一种自组装CO前药纳米药物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种自组装CO前药纳米药物、制备方法及其应用。

背景技术

脓毒症3.0是新近定义的一种临床综合征，其特征是细菌、病毒、真菌等病原体感染机体导致炎症反应失调，导致生理和器官功能障碍。它每年影响全世界数百万患者，死亡率超过25％，并且仍然是重症监护病房(ICU)死亡的主要原因之一。令人担忧的是40％的脓毒症患者在出院后3个月内再次住院，主要原因是体内残留炎症因子。目前临床治疗仍以对症支持治疗为主，主要依靠抗生素、拮抗剂和支持性护理。这种目标导向的治疗并没有降低危重患者的发病率和死亡率。患者体内复杂、动态、不可控的炎症反应对脓毒症的治疗提出了很大的挑战。

在脓毒症状态下，炎症失调通常由toll样受体(TLRs)的过度激活引发，TLRs可识别多种炎症介质，如脂多糖(LPS)、活性氧(ROS)和游离DNA(cfDNA)，并诱导炎症细胞因子和一氧化氮(NO)的产生和释放。这些循环炎症介质使全身炎症永久化，导致细胞死亡，甚至器官衰竭和死亡。基于这一观点，认为降低ROS水平，清除各种炎症介质，抑制过度活跃的免疫反应是脓毒症治疗的关键。

随着脓毒症的发展，一方面，感染、损伤相关信号等因素触发细胞焦亡，进一步通过质膜破裂释放大量细胞因子，导致细胞死亡，加速脓毒症的发展。另一方面，细胞自噬被抑制，导致炎症反应失调，受损细胞的清除受阻，细胞形态受损，最终影响重要器官的功能。因此，改善脓毒症的另一有效措施是抑制或阻断焦亡和促进自噬，有利于细胞修复和存活，对组织器官损伤有保护作用。面对脓毒症复杂的生理病理状态，迫切需要开发能同时作用于多个靶点的药物治疗，以有效地管理脓毒症。

近年来，气疗在炎症的治疗中引起了广泛的关注。血红素加氧酶-1(HemeOxygenase-1,HO-1)及其催化产物一氧化碳(carbon oxide,CO)是应激状态下细胞重要的内源性保护机制之一，参与调控氧化应激、炎症、自噬、焦亡等病理生理过程，参与器官保护作用。CO作为一种信号分子，在应激和炎症过程中可触发一系列细胞保护机制，例如抗氧化应激、抗炎症、抑制细胞焦亡、促进自噬等内源性防御功能。此外，一氧化碳是一种非自由基基团，不与细胞膜或任何其他分子发生反应，在安全剂量下无副作用，是治疗脓毒症的理想气体分子。然而，由于其固有的化学活性，CO是一种相对稳定的分子。它主要是与具有特定氧化还原状态的金属配位，例如铁、锰、钌、钼，合成CO前体分子药物。然而，这些金属羰基化合物存在水溶性差、易被氧化、体内易降解、半衰期短及重金属生物安全性差等问题。

发明内容

鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种自组装CO前药纳米药物、制备方法及其应用，具有药物稳定较高、水溶性强、药效较好以及可以提高CO药物的溶解性、生物相容性、半衰期等优点。

为了达到上述目的，本发明提供了一种自组装CO前药纳米药物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：在催化剂的作用下，将巯基琥珀酸、乙二醇和聚乙二醇在惰性气氛下发生缩聚反应，生成聚巯基聚酯；

步骤2：将聚巯基聚酯和CO前体溶解在溶剂中，并在惰性气氛、搅拌的情况下，生成不同聚合度的聚羰基化聚酯；

步骤3：聚羰基化聚酯经超声处理后，在去离子水中自组装成稳定的纳米级颗粒，即自组装CO前药纳米药物。

需要说明的是，上述聚羰基化聚酯分子中的聚乙二醇可以增强聚羰基化聚酯分子水溶性，从而使得聚羰基化聚酯分子自组装。

依照本发明的一个方面，在步骤1中，所述缩聚反应的温度为100-120℃，时间为8-12h。

依照本发明的一个方面，在步骤1中，所述催化剂包括对甲苯磺酸和EDTA；所述缩聚反应的产物经溶解、沉淀，得到聚巯基聚酯。

依照本发明的一个方面，在步骤2中，所述CO前体为二壬羰基铁；所述溶剂为四氢呋喃、二甲亚砜、乙醇中的任意一种。

依照本发明的一个方面，在步骤2中，反应温度为50-80℃，反应时间为2-4h；反应结束后，溶液变为棕色，将溶液冷却至-20℃，经沉淀、洗涤、干燥，得到聚羰基化聚酯棕色固体，并将得到的聚羰基化聚酯在-4℃保存。

依照本发明的一个方面，在步骤1和步骤2中，所述惰性气氛为氮气、氦气、氩气中的任意一种。

依照本发明的一个方面，在步骤3中，超声处理的温度为0-4℃，时间为5-10min。

基于同一发明构思，本发明还提供了上述任一制备方法制备得到的自组装CO前药纳米药物。

基于同一发明构思，本发明还提供了上述任一制备方法得到的自组装CO前药纳米药物在制备炎症气疗药物中的应用。

依照本发明的一个方面，所述炎症为脓毒症。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过巯基琥珀酸、乙二醇和聚乙二醇缩聚反应合成聚巯基聚酯，并搭载疏水性的CO前体分子(二壬羰基铁)，再利用亲疏水性相互作用自组装技术形成CO前药纳米药物(Nano CO)。其中，任一聚合度的聚巯基聚酯分子都只能聚合了一个聚乙二醇，该聚乙二醇可以出现在聚巯基聚酯分子的任意位置，由于聚乙二醇具有强亲水性，可以作为良好的增溶剂，溶剂化后产生的氢键网络与周围水分子的氢键网络匹配度良好，因此，可以提高CO药物的溶解性和疏水药物稳定性。PEG药物在体内优异的分散性和稳定性，可以增强体内循环周期，从而提高药物的半衰期，这为开发基于CO的药物提供了更大的灵活性和多功能性。

(2)本发明得到的CO前药纳米药物(Nano CO)与过氧化氢反应释放出CO，且释放速率随着过氧化氢浓度的增加而增加。

(3)本发明得到的CO前药纳米药物(Nano CO)可以有效降低溶液中·OH、·O

(4)本发明得到的CO前药纳米药物(Nano CO)干预的巨噬细胞分泌的NO和TNF-α明显比LPS刺激的巨噬细胞分泌的降低，说明CO药物能够有效的抑制细胞内炎症反应。

(5)经过CO前药纳米药物(Nano CO)的干预之后，LDH的释放量呈现浓度依赖性降低。说明纳米CO药物可以有效抑制细胞过度焦亡。

(6)经过Nano CO治疗之后，小鼠的存活率达到80％，可以提高小鼠的存活率。

附图说明

图1为本发明所述的自组装CO前药纳米药物的合成示意图；

图2为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物的透射电子显微镜图；

图3为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物的紫外吸收光谱；

图4为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物的热重分析图；

图5为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物的释放情况；

图6为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物清除不同ROS的紫外吸收光谱；其中，(a)为CO前药纳米药物清除·OH的紫外吸收光谱；(b)为CO前药纳米药物清除·O

图7为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物激活HO-1过表达的情况；

图8为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物抑制炎症诱导的NO表达的情况；

图9为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物抑制炎症诱导的TNF-α表达的情况；

图10为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物抑制细胞焦亡导致的LDH释放的情况；

图11为本发明实施例1制备得到的CO前药纳米药物治疗脓毒症小鼠的存活率情况。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文所用专业术语和本领域专业技术人员所理解的含义一致；除非特殊说明，本文所涉及的原料、试剂均可从市场购买，或通过公知的方法制得。

为了解决背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种自组装CO前药纳米药物的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：

步骤1：在催化剂的作用下，将巯基琥珀酸、乙二醇和聚乙二醇在惰性气氛下发生缩聚反应，生成聚巯基聚酯；优选的，所述缩聚反应的温度为100-120℃，时间为8-12h；所述催化剂包括对甲苯磺酸和EDTA；优选的，所述缩聚反应的产物经溶解、沉淀，得到聚巯基聚酯；优选的，所述惰性气氛为氮气、氦气、氩气中的任意一种；

需要说明的是，聚巯基聚酯为CO前体药物分子提供靶点。

需要说明的是，缩聚反应的产物的溶解具体为：选择对聚巯基聚酯溶解性好、对反应物或其它副产物溶解性不好的溶剂进行溶解，如丙酮。

需要说明的是，缩聚反应的产物溶解后的沉淀具体为：选择对聚巯基聚酯溶解性差的溶剂进行沉淀，如乙醚。

需要说明的是，PEG具有强亲水性，可以作为良好的增溶剂，溶剂化后产生的氢键网络与周围水分子的氢键网络匹配度良好，可以提高CO药物的溶解性和疏水药物稳定性。PEG药物在体内优异的分散性和稳定性，可以增强体内循环周期，从而提高药物的半衰期。

步骤2：将聚巯基聚酯和CO前体溶解在溶剂中，并在惰性气氛、搅拌的情况下，生成聚羰基化聚酯；优选的，所述CO前体为二壬羰基铁；优选的，所述溶剂为四氢呋喃、二甲亚砜、乙醇中的任意一种；优选的，反应温度为50-80℃，反应时间为2-4h；优选的，反应结束后，溶液变为棕色，将溶液冷却至-20℃，经沉淀、洗涤、干燥，得到聚羰基化聚酯棕色固体，并将得到的聚羰基化聚酯在-4℃保存；优选的，洗涤采用的试剂为乙醚；优选的，所述惰性气氛为氮气、氦气、氩气中的任意一种；

需要说明的是，沉淀具体为：选择对聚羰基化聚酯溶解性差的溶剂进行沉淀，如正己烷。

步骤3：聚羰基化聚酯经超声处理后，在去离子水中自组装成稳定的纳米级颗粒，即自组装CO前药纳米药物。优选的，超声处理的温度为0-4℃，时间为5-10min。

需要说明的是，聚羰基化聚酯在超声处理后，在去离子水中自组装成稳定的纳米级颗粒的原因是：亲疏水相互作用。

下面结合具体的实施例进一步阐述。

实施例1

一种自组装CO前药纳米药物的制备方法：

(1)合成聚巯基聚酯。以42mmol对甲苯磺酸和0.27mmol EDTA为催化剂加入到反应瓶中，再向反应瓶中加入3.3mmol乙二醇、3.3mmol巯基琥珀酸和0.2mmol mPEG-OH(Mn＝4000)，进一步在120℃氮气气氛下反应8h；然后将产物溶于丙酮中，在乙醚中沉淀三次，得到聚巯基聚酯。

(2)合成聚羰基化聚酯。将50mg二壬羰基铁和200mg聚巯基聚酯溶解于50mL四氢呋喃中，在50℃的氮气中搅拌2h。反应结束后，溶液变为棕色，将溶液冷却至-20℃，并加入正己烷得到棕色沉淀。使用乙醚洗涤沉淀并干燥得到聚羰基化聚酯棕色固体。最后，得到的聚羰基化聚酯在-4℃保存。

(3)自组装形成稳定的纳米级颗粒。所得聚羰基化聚酯在0℃超声作用10min后，在去离子水中自组装成CO前药纳米药物。

将上述制得的CO前药纳米药物进行透射电镜分析，其结果如图2所示，由图2可知，纳米级CO药物呈球形、具有良好的分散性、尺寸分布在100-150nm。将上述制得的CO前药纳米药物进行紫外吸收光谱分析，其结果如图3所示，由图3可知，紫外吸收光谱表明聚羰基化聚酯与二壬羰基铁具有相同的紫外特征吸收峰，说明二壬羰基铁成功连接在聚巯基化聚酯上形成聚羰基化聚酯。将上述制得的CO前药纳米药物进行热重分析，其结果分别如图4所示，由图4可知，热重分析图表明CO药物的负载率为15％。

将上述制得的CO前药纳米药物进行释放动力学评价。具体实验方法如下：利用紫外分光光度法测定血红蛋白(Hb)向碳氧血红蛋白(HbCO)的转化，评价PBS中释放的CO。将牛血红蛋白(5.5μM)在PBS中完全溶解，然后在氮气氛围下加入亚硫酸氢钠(1.5mg)还原。在上述4mL溶液中加入5mg/mL NanoCO(50μL)和过氧化氢(20μM，5μM)，每间隔10min检测溶液在375～475nm的吸收光谱。为了消除影响因素，提高准确性，采用分别属于HbCO和Hb的410nm和430nm两条强吸附带定量测定Hb向HbCO的转化。利用以下函数计算Hb-to-HbCO的转化率(x)和与Hb配位的释放CO的浓度，得到其释放速率结果如图5。由图5可知，释放动力学表明Nano CO与过氧化氢反应释放出CO，且释放速率随着过氧化氢浓度的增加而增加。

上式中，A

实施例2

一种自组装CO前药纳米药物的应用：

将实施例1制得的CO前药纳米药物，与不同种类的活性氧探针相互作用，评估CO药物清除活性氧的能力。具体实验方案如下：

清除羟自由基(·OH)能力：10mM FeSO

清除超氧阴离子(·O

清除一氧化氮(NO)能力：100μL SNP(20mM)作为NO供体，与100μL不同浓度的NanoCO混合在200μL PBS溶液(0.2M,pH 7.4)中，在37℃下振荡。反应结束后，采用一氧化氮检测试剂盒测定，测定400～700nm的紫外光谱。

上述实验结果如图6所示：Nano CO可以有效降低溶液中·OH、·O

将实施例1制得的CO前药纳米药物与LPS刺激后的巨噬细胞相互作用，评价其保护细胞的效果。具体实验方案如下：将RAW 264.7细胞接种于96孔板的盖片上，并在生长培养基(37℃,5％CO

将实施例1制得的CO前药纳米药物与LPS刺激后的巨噬细胞相互作用，评价其抑制过度细胞焦亡的能力。具体实验方法如下：

先用LPS(100ng/mL)刺激RAW 264.74h，诱导caspase-11表达，然后加入不同浓度的纳米CO(200、100、50μg/mL)孵育24h，刺激后收集细胞培养上清检测LDH的释放。其结果如图10所示：LPS能够诱导细胞焦亡从而释放出LDH，经过纳米级CO药物的干预之后，LDH的释放量呈现浓度依赖性降低。说明纳米CO药物可以有效抑制细胞过度焦亡。

将实施例1制得的CO前药纳米药物干预LPS诱导脓毒症，评价其治疗脓毒症效果。雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(PBS)、阳性组(LPS)、LPS+PSP组和LPS+Nano CO组(每组20只)。C57BL/6小鼠分别于6和3h腹腔注射PBS、PSP(30mg/kg)或Nano CO(30mg/kg)，然后腹腔注射25mg/kg LPS。连续一周记录小鼠死亡率。其结果如图11所示，脓毒症小鼠的存活仅仅只有30％，经过Nano CO治疗之后，小鼠的存活率达到80％，可以提高小鼠的存活率。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。