一种丁酸梭菌的简易培养方法

技术领域

本发明属于微生物培养基及制备工艺技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌的简易培养方法。

背景技术

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是一种梭菌属的厌氧芽孢杆菌，革兰氏阳性，老培养物变成阴性，约0.6-1.2×3.0-7.0μm，周生鞭毛，具运动性，菌体呈直或弯的杆菌，以单、双、短链形态存在，并偶见长丝状，在琼脂平板上形成白色或奶油色的不规则圆形菌落，稍突，表面湿润光滑，不透明，略有酸臭味，常发现于土壤、干酪、自然酸奶动物粪便中，发酵产物包括丁酸、醋酸、和丁醇。

大量研究表明，丁酸梭菌具有耐高温、耐酸、耐胆盐的生物学特性，能较好的进行动物肠道而不被胃酸破坏，并于肠道内定植，有效平衡肠道微生态失调，修复肠道炎症。丁酸梭菌作为添加剂添加至饲料中，还可减少抗生素的用量，提高动物的免疫力和饲料转化率，降低养殖成本，提高经济效益。

丁酸梭菌是一种严格厌氧菌，在培养过程中需要使用多种方法进行驱氧，例如采用充氮驱氧、生物除氧、添加还原剂等方式；现有技术中的各种驱氧方式均存在工艺复杂、操作繁琐、成本高昂的缺陷，寻找一种便捷、经济的培养方式可解决此难题。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种丁酸梭菌的简易培养方法，能够确保丁酸梭菌的无氧培养环境，同时工艺简化、操作方便，成本低廉。

本发明所采用的技术方案为：

一种丁酸梭菌的简易培养方法,包括以下操作步骤，

S01菌株活化：将冷冻保藏的丁酸梭菌冻存管菌种快速解冻后接种到灭菌液体种子培养基中，37℃静置培养8-12h小时，获得活化好的丁酸梭菌种子；

S02种液制备：将活化好的丁酸梭菌种子再次转接到灭菌液体种子培养基中进行扩培，接种量2％，37℃静置培养6-12h小时；

S03发酵培养：将步骤S02中的扩培种液接种到灭菌产孢培养基中，静止培养4h；

待液面有明显汽泡升腾时，再开启搅拌，搅拌培养至少24小时；

取样镜检；

若芽孢生成率≥95％，则结束培养；

获得丁酸梭菌菌液。

进一步地，所述步骤S01和S02中的种子培养基包括以下组分：

牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用10％NaOH溶液调pH至6.8，121℃，灭菌15min，制备固体平板时添加20g/L的琼脂。

进一步地，所述步骤S03中的产孢培养基包括以下组分：

玉米淀粉，大豆蛋白胨，葡萄糖，酵母膏，牛肉膏，FeSO

进一步地，所述步骤S03中的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉30-45g/L，大豆蛋白胨10-15g/L，葡萄糖1-5g/L，酵母膏1-5g/L，牛肉膏1-5g/L，FeSO

优选地，所述步骤S03的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉35g/L，大豆蛋白胨12g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏4g/L，牛肉膏1g/L，FeSO

再进一步地，所述步骤S03中的产孢培养基接种量为3-5％，优选4％。

再进一步地，所述步骤S03中的培养温度33-37℃，优选35℃。

再进一步地，所述步骤S03中的搅拌转速为30-50rpm，优选50rpm。

再进一步地，所述步骤S03中结束培养时pH为5.0-6.0，优选pH5.5。

最后，所述步骤S03中的获得的丁酸梭菌的芽孢数不低于7.0x10

本发明的有益效果为：

本发明的丁酸梭菌的简易培养方法，采用基于玉米淀粉的产孢培养基接种基于牛肉膏和可溶性淀粉的种子培养基，利用产孢培养基必经的灭菌过程完成驱氧，再借助降温过程培养基逐渐变粘稠的特性维持其无氧状态，接种后丁酸梭菌自身产氢气，使发酵罐内形成正压，进而维持培养阶段的厌氧环境，全程无需充氮驱氧，工艺简单，成本低廉。

本发明的丁酸梭菌的简易培养方法，为单批培养，培养过程无需补料、无需调控pH，操作简单，一次性完成。发酵结束后，pH稳定在5-6之间，芽孢数可达7.0x10

附图说明

图1是本发明实施例一的丁酸梭菌的简易培养方法中种子培养基原液示意图；

图2是本发明实施例一的丁酸梭菌的简易培养方法中培养好的种液示意图；

图3是本发明实施例一的丁酸梭菌的简易培养方法中产孢培养基培养液示意图；

图4是本发明实施例一的丁酸梭菌的简易培养方法培养好的丁酸梭菌样液示意图；

图5是本发明实施例一的丁酸梭菌的简易培养方法培养好的种子镜检示意图；

图6是本发明实施例一的丁酸梭菌的简易培养方法最终获得的丁酸梭菌芽孢菌液镜检示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明为了提供一种丁酸梭菌的简易培养方法，整体策划方案为：首先提供一种丁酸梭菌的种子培养基(RCM培养基)和产孢培养基，

具体地，种子培养基由以下组分组合构成：

牛肉膏，蛋白胨，酵母浸粉，葡萄糖，可溶性淀粉，氯化钠，醋酸钠和L-半胱氨酸盐酸盐；

产孢培养基具体由以下组分组合构成：

玉米淀粉，大豆蛋白胨，葡萄糖，酵母膏，FeSO

进一步地，种子培养基成分为：牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用10％的NaOH溶液调pH至6.8，121℃，灭菌15min，制备固体平板时添加20g/L的琼脂。

进一步地，产孢培养基的各组分的配比范围如下：

其次提供一种丁酸梭菌的简易培养方法,包括以下操作步骤，

S01菌株活化：将冷冻保藏的丁酸梭菌冻存管菌种快速解冻后接种到灭菌液体种子培养基中，37℃静置培养8-12h小时，获得活化好的丁酸梭菌种子；

S02种液制备：将活化好的丁酸梭菌种子再次转接到灭菌液体种子培养基中，接种量2％，37℃静置培养6-12h小时；

S03发酵培养：将步骤S02中的种液接种到灭菌产孢培养基中，静止培养4h；

待液面有明显汽泡升腾时，再开启搅拌，搅拌培养至少24小时；

取样镜检；

若芽孢生成率≥95％，则结束培养；

获得丁酸梭菌菌液。

进一步地，步骤S01和S02中的种子培养基包括以下组分：

牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用NaOH(10％)溶液调pH至6.8，121℃灭菌15min，制备固体平板时添加20g/L的琼脂。

进一步地，所述步骤S03中的产孢培养基包括以下组分：

玉米淀粉，大豆蛋白胨，葡萄糖，酵母膏，牛肉膏，FeSO

进一步地，步骤S03中的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉30-45g/L，大豆蛋白胨10-15g/L，葡萄糖1-5g/L，酵母膏1-5g/L，牛肉膏1-5g/L，FeSO

优选地，步骤S03的产孢培养基包括以下组分：玉米淀粉35g/L，大豆蛋白胨12g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏4g/L，牛肉膏1g/L，FeSO

再进一步地，步骤S03中的产孢培养基接种量为3-5％，优选4％。

再进一步地，步骤S03中的培养温度33-37℃，优选35℃。

再进一步地，步骤S03中的搅拌转速为30-50rpm，优选50rpm。

再进一步地，步骤S03中结束培养时pH为5.0-6.0，优选pH5.5。

最后，步骤S03中的获得的丁酸梭菌还要求芽孢数不低于7.0x10

本发明的丁酸梭菌产芽孢培养基及其制作方法，采用基于玉米淀粉的产孢培养基接种基于牛肉膏和可溶性淀粉的种子培养基，质地粘稠，接种后静置培养，通过利用自身粘稠度隔绝空气，降低溶氧，减少溶氧对丁酸梭菌的生长抑制，能够确保丁酸梭菌的无氧培养环境，同时工艺简化、操作方便，成本低廉。

本发明中使用的的丁酸梭菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC目录中的在编菌株，菌株编号CICC 23847。

1、将种子培养基(RCM培养基)121℃灭菌15min，接入活化好的丁酸梭菌菌液，接种量2％，控温37℃，静止培养6-12h小时；

2、将产孢培养基121℃灭菌15min，降温至37℃后接入培养6-12h的种子培养基，控温33-37℃，先静止培养4h，待液面有明显气泡升腾时再开启搅拌，搅拌转速30-50rpm，培养24-40小时左右，待孢子形成率95％以上，pH在5.0-6.0结束发酵；

3、使用以上产孢培养基及简易生产工艺，丁酸梭菌最终芽孢数不低于7x10

4、上述丁酸梭菌芽孢培养液，可用作养殖动物的液态饲料添加剂产品或原料，或用于复配含芽孢杆菌、乳酸菌、或酵母菌的复合饲料添加剂原料，以及制备丁酸梭菌粉剂的原料。

本发明的丁酸梭菌的简易培养方法，利用产孢培养基必经的灭菌过程完成驱氧，再借助降温过程培养基逐渐变粘稠的特性维持其无氧状态，接种后丁酸梭菌自身产氢气，使发酵罐内形成正压，进而维持培养阶段的厌氧环境，全程无需充氮驱氧，工艺简单，成本低廉。

本发明的丁酸梭菌的简易培养方法，为单批培养，培养过程无需补料、无需调控pH，操作简单，一次性完成。发酵结束后，pH稳定在5-6之间，芽孢数可达7.0x10

下面通过实施验证本发明的丁酸梭菌产芽孢培养基及其制备方法。

实施例一：如图1～6所示，提供一种丁酸梭菌简易培养方法，按照质量份计，种子培养基的各组分的配比如下：

按照质量份计，产孢培养基的各组分的配比如下：

玉米淀粉35g/L；

大豆蛋白胨12g/L；

葡萄糖2g/L；

酵母膏4g/L；

牛肉膏1g/L；

FeSO

MgSO4·7H

CaCO315 g/L；

NaOH0.15-0.3g/L，具体用量以调节pH至7.2为准。

丁酸梭菌简易培养方法具体步骤如下：

S01种子培养基(RCM):牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用10％NaOH溶液调pH至6.8，121℃灭菌15min。

S02产孢培养基：

玉米淀粉：35g/L；大豆蛋白胨：12g/L；葡萄糖：2g/L；酵母膏：4g/L；牛肉膏：1g/L；FeSO

S03菌株活化：将冷冻保藏的丁酸梭菌冻存管菌种快速解冻后接种到灭菌液体种子培养基(RCM)中，37℃静置培养8-12h小时。

S04种液制备：将活化好的丁酸梭菌种子再次转接到灭菌液体种子培养基(RCM)中进行二次扩培，接种量2％，37℃静置培养6-12h小时，得到丁酸梭菌种液；

S05发酵培养：将步骤S04中的种液接种到灭菌产孢培养基中，先静止培养4h后,待液面有明显汽泡升腾时，再开启搅拌，搅拌转速50rpm，培养至30小时，培养液最终pH5.5；取样镜检，芽孢生成率达95％以上，结束发酵。

S06取样,70℃水浴10min，用种子培养基固体平板测得芽孢活菌数为7.3x10

实施例二：提供另外一种丁酸梭菌简易培养方法,具体按照以下操作步骤执行：

S01种子培养基(RCM):牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，用10％的NaOH溶液调pH至6.8，121℃，灭菌15min。

S02产孢培养基：玉米淀粉：35g/L；大豆蛋白胨：12g/L；葡萄糖：2g/L；酵母膏：4g/L；牛肉膏：1g/L；FeSO

S03菌株活化：将冷冻保藏的丁酸梭菌冻存管菌种快速解冻后接种到灭菌液体种子培养基(RCM)中，37℃静置培养8-12h小时。

S04种液制备：将活化好的丁酸梭菌种子再次转接到灭菌液体种子培养基(RCM)中进行二次扩培，接种量2％，37℃静置培养6-12h小时，得到丁酸梭菌种液；

S05发酵培养：将步骤S04中的种液接种到灭菌产孢培养基中，先静止培养4h后,待液面有明显汽泡升腾时，再开启搅拌，搅拌转速50rpm,培养至30小时，培养液pH约5.5，取样镜检，芽孢生成率达95％以上，结束发酵。

S06取样,70℃水浴10min,用种子培养基固体平板测得芽孢活菌数为7.5x10

实施例二在上述实施例一的基础上，调整CaCO

上述丁酸梭菌芽孢培养液，可直接用作养殖动物的饲料添加剂产品，可用于复配含芽孢杆菌、乳酸菌、或酵母菌的复合饲料添加剂原料，以主制备丁酸梭菌粉剂的原料。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。