一种治疗大黄鱼盾纤毛虫病的中西医组合药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种治疗大黄鱼盾纤毛虫病的中西医组合药物及其制备方法。

背景技术

大黄鱼(Larimichthys crocea)属于石首鱼科鱼类，是中国的四大海产鱼之一。2020年中国大黄鱼产量约30万吨，主要分布于我国东南沿海，曾因产量巨大，肉质鲜美、经济价值高而遭到滥捕，使其资源生物量急速衰退。近些年随着人工海水场养殖技术的不断提高，大黄鱼养殖规模不断扩大，取得巨大的经济效益。随着养殖密度的增大，多种病虫害疾病严重威胁着大黄鱼的养殖收成，其中以大黄鱼盾纤毛虫病最为突出。这是一种以寄生性盾纤毛虫吞食大黄鱼体的细胞以及残破组织，并在细胞内生长、繁殖，使鱼体发黑、出现不均匀的白斑，鳃组织变苍白并分泌有虫体的黏液为主要特征的寄生危害性疾病。

盾纤毛虫(Scuticociliatid ciliates)病是较为常见的一种寄生虫病，养殖过程中，会经常出现大黄鱼体表充血溃烂引起死亡的现象，引起苗种及商品鱼的大量死亡，死亡率高达70％，给养殖业带来巨大的经济损失。盾纤毛虫在生态学中被分类为小型浮游动物，小型浮游动物在海水生态系统占据了重要的地位，在海水中的食物网内占据了多个营养级，包含了植食性、腐食性等多种食性。小型浮游动物是海洋生态系统中难以分割的一部分，小型浮游动物在全世界任何海洋生态体系内都广泛的存在。其作为海洋生态系统的一部分，在大黄鱼的近海网箱养殖中也起到了重要的作用。使用消毒剂进行灭杀时，不仅仅只是对于盾纤毛虫具有灭杀效果，其他作为生产者和分解者的小型浮游生物同样会受到影响。单纯地使用消毒剂进行盾纤毛虫病的治疗工作将会造成养殖水体环境中浮游生物数量大幅度变化，容易对渔业生产造成不利的影响。

盾纤毛虫全身披有纤毛，呈水滴形，行动灵敏。能从体表伤口进入鱼体内，在鱼的血液、组织及内脏器官中进行大量繁殖，在死鱼身上也可大量繁殖。盾纤毛虫能深入鱼体腹腔、血液循环系统，从而加剧防治难度而位于当前大黄鱼病害前列。盾纤毛虫病爆发性强，危害性大，一旦发生将损失巨大。当前对于大黄鱼盾纤毛虫病多以预防为主，以减少鱼苗在运输、培育和转移过程中感染为目标；治疗方案多以化学杀虫剂和消毒剂为主，但由于这些药物对于鱼体的副作用和刺激性很强，目前还没有发现更好的治疗方法，因为盾纤毛虫不仅可能寄生在患病生物的体表，还可能侵入到其体内包括脑部在内的其他组织器官，一旦病原体到达了脑部，化学的治疗和药物很难在临床上奏效。

因此，亟需开发出效果好、残留低的无公害药物防治大黄鱼盾纤毛虫病，解决养殖大黄鱼大量死亡的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种治疗大黄鱼盾纤毛虫病的中西医组合药物及其制备方法，解决上述背景技术中的问题。

一种治疗大黄鱼盾纤毛虫病的组合物，由以下组分按重量份数混合配制而成：柴胡1.2～39.2mg/mL、五倍子0.6～19.2mg/mL、磺胺甲硝唑0.64～2.56mg/mL、土霉素41.84～82.96mg/mL、一元二氧化氯0.002～0.0064mg/mL。

优选地，柴胡4.8mg/mL、五倍子19.2mg/mL、磺胺甲硝唑1.28mg/mL、土霉素82.96mg/mL、一元二氧化氯0.004mg/mL。

一种治疗大黄鱼盾纤毛虫病的组合物的制备方法，按如下步骤进行：

S1.按重量分别称取柴胡、五倍子，剪碎成不均匀的小块，分别放入粉碎机中研磨成粉：

S2.将步骤S1研磨的中药粉，分别浸泡30min～60min后，煮至浓稠；

S3.将步骤S2中煮好的中药液分别放在离心机中，转速至8000～12000r/min，离心8～15min后，取出上清液备用：

S4.将步骤S3所述的柴胡、五倍子中药上清液与磺胺甲硝唑、土霉素、一元二氧化氯搅拌成混合液。

各组分的药物特性如下：

柴胡：气味苦、平，无毒。主心腹肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新。久服轻身、明目、益精。清虚热中药，用于感冒发热、寒热往来、疟疾、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱落、月经不调。

五倍子：味辛、酸，气平，无毒。入肾经。疗齿宣疳，及小儿面鼻疳疮，治风癣痒疮，并治大人五痔下血。洗目消赤肿，止疼痛。染须髭变黑。专为收敛之剂，又禁泻痢肠虚，解消渴，生津，却顽疼，去热。

磺胺甲硝唑：是一种广谱抗生素。对大多数革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都有抑制作用。主要用于敏感菌引起的尿路感染、呼吸系统感染、肠道感染、胆道感染及局部软组织或创面感染等。

土霉素：属于四环素类，可用于治疗立克次体病，包括流行性斑疹伤寒、地方性斑疹伤寒、落基山热、恙虫病和Q热，支原体属感染和衣原体属感染等疾病。

一元二氧化氯：是一种消毒剂，具有广泛的杀灭各种病菌的作用。

本发明的有益效果如下：

柴胡具有抗炎、抑制中枢神经、止痛、杀菌和抗病毒的的药理性，是水产抗细菌药的重要药材之一。五倍子具有抗菌抗炎和解毒，在水产病防治中主要用于防治细菌病和溃疡等。本发明中柴胡、五倍子与抗生素类药物联用有一定的协同作用，可弥补中草药和抗菌素分别使用的不足，西药主治祛除病邪、消除病因，中草药主要提高机体的抗病能力。本发明用于治疗大黄鱼的盾纤毛虫中西医药物组合物，不但能以较低的给药浓度减小鱼体的刺激及不良反应，减少大黄鱼因这些因素而减产损失，还能降低用药成本和残留，提升给药的疗效，同时能够提高养殖经济效益。中西药联合的治疗方法不仅综合了化学杀虫剂快速高效的优点，还包含了中药复方制剂毒性小、高效和便宜的特点，能够为大黄鱼盾纤毛虫病的治疗方法提供新思路和新尝试。

附图说明

图1为显微镜下的盾纤毛虫图。

图2为充分繁殖后显微镜下的盾纤毛虫图。

图3为显微镜下空白对照组的盾纤毛虫图。

图4为显微镜下药物处理2h后的盾纤毛虫图。

图5为柴胡处理组存活与活跃虫体数图。

图6为磺胺甲硝唑处理组存活与活跃虫体数图。

图7为土霉素处理组存活与活跃虫体数图。

图8为五倍子处理组存活与活跃虫体数图。

图9为一元二氧化氯处理组存活与活跃虫体数图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1病鱼准备以及盾纤毛虫的分离培养

病鱼来源

患病大黄鱼活体样品由福建省宁德市大黄鱼鱼场提供，200尾大黄鱼活体通过套袋打氧的方式运送至集美大学水产繁育基地，50尾患病濒临死亡的患典型盾纤毛虫病大黄鱼鱼苗用碎冰覆盖低温保鲜快递至集美大学水产学院水生动物实验室进行检查。实验过程同时还采集了宁德养殖海水大黄鱼海水样本。

病鱼的观察

从水体样本之中和大黄鱼体表取细菌样本进行培养，确定致病菌，预备进行药敏试验，筛选致病菌或寄生虫。病鱼的症状为部分体表完好，而部分大黄鱼眼睛周围、鳍条及体表溃疡，眼睛白浊，鳃盖、臀鰭、腹鳍以及肝脏出现充血；鳃丝轻微溃烂、肿大；部分鱼体出现腹腔内积水，肠中有大量脓性黏液的病变。将取来的染病大黄鱼解剖后，用显微镜观察，虫体数量较多的鱼体组织部位放置于煮沸过滤海水滴加煮沸鱼肉汁的培养液之中，培养2～3d。染病的大黄鱼在鱼缸里培养，用于检测实验药物对于大黄鱼的毒性。

培养完毕后根据虫体的形态、数量等特征筛选最佳的备用(显微镜下的盾纤毛虫如图1所示)。

盾纤毛虫的培养

筛选到的盾纤毛虫培养一段时间后进行离心，取高浓度虫液进行接种。因厦门水质难以养活大黄鱼，所以我们用石斑鱼苗代替大黄鱼苗。将虫液加入到石斑鱼鱼苗养殖池中，同时提升饲料投喂量，使水质浑浊，有机物含量提升，易于盾纤毛虫寄生。在确定盾纤毛虫寄生后再养2～3d，使盾纤毛虫充分繁殖，充分繁殖后显微镜下的盾纤毛虫如图2所示。

实施例2防治盾纤毛虫病药物制备及效果评价

一、实验方法

各药物按浓度梯度对盾纤毛虫进行浸泡，观察盾纤毛虫的存活情况。五倍子的使用浓度分别为0.6mg/mL、1.2mg/mL、2.4mg/mL、4.8mg/mL、9.6mg/mL、19.2mg/mL。柴胡的使用浓度分别为1.2mg/mL、2.4mg/mL、4.8mg/mL、9.6mg/mL、19.2mg/ML、39.2mg/mL。一元二氧化氯(8％)的使用浓度分别为0.002mg/mL、0.004mg/mL、0.008mg/mL、0.0016mg/mL、0.0032mg/mL、0.0064mg/mL。土霉素的使用浓度分别为10.46mg/mL、20.92mg/mL、41.84mg/mL、82.96mg/mL、165.92mg/mL、331.84mg/mL。磺胺甲硝唑的使用浓度分别为0.64mg/mL、1.28mg/mL、2.56mg/mL、5.12mg/mL、10.24mg/mL、20.48mg/mL。

1.样品的采集与制备

(1)采集：取染病的石斑鱼若干、水体和鱼体身上的纤毛虫样本、池水水体样本

(2)培养：在煮沸过滤后的滴加煮沸鱼肉汁的培养液中加入盾纤毛虫，培养2～3天。具体操作为：在100mL煮沸灭菌后的海水中加入1g大黄鱼碎肉，加入蒸馏水至盐度与原来一致，冷却过滤装于200mL锥形瓶中作为液体培养基。然后取患病鱼体表粘液约0.1g，加至盾纤毛虫液态培养基内，在20℃的恒温培养箱内下培养24h。

(3)将选择的治疗盾纤毛虫的五种药物制备好后，将每种药物按从最小有效量到半数致死量分成六个浓度梯度，每个浓度梯度做三次试验。并额外设置一个空白对照组，每次加入的虫体液和对应的药物要等量。将培养过24h的盾纤毛虫培养基取出搅匀，取上层液体在孔板上滴加21个孔，每个孔加入1mL液体培养基。先在显微镜下观察空白对照组，使用血细胞计数板观察一个4×4方格内的盾纤毛虫数，并拍摄视频方便留做完成后计数，所得的数据为空白对照数据。然后在六组梯度浓度组内，分别加入配置好浓度的药品，在20℃下等待2h后观察。对于每一组的每个平行样都使用血细胞计数板观察总个体数、死亡个体数、活跃虫体数。

实验完成后，把拍摄的实验结果视频进行计数，统计对照组虫体数、对照组活跃虫体数、药品组活跃虫体数、药品组存活虫体数、药品组死亡虫体数，并取三个平行样的平均值。

2.中草药剂的制备

①中草药粉的制备：将试验用的中草药剪碎成不均匀的小块，缓慢地放入粉碎机中，将剪碎后获得的药品和实验用中草药磨成粉。将获得的药品放入一个密封袋，进行包装和编号(MD1-12)，放置于实验室室温干燥避光处保存备用。②中草药提取液：每种药物(MD1-12)称取10g于锥形瓶中，量取100mL的纯水，加入到锥形瓶中，浸泡30min后，微煮至浓稠，水分通过蒸发水平下降至100mL刻度线，将已测量好的实验用中草药负载平衡置于离心管中，分别放在离心机中，转速至8000r/min，离心8min后，取出上清液，分别置于试管中，放入四个低温冰箱密封保存，以备以后使用。

3.药物浓度梯度设计

实验的各药物均设置有六个浓度梯度，每种药物调配浓度时均使用灭菌海水调配以保持盐度不变，中药药材于药店购买已研磨成粉的粉剂用灭菌海水调配浓度。

4.体外药物试验

盾纤毛虫培养基在培育24h后，取出搅拌均匀，用移液枪取上层液体，在孔板上滴孔，共分为7组，分别为6种药物以及空白对照组，每组3个平行样本，共计滴加21个孔，每个孔加入1mL液体培养基。

在显微镜下使用血细胞计数板观察空白对照组，观察一个4x4方格内的盾纤毛虫数(结果如图3所示)。在五种药品组内，加入使用灭菌海水稀释配置好的药品，使得培养液内药品浓度达到预设浓度且保持盐度不变，在20℃室温下静置2h之后再观察。对于每一组的每个平行样本，都使用血细胞计数板观察总个体数、死亡个体数、被抑制个体数，并且拍摄视频留作试验完成后计数(结果如图4所示)。

实验完成后，通过拍摄的实验结果视频，统计对照组虫体数、对照组活跃虫体数、药品组活跃虫体数、药品组抑制虫体数、药品组死亡虫体数，并取三个平行样的平均值，制成图表。

5.计数方法

本次实验数据统计采用显微镜直接计数法。加样前，清洗镜检确定计数板无污物和菌体后，用电吹风吹千或用速纸、卫生纸轻轻擦干后加样计数。将计数板消毒擦拭干净，盖上盖玻片，用移液枪将制好的悬液沿盖玻片边缘仔细加样以便菌液沿缝隙自由渗入计数室。先用低倍物镜找到计数板的位置，左右调整，既确保计数板在视野中央又能保证看清菌体(或虫体)，然后转换高倍物镜，接着进行计数。最后，根据公式进行计算：

25×16的计数板：

细胞数/mL＝(80小格的细胞数/80)

×400×1000×稀释倍数

16×25的计数板：

细胞数/mL＝(100小格内的细胞数/100)

×400×1000×稀释倍数

6.评价指标

二、实验结果

1.柴胡对盾纤毛虫的防治效果

由图5可知，当浓度为1.2mg/mL时存活虫数数量和活跃虫数都较高。实验浓度为1.2mg/mL到实验浓度为2.4mg/mL之间存活虫数和活跃虫数量呈下降趋势且显著减少。当实验浓度为2.4mg/mL、4.8mg/mL时存活虫体数呈下降趋势但减少量较少，相比浓度为1.2mg/mL到2.4mg/mL之间变化不大，实验为4.8mg/mL存活虫数和活跃虫数都降到最小。自浓度增加到4.8mg/mL之后继续按浓度梯度增加，总体存活虫数和活跃虫数呈上升趋势。由图可知，柴胡对盾纤毛虫有一定杀灭作用且随着柴胡添加浓度的增加存活虫数和活跃虫数量呈先降低后升高的趋势，同时说明当浓度为4.8mg/mL时的杀灭虫体效果最好。

2.磺胺甲硝唑对盾纤毛虫的防治效果

由图6可知，和对照组相比，当实验浓度为0.64mg/mL到实验浓度为1.28mg/mL之间存活虫数和活跃虫数量呈下降趋势且显著减少。当实验浓度为1.28mg/mL、2.56mg/mL、5.12mg/mL时存活数总体呈上升趋势且增加量显著，当浓度为5.12mg/mL之后总体存活虫数和活跃虫数呈上升趋势，实验浓度为1.2mg/mL时存活虫数和活跃虫数都降到最小。由图6可知，磺胺甲硝唑对盾纤毛虫有一定杀灭作用且随着添加浓度的增加呈先降低后升高再降低的趋势，同时说明当浓度为1.28mg/mL时的杀灭虫体效果最好。

3.土霉素对盾纤毛虫的防治效果

由图7知，实验浓度从10.46mg/mL到41.84mg/mL存活虫数和活跃虫数呈下降趋势且变化显著。和对照组相比存活虫数和活跃虫数之间的差距也越来越小，实验浓度从82.96mg/mL开始存活虫数和活跃虫数都降为0。由此可知，土霉素对盾纤毛虫有一定杀灭作用且随着添加浓度的增加呈总体下降的趋势，同时说明当浓度为82.96mg/mL时的杀灭虫体效果最好。

4.五倍子对盾纤毛虫的防治效果

由图8可知，从总体实验数据来看，存活虫数和活跃都呈波动性，相比对照组有所减少。从浓度为0.6mg/mL到浓度1.2mg/mL呈下降趋势，浓度为2.4mg/mL时存活虫数和活跃虫数都有所下降且活跃虫数降为最小值。实验浓度从2.4mg/mL以后呈现先上升后下降的趋势。活跃虫数在浓度为9.6mg/mL时降为0，存活虫数在实验浓度为19.2mg/mL之后降为0。由此可知，五倍子对盾纤毛虫有一定杀灭作用且随着添加浓度的增加呈先下降后增加再下降的趋势，同时说明当浓度为2.4mg/mL时的杀灭虫体效果最好。

5.一元二氧化氯对盾纤毛虫的防治效果

由图9可知，从总体来看实验浓度从0.002mg/mL到实验浓度为0.0064mg/mL时，存活虫数和活跃虫数呈波动性。当浓度从0.002mg/mL到实验浓度0.004mg/mL时呈下降趋势且在0.004mg/mL达到最小值。实验浓度从0.004mg/mL到浓度0.008mg/mL又呈上升趋势，从添加浓度为0.0084mg/mL之后，存活虫体数量波动较大，第四次实验达到最高值，之后又呈下降趋势。说明当浓度为0.004mg/mL杀灭效果最好，活虫虫数和活跃虫数都最少。

综上，本发明用于治疗大黄鱼的盾纤毛虫中西医药物组合物，不但能以较低的给药浓度减小鱼体的刺激及不良反应，减少大黄鱼因这些因素而减产损失，还能降低用药成本和残留，提升给药的疗效，同时能够提高养殖经济效益。中西药联合的治疗方法不仅综合了化学杀虫剂快速高效的优点，还包含了中药复方制剂毒性小、高效和便宜的特点，能够为大黄鱼盾纤毛虫病的治疗方法提供新思路和新尝试。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。