混合，分析条件为：DB-5HI非极性毛细管柱，FID检测器，载气为高纯氮气，流速为30mL/min。进样量1μl，分流比10:1，进样口和检测器温度分别设为360℃和380℃，初始温度70℃，保温1min，然后以15℃/min升至380℃，保温6min。

对甘油酯含量按如下公式计算:

MAG含量(％)＝MAG/(MAG+DAG+TAG)×100％

DAG含量(％)＝DAG/(MAG+DAG+TAG)×100％

TAG含量(％)＝TAG/(MAG+DAG+TAG)×100％

测得的高脂肪酶活性卡门柏青霉P42菌株的转酯化结果如图7所示。

测试了全细胞催化剂对MAG和DAG的特异性。结果如图7所示，卡门柏青霉对合成甘油二酯具有很大的优势，且因其反应过程中甘油三酯的产生较少，从而可用于高纯度甘油二酯的制备中。

在本技术领域中，以其他技术方案为例：“[1]张大皓,李丹,王炳武等.用豆粕发酵生产卡门柏青霉脂肪酶[J].过程工程学报,2007(01):149-151.”中记载：在各种酯类物质中霍霍巴油对产酶有明显促进作用，其他酯类物质普遍对产酶有抑制。脂肪醇、脂肪酸和烃类物质对产酶没有明显促进作用.对照实验的培养基中没有外加碳源，只含有脱脂豆粕和无机盐，酶活也达到较高水平；[1]李琦.甘油单-二酰酯脂肪酶基因的克隆和表达[D].北京化工大学,2005.中存在随着甲醇含量的增加导致性能减少的情况。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。