PIK3CA突变伴随5-LOX高表达作为Luminal型乳腺癌预后标志物的应用

技术领域

本申请涉及肿瘤预后标志物领域，特别涉及一种PIK3CA突变伴随5-LOX高表达作为Luminal型乳腺癌预后标志物的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全球女性癌症第一位，死亡率居全球女性癌症死因第二位，是威胁女性身心健康最主要的恶性肿瘤。乳腺作为人体重要的激素靶向器官之一，其发生恶性肿瘤中70％以上为激素依赖性，具有表达雌激素受体(Estrogen receptor,ER)和/或孕激素受体(Progesterone receptor,PR)的特征，称为Luminal型乳腺癌。该类型乳腺癌对雌激素抑制治疗较为敏感，具有内分泌治疗指征，但是近50％以上患者会出现内分泌耐药，且一旦复发转移，进展迅速，缺乏有效的治疗手段。近年来随着生物学及分子生物理论和技术的发展，现已认识到基因突变在乳腺癌发生、发展过程中发挥了非常重要的作用。一般来说，肿瘤组织学状态决定了肿瘤的治疗，增加对肿瘤生物学的了解可以增加可用的靶向治疗手段，为患者提供更多的治疗机会。因此，在分子学水平深入研究Luminal型乳腺癌的复杂性，寻找新的治疗策略和治疗靶点是乳腺癌治疗领域的方向。

PIK3CA突变是乳腺癌中最常见的基因突变之一，其在乳腺癌中阳性率大于30％，与乳腺癌的发生发展密切相关。PIK3CA是PI3Ks脂激酶家族的关键成员，其编码的蛋白p110α是PI3Ks的催化亚单位。功能学和遗传学研究显示，PIK3CA基因在许多不同类型的实体肿瘤中均存在突变。绝大多数突变位于其蛋白的螺旋区和激酶区，其中最常见的突变是外显子20上的H1047R和外显子9上的E545K。PIK3CA突变可以导致PI3Ks催化活性的增强，PI3K/AKT通路异常活化，进而导致肿瘤的发生。

越来越多的证据表明，肿瘤细胞内基因改变可以驱动特异性肿瘤微环境的形成。虽然免疫治疗为多种癌症患者提供了临床益处，但绝大多数乳腺癌患者，特别是Luminal型乳腺癌患者，由于其错配修复缺陷和体细胞突变水平较低，以往认为其免疫原性较弱，因此对其肿瘤免疫微环境和免疫治疗的研究报道较少。因此，研究PIK3CA突变肿瘤免疫抑制微环境的形成机制，明确关键靶点，有望提高免疫治疗的疗效。

发明内容

本申请为了解决上述技术问题，提供一种PIK3CA突变伴随5-LOX高表达作为Luminal型乳腺癌预后标志物的应用。

第一方面，本申请提供了一种PIK3CA突变伴随5-LOX高表达作为乳腺癌预后标志物的用途，是采用以下技术方案得以实现的。

一种PIK3CA突变伴随5-LOX高表达作为Luminal型乳腺癌预后标志物的应用。

第二方面，本申请提供了PIK3CA突变伴随5-LOX高表达作为乳腺癌预后标志物的第二种用途，是采用以下技术方案得以实现的。

一种检测PIK3CA突变伴随5-LOX高表达的试剂在制备Luminal型乳腺癌预后评估或预测免疫治疗效果产品中的应用。

进一步的，检测PIK3CA突变选用滚环核酸扩增技术和基因探针；检测5-LOX表达水平选用免疫组化实验染色。

更进一步的，所述基因探针的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第三方面，本申请提供了一种评估Luminal型乳腺癌预后的试剂盒，是采用以下技术方案得以实现的。

一种评估Luminal型乳腺癌预后的试剂盒，包括滚环核酸扩增技术所用试剂、基因探针和免疫组化染色试剂。

第四方面，本申请提供了PIK3CA突变伴随5-LOX高表达作为乳腺癌预后标志物的第三种用途，是采用以下技术方案得以实现的。

一种抑制PI3K信号通路和/或降低5-LOX表达水平的试剂在制备治疗Luminal型乳腺癌产品中的应用。

进一步的，所述试剂选用PI3K抑制剂、LTB4拮抗剂和抗PD-1mAbs中的一种或两种及以上的组合。

更进一步的，所述PI3K抑制剂选用Alpelisib；抗PD-1mAbs选用Pembrolizumab；所述LTB4拮抗剂选用LY255283。

第五方面，本申请提供了一种治疗Luminal型乳腺癌的药物，是采用以下技术方案得以实现的。

一种治疗Luminal型乳腺癌的药物，所述药物包括PI3K抑制剂、LTB4拮抗剂和抗PD-1mAbs中的一种或两种及以上的组合。

本申请具有以下有益效果。

本发明通过细胞实验和动物实验发现PIK3CA突变的Luminal型乳腺癌患者中花生四烯酸代谢通路显著激活，其中LOX途径变化最为显著。5-LOX途径上调和LTB4的分泌导致肿瘤微环境中MDSCs高浸润并影响肿瘤杀伤性T细胞的功能。针对PI3K/5-LOX/LTB4轴的靶向治疗可以逆转抑制性微环境，增强免疫治疗的抗肿瘤活性。本发明PIK3CA突变伴随5-LOX高表达能够作为一个新的肿瘤预后标志物，对PIK3CA突变伴随5-LOX高表达情况的检测可以用以进行Luminal型乳腺癌的早期诊断、分子分型以及预后评估，同时还可能成为一个潜在的治疗靶点，应用于Luminal型乳腺癌的临床治疗。

附图说明

图1是本发明泛癌分析PIK3CA基因突变情况的展示图；

图2是本发明在组织样本中PIK3CA突变与5-LOX表达情况的检测及对预后影响的关系图；

图3是本发明PIK3CA突变与5-LOX表达与免疫微环境中MDSCs浸润水平的关系图；

图4是本发明PIK3CA突变通过PI3K/AKT/STAT3通路激活5-LOX表达的关系图；

图5是本发明5-LOX通过调控LTB4分泌影响MDSCs的招募和免疫抑制功能图；

图6是本发明针对PIK3CA/MDSCs浸润的靶向治疗与免疫治疗协同提高抗肿瘤疗效的效果图；

图7是本发明针对PIK3CA/5-LOX/LTB4轴的靶向治疗有效抑制MDSCs浸润的结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本专利申请进行进一步的说明。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；以下制备例和实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、实验方法

1.TCGA数据库的收集和整理

下载java并安装生信工具盒，下载乳腺癌体细胞突变、DNA拷贝数变异、mRNA和microRNA表达、蛋白质富集和磷酸化蛋白富集数据和临床随访信息。筛选Luminal型乳腺癌患者，提取患者基因突变数据信息，根据PIK3CA基因突变情况将患者分为野生型患者和突变型患者，使用生物信息学工具作图并分析其下游通路变化。

2.cBioPortal数据库的收集和整理

登录网站https://www.cbioportal.org/，cBioPortal的基因数据集(datasets)可以通过使用交互界面获取或下载。选择Luminal型乳腺癌数据集，查询该数据集中PIK3CA突变。将患者分组为突变型和野生型，查看和解读结果，绘制展示图。

3.临床样本收集

本申请收集从2001年1月至2008年12月的140例原发性乳腺癌组织样本(其中Luminal型乳腺癌62例)，这些患者全部为女性，中位年龄为57岁(37-88岁)，同时收集患者性别、年龄、临床分期、肿瘤大小、分子分型、复发转移和总生存期等临床病理指标。

4.RCA-FISH检测PIK3CA突变

将乳腺癌组织样本切片用二甲苯脱石蜡-梯度乙醇处理，最终水化。将切片在沸水中煮沸20分钟，根据组织面积大小加适量的蛋白酶K反应液，37℃反应20分钟。将载玻片浸泡在2×SSC染缸中两次，梯度乙醇脱水，晾干。加限制性内切酶反应液，37℃反应1小时，暴露目的基因附近双链DNA末端。加核酸外切酶反应液，37℃反应40分钟，暴露单链DNA。加目的基因探针结合环化反应液，37℃反应1小时，探针在目的基因处形成闭合环状DNA。将载玻片浸泡在2×SSC染缸中两次，洗掉多余探针，梯度乙醇脱水，晾干。加信号扩增反应液，37℃反应1小时，闭合环状DNA自我复制将目的基因信号放大。加荧光探针反应液，37℃反应15分钟，让荧光探针与大量复制的闭合环状DNA上的重复序列结合。将载玻片浸泡在2×SSC染缸中一次，洗掉多余探针，梯度乙醇脱水，晾干。加含DAPI的抗淬灭封片剂，封片，荧光显微镜下观察荧光信号，并进行后续数据分析PIK3CA突变特征性插入片段的数量。

基因引物序列如下：

PIK3CA

PIK3CA

5.免疫组化

将石蜡组织切片或组织芯片在75℃恒温烤箱烘烤至少2h，之后依次将石蜡切片浸入二甲苯I、二甲苯II和二甲苯III中(30min/次)。将石蜡切片浸入无水乙醇(2次)、95％乙醇(1次)、85％乙醇(1次)、75％乙醇(1次)，每次5分钟。将切片浸在3％浓度的H

免疫组化结果判定：在双盲条件下，由两位病理科医师独立对染色结果进行判定，结果取两位医师评分的平均值。染色强度由弱到强依次评定为：0分无染色、1分浅黄色、2分棕色；肿瘤细胞比例评分依次为：无阳性肿瘤细胞0分、＜10％阳性肿瘤细胞1分、＜50％阳性肿瘤细胞2分、＜75％阳性肿瘤细胞3分、≥75％阳性肿瘤细胞4分。组织切片计算公式为：阳性肿瘤细胞比例×染色强度。对于5-LOX染色，在200×下5个视野计数阳性细胞，计算阳性细胞总数。

6.实时荧光定量PCR

(1)提取总RNA：

收集细胞到1.5ml体积的EP管中，加1ml体积的Trizol裂解液，使用移液枪吹打使细胞重复裂解，然后在冰上静置5min；加入200μl体积的氯仿，使用涡旋振荡器剧烈震动30s，冰上静置5min，然后在4℃条件下离心13000rpm×15min；小心吸取上层无色液体，避免吸取白膜层，将上层透明液体转移到新的无酶EP管中，加入等体积的预冷的异丙醇溶液，轻轻上下颠倒混匀，在冰上静置10min，然后在4℃条件下离心13000rpm×10min；弃去上清，加入1ml体积75％乙醇(使用DEPC水配制)，4℃，7500rpm×5min×3次洗涤RNA沉淀，小心吸出上层液，晾干EP管中的液体；待底部RNA沉淀变无色透明后，使用适量体积的DEPC水溶解，使用分光光度计检测RNA浓度和纯度，纯净的RNA样品A260/A280>2.0且260/230>2.0；

(2)逆转录反应：

配制逆转录反应体系，按照“37℃，15min；85℃，5s；4℃，无限循环”条件设置PCR仪。具体反应体系如下所示：

(3)荧光定量PCR：

1)配制PCR反应体系，具体如下所示：

引物序列

2)荧光定量PCR过程设置如下：

(4)结果分析：

反应结束后确认溶解曲线和扩增曲线，采用2

7.蛋白免疫印迹实验

分别收取2×10

8.ELISA实验

使用包被缓冲液将抗体稀释至浓度为1-10μg/ml，在每个聚苯乙烯板反应孔中加入0.1ml，4℃过夜。次日弃去孔内溶液，私用洗涤剂冲洗3min×3次；每个包被抗体的孔内加0.1ml的将待检测样本，37℃孵育1h；加入稀释好的酶标抗体，37℃孵育1h；在各个反应孔中加入配置好的TMB底物溶液0.1ml，37℃孵育30min；加入终止液0.05ml，使用酶标仪检测450nm的OD值。

9.Transwell实验

在小室的下室中加入体积约为500μl的肿瘤细胞或含外源性刺激因子的完全培养基；在小室上室中加入2×10

10.CFSE实验

使用90μl体积DMSO溶液溶解500μg CFSE冻干粉，得到CFSE原液(10mM)，使用不含血清的空培养基将原液稀释到10μM；使用空培养基将待检测细胞重悬(1×10

11.小鼠移植瘤模型

消化肿瘤细胞混匀重悬成单细胞悬液，使细胞终浓度为1×10

12.统计分析

数据的分析使用统计学工具SPSS22.0软件、R语言4.1.0版本和GraphPadPrism6.0软件。统计描述时，对于服从正态分布连续变量，采用均值和标准差；对于非正态分布连续变量，采用中位数和百分位数；对于两组资料正态分布，使用Student's t检验；两组资料非正态分布，使用轶和检验；多组资料样本，正态分布使用方差分析，非正态分布采用轶和检验。使用Kaplan-Meier分析患者生存预后。两个指标之间的相关性分析使用Pearson相关系数分析。P<0.05被认为结果显著，具有统计学意义。

二、实验结果

1.在前期研究中，通过泛癌分析发现PIK3CA是最常发生体细胞点突变的基因，PIK3CA突变激活率较高的癌症包括乳腺癌、肺鳞癌、结直肠癌和头颈部鳞状细胞癌等(图1A)。从TCGA数据库中下载乳腺癌患者样本的数据，筛选出Luminal型乳腺癌患者697例。瀑布图展示了全部乳腺癌患者及TCGA cohort中常见的突变基因，结果显示，PIK3CA是乳腺癌最常见的突变基因之一(图1B)，在Luminal型乳腺癌中其突变频率更高，约为42％(图1C)。

2.本申请在62例Luminal型乳腺癌组织中，使用滚环核酸扩增技术(Rollingcircle amplification,RCA)和基因探针检测组织样本中PIK3CA突变情况。根据探针发光情况将样本分为野生组和PIK3CA突变组(图2A)。然后使用免疫组化实验在组织样本中染色5-LOX，结果显示PIK3CA突变肿瘤中5-LOX高表达(图2A)。为了进一步探究PIK3CA突变与5-LOX表达之间的关系，结合免疫组化实验和基因探针检测结果，本申请对62例Luminal型乳腺癌组织使用Pearson相关系数，并结合患者的临床病例资料和生存信息进行了统计学分析，发现PIK3CA突变伴随5-LOX高表达患者的生存时间较其他组显著缩短(图2B)。

3.本申请进一步分析了PIK3CA突变情况和5-LOX表达水平与免疫微环境中MDSCs浸润水平的关系。为了探究PIK3CA突变和5-LOX表达与MDSCs浸润之间的关系，本申请使用免疫组化实验对62例Luminal型乳腺癌组织进行了染色和统计(图3A)。结果显示，MDSCs高浸润患者生存期更短(图3A)，并且卡方检验结果表明PIK3CA突变组和5-LOX高表达组中MDSCs存在显著高浸润(图3B-C)。

4.本申请比较了乳腺癌EO771

5.在细胞学水平，使用小干扰RNA阻断EO771

6.为了进一步研究在PIK3CA突变型Luminal型乳腺癌中，阻断PIK3CA/5-LOX通路是否能够发挥抗肿瘤作用，本申请建立PIK3CA突变型异体移植瘤模型后，单独或联合使用了PI3K抑制剂(Alpelisib,20mg/kg/天)、抗PD-1mAbs(Pembrolizumab,10mg/kg/天)和LTB4/BLT2拮抗剂(LY255283,20mg/kg/天)。小动物活体成像结果显示，与对照组、Alpelisib、LY255283或抗PD-1mAbs相比，Alpelisib、LY255283和抗PD-1mAbs的联合给药明显抑制了异种移植的生长(图6A-B)；取肿瘤组织后测量，结果显示联合治疗组的肿瘤质量最小(图6C-D)。其中治疗效果尤其以Alp+LY255283组与Alp+anti-PD-1+LY255283组对比最为明显：Alp+LY255283组(20mg/kg/天)与Alp+anti-PD-1+LY255283组(50mg/kg/天)相比，给药总剂量只多出10mg/kg/天，但最终得到的治疗效果却存在显著差异，第21天Alp+LY255283组成瘤的荧光强度平均为9.6×10

本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。