增强狂犬病疫苗体液和细胞免疫应答与保护的白细胞介素7/21/23分子新佐剂及应用

技术领域

本发明属于生物技术及生物医疗领域，涉及狂犬病疫苗新型佐剂以及增效剂的研发和应用，具体涉及增强狂犬病疫苗体液和细胞免疫应答与保护的白细胞介素7/21/23分子新佐剂及应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RABV)引起的人畜共患病，能感染神经系统导致人类及恒温动物严重脑炎。

狂犬病病毒是一种非分段的负义单链RNA病毒，属于丽沙病毒属家庭。它的基因组按以下顺序编码五种结构蛋白：核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)(3’-N-P-M-G-L-5’)。完整的狂犬病病毒长度约为200纳米左右，直径70纳米左右，呈子弹型，由囊膜(脂质双分子层外膜与包膜基质蛋白M组成的结构蛋白外壳)与遗传核心(病毒核衣壳与RNA、核蛋白N、磷蛋白P及聚合酶L)组成。G蛋白是病毒粒子表面唯一的蛋白质，诱导产生狂犬病毒中和抗体(VNAs)。

目前，接种狂犬病疫苗仍是现代医学防治狂犬病的最佳手段，因此狂犬病及其预防性制剂的研究对人类健康与农牧业发展具有重要的意义。通常，在疫苗中添加佐剂如传统铝佐剂、皮卡佐剂、各类CpG或油包水佐剂等往往可以增强疫苗的免疫原性，但其提高免疫反应的能力有限，作用时间缓慢，经常会引发注射局部明显的疼痛不适与组织损伤，并且产生中和抗体较迟缓且含量低；对需要快速产生大量中和抗体防止病毒感染靶细胞极为不利。目前急需开拓新的途径研发和应用安全高效的新佐剂，增强对各类传染病疫苗或肿瘤疫苗的免疫应答和免疫保护水平，延长其有效保护期。

细胞因子是由组织或免疫细胞等经过多途径刺激诱导分泌出的一类小分子可溶性蛋白质，具有信号转导作用，在胞间或胞内进行细胞生长、分化或免疫应答调控。细胞因子是动物调节各类免疫细胞、非免疫细胞和各种免疫分子参与机体抗感染防御和免疫保护应答中最重要和最高效的关键分子，调控免疫细胞的免疫识别与激活、免疫应答和免疫效应清除过程，并且主导损伤组织细胞增殖、器官结构的再生和功能修复。细胞因子是动物体内协调保障动物细胞组织与各种器官生物功能安全的导演和卫士。近年来，细胞因子因其高效和安全的协同增强动物机体针对各类病原的免疫应答的效应，开始用于疫苗佐剂被广泛研究，并应用于人和动物的各类疫苗研发和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强狂犬病疫苗体液和细胞免疫应答与保护的白细胞介素7/21/23分子新佐剂及应用。

本发明提供了一种组合物，包括人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23。具体的，所述组合物由人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23组成。

具体的，所述组合物中，人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23的质量配比依次为：0.1-1：0.1-1：0.1-1。

具体的，所述组合物中，人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23的质量配比依次为：0.3-1：0.3-1：0.3-1。

具体的，所述组合物中，人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23的质量配比依次为：0.3：0.3：0.3。

所述组合物的用途为适配于人狂犬病疫苗的疫苗佐剂或者适配于人狂犬病疫苗的增效剂。

本发明还保护以上任一所述组合物在制备产品中的应用；

所述产品为如下(a)或(b)或(c)：

(a)适配于人狂犬病疫苗的疫苗佐剂；

(b)适配于人狂犬病疫苗的增效剂；

(c)复合型人狂犬病疫苗。

本发明还保护以上任一所述组合物的应用；所述应用为如下(d)或(e)：

(d)作为适配于人狂犬病疫苗的疫苗佐剂；

(e)作为适配于人狂犬病疫苗的增效剂。

本发明还保护以上任一所述组合物和人狂犬病疫苗在制备复合型人狂犬病疫苗中的应用。在复合型人狂犬病疫苗中，所述组合物发挥增效功能。

本发明还保护白细胞介素在制备产品中的应用；

所述产品为如下(a)或(b)或(c)：

(a)适配于人狂犬病疫苗的疫苗佐剂；

(b)适配于人狂犬病疫苗的增效剂；

(c)复合型人狂犬病疫苗；

所述白细胞介素为人白细胞介素7或人白细胞介素21或人白细胞介素23。

本发明还保护白细胞介素的应用；所述应用为如下(d)或(e)：

(d)作为适配于人狂犬病疫苗的疫苗佐剂；

(e)作为适配于人狂犬病疫苗的增效剂；

所述白细胞介素为人白细胞介素7或人白细胞介素21或人白细胞介素23。

本发明还保护白细胞介素和人狂犬病疫苗在制备复合型人狂犬病疫苗中的应用；

所述白细胞介素为人白细胞介素7或人白细胞介素21或人白细胞介素23。

在复合型人狂犬病疫苗中，所述白细胞介素发挥增效功能。

本发明还提供了一种复合型人狂犬病疫苗，为如下(f)或(g)：

(f)其包括人狂犬病疫苗和白细胞介素；所述白细胞介素为人白细胞介素7或人白细胞介素21或人白细胞介素23；

(g)其包括人狂犬病疫苗和以上任一所述的组合物。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗由人狂犬病疫苗和白细胞介素组成。具体的，所述复合人狂犬病疫苗由人狂犬病疫苗、白细胞介素和溶剂组成。具体的，所述溶剂可为灭菌水、灭菌生理盐水或灭菌缓冲液等。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗中，人狂犬病疫苗和白细胞介素的配比依次为：7IU：0.1-1μg。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗中，人狂犬病疫苗和白细胞介素的配比依次为：7IU：0.3-1μg。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗中，人狂犬病疫苗和白细胞介素的配比依次为：7IU：0.3μg。

所述白细胞介素与人狂犬病疫苗混合后使用，肌肉或皮下等方式注射接种动物。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗由人狂犬病疫苗和所述组合物组成。具体的，所述复合人狂犬病疫苗由人狂犬病疫苗、所述组合物和溶剂组成。具体的，所述溶剂可为灭菌水、灭菌生理盐水或灭菌缓冲液等。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗中，人狂犬病疫苗、人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23的配比依次为：7IU：0.1-1μg：0.1-1μg：0.1-1μg。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗中，人狂犬病疫苗、人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23的配比依次为：7IU：0.3-1μg：0.3-1μg：0.3-1μg。

具体的，所述复合型人狂犬病疫苗中，人狂犬病疫苗、人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23的配比依次为：7IU：0.3μg：0.3μg：0.3μg。

所述组合物与人狂犬病疫苗混合后使用，肌肉或皮下等方式注射接种动物。

具体的，以上任一所述人狂犬病疫苗可为冻干人用狂犬病疫苗。

具体的，以上任一所述人狂犬病疫苗可为冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)。

具体的，以上任一所述人狂犬病疫苗可为成都康华生物制品股份有限公司的冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)

与单独接种疫苗相比，接种复合型疫苗能显著提高动物更早产生高水平的中和抗体滴度，达到保护动物免受狂犬病病毒感染的水平(0.5IU/ml)，并且高水平抗体滴度维持较对照组更长时期。与单独接种疫苗相比，接种复合型疫苗能明显促进动物产生更多的血液特异性Tc、Th、T

本发明对人白细胞介素7、人白细胞介素21和人白细胞介素23作为狂犬病疫苗佐剂的免疫增强作用进行了验证，并获得了有效的细胞因子组合及其剂量，实现了协同增强狂犬病疫苗的免疫应答水平，有利于更好的缩短狂犬病疫苗接种的免疫保护启动时间、提高和维持高水平的免疫保护力及保护期。这些新的狂犬病疫苗佐剂分子体内接种局部未出现无任何炎症损伤和病变，证明它们安全无毒副作用，可作为狂犬病疫苗安全可靠的新型高效免疫佐剂，尤其适宜更早更快和更持久的激发抗狂犬病病毒的特异性体液和细胞免疫保护。

附图说明

图1为小鼠的体重变化的结果图。

图2为小鼠血浆中狂犬病中和抗体的检测结果图。

图3为小鼠血浆样本中狂犬病毒特异性IgG的检测结果图。

图4为小鼠血浆样本中狂犬病毒特异性IgG1的检测结果图。

图5为小鼠血浆样本中狂犬病毒特异性IgG2a的检测结果图。

图6为小鼠外周血特异免疫T细胞活性亚群数量的变化(Tc)。

图7为小鼠外周血特异免疫T细胞活性亚群数量的变化(Th)。

图8为小鼠外周血特异免疫T细胞活性亚群数量的变化(T

图9为小鼠外周血特异免疫T细胞活性亚群数量的变化(T

图10为小鼠外周血特异免疫T细胞活性亚群数量的变化(Treg)。

图11为小鼠外周血特异免疫B细胞活性亚群数量的变化(PC)。

图12为小鼠外周血特异免疫B细胞活性亚群数量的变化(B

图13为小鼠外周血特异免疫B细胞活性亚群数量的变化(B

图14为小鼠外周血特异免疫B细胞活性亚群数量的变化(B

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。数据分析：采用GraphPad Prism 7.0软件统计分析本实验数据，采取Oneway ANOVA的Tukey’s开展多重比较分析检验；P<0.05为差异显著阈值，表示数据之间具有显著性差异；P>0.05,则没有统计学差异。

冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)

实施例

一、小鼠免疫

50只昆明小鼠(雌性、6周龄、体重23-25克)，随机分为5组，每组10只，分别处理如下：

C1组：分别于试验第1天和试验第15天进行两次腹腔注射接种，每次每只小鼠接种0.5ml冻干人用狂犬病疫苗液态制剂；

T1组：分别于试验第1天和试验第15天进行两次腹腔注射接种，每次每只小鼠接种1份复合疫苗甲(由0.5ml冻干人用狂犬病疫苗液态制剂和0.3μg重组人IL-7混合得到)；

T2组：分别于试验第1天和试验第15天进行两次腹腔注射接种，每次每只小鼠接种1份复合疫苗乙(由0.5ml冻干人用狂犬病疫苗液态制剂和0.3μg重组人IL-21混合得到)；

T3组：分别于试验第1天和试验第15天进行两次腹腔注射接种，每次每只小鼠接种1份复合疫苗丙(由0.5ml冻干人用狂犬病疫苗液态制剂和0.3μg重组人IL-23混合得到)；

A1组：分别于试验第1天和试验第15天进行两次腹腔注射接种，每次每只小鼠接种1份复合疫苗丁(由0.5ml冻干人用狂犬病疫苗液态制剂、0.3μg重组人IL-7、0.3μg重组人IL-21和0.3μg重组人IL-23混合得到)。

二、小鼠重量监测

试验第7天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天，小鼠进行称重。

小鼠的体重变化见图1(D代表天)。各组小鼠体重在各时期差异不显著(P>0.05)，说明疫苗和佐剂联合接种无毒副反应，并不影响小鼠生长发育。

三、小鼠血浆中狂犬病中和抗体的监测

试验第7天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天，小鼠尾静脉取血。试验第49天，小鼠摘眼球采血。取采集的血液，分离获得血浆。阳性对照品为犬阳性标准血浆，抗体效价为1.26IU/mL，中国农业科学院长春兽医研究所。阴性对照品为犬阴性血浆，抗体效价为0IU/mL，中国农业科学院长春兽医研究所。所有血浆经56℃灭活处理30min，即为血浆样本。血浆样本为三种，小鼠血浆得到的血浆样本，阳性对照品得到的血浆样本和阴性对照品得到的血浆样本。

检测血浆样本中的狂犬病中和抗体含量，具体步骤如下：

(1)取96孔板，试验孔加入血浆样本稀释液(100μl/孔)(血浆样本稀释液是将血浆样本与MEM培养液混合得到的，血浆样本分别设置如下稀释度：9倍、15倍、27倍、81倍、243倍、729倍、2187倍和6561倍)，细胞对照孔加入MEM培养液(150μL/孔)，病毒对照孔此时为空孔。9倍稀释度和15倍稀释度的血浆样本稀释液设置1个孔，其余的血浆样本稀释液均设置2个复孔。细胞对照孔设置3个复孔。病毒对照孔设置3个复孔。

(2)取完成步骤(1)的96孔板，试验孔加入CVS-11株病毒液(50μl/孔)，细胞对照孔不进行任何处理，病毒对照孔加入MEM培养液(150μL/孔)和CVS-11株病毒液(50μl/孔)，37℃孵育60min。CVS-11株病毒液的制备方法：取狂犬病病毒CVS-11株，用MEM培养液稀释至300TCID

(3)取完成步骤(2)的96孔板，试验孔加入BHK-21细胞悬液(50μl/孔)，细胞对照孔加入BHK-21细胞悬液(50μl/孔)，病毒对照孔不进行任何处理，置于37℃、5％ CO

(4)完成步骤(3)后，弃除培养上清，加入冷丙酮(50μl/孔)，-20℃固定1h。

(5)完成步骤(4)后，加入荧光抗体工作液(50μl/孔)，37℃孵育1h。荧光抗体工作液：将狂犬病病毒核蛋白荧光抗体用PBS缓冲液稀释至200倍体积。狂犬病病毒核蛋白荧光抗体：FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin(FUJIREBIO Diagnostic,Inc.REF 800-092)。

(6)完成步骤(5)后，在荧光显微镜下观察每个孔。孔内有荧光，细胞即记为感染，为阳性；孔内无荧光，细胞即记为未感染(病毒完全被抗体中和)，为阴性。

小鼠血浆样本中的抗体效价(IU/mL)＝

(10

上述公式中，标准血浆和标准阳性血浆指的都是阳性对照品。

分别计算每种血浆样本的logD50。当该血浆样本的某个稀释度的血浆样本稀释液进行上述步骤后，其所有复孔均为阴性时，该稀释度判断为阴性。公式中，logD50＝(稀释度为阴性的孔数总和/4)×log(稀释梯度)-[log(稀释梯度)]/2+log(稀释度为阴性的最大稀释度)。

结果见图2。T1组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的14天、28天、35天和49天显著高于C1组(P<0.05)。T2组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的14天、21天、28天、35天和42天显著高于C1组(P<0.05)。T3组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的7天和28天显著高于C1组(P<0.05)。A1组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的7天、14天、21天、28天、35天、42天和49天显著高于C1组(P<0.05)。A1组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的7天时高于T1组和T2组(P<0.05)，A1组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的14天时、第21天时和第42天时高于T1组和T3组(P<0.05)，A1组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的28天时和第35天时高于T3组(P<0.05)，A1组小鼠的中和抗体滴度在接种疫苗后的49天时高于T1组、T2组和T3组(P<0.05)。

四、小鼠血浆中狂犬病毒特异性IgG、IgG1、IgG2a含量的监测

试验第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天和第49天，小鼠尾静脉取血，分离获得小鼠血浆。血浆经56℃灭活处理30min，即为血浆样本。

1mg/ml RABV G溶液：含1mg/ml狂犬病毒特异性糖蛋白和150mM NaCl，余量为Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，20mM)。狂犬病毒特异性糖蛋白通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备，然后利用His

分别检测血浆样本中狂犬病毒特异性IgG、IgG1和IgG2a的含量，具体步骤如下：

1、取96孔板，加入狂犬病毒糖蛋白稀释液(100μl/孔)，4℃孵育过夜，然后用PBST溶液洗板三次，拍干。狂犬病毒糖蛋白稀释液：取1mg/ml RABV G溶液，用碳酸氢钠缓冲液(pH8.2、100mM)稀释至0.5μg/ml。

2、完成步骤1后，加入封闭液(220μl/孔)，37℃封闭2h，然后用PBST溶液洗板三次，拍干。封闭液：5g/100mL脱脂奶粉水溶液。

3、完成步骤2后，加入血浆样本稀释液(100μl/孔)，37℃孵育2h，然后用PBST溶液洗板三次，拍干。血浆样本稀释液是将血浆样本用PBS缓冲液稀释至30倍体积得到的。

4、完成步骤3后，加入酶标二抗工作液(100μl/孔)，37℃孵育45min，然后用PBST溶液洗板三次，拍干。酶标二抗工作液是将酶标二抗用含5g/100mL脱脂奶粉的PBST溶液稀释至10000倍体积得到的。

检测目标物为IgG时，酶标二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG(abcam，ab6789)。检测目标物为IgG1时，酶标二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG1(abcam，ab97240)。检测目标物为IgG2a时，酶标二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG2a(abcam，ab97245)。

6、完成步骤5后，加入TMB显色液(100μl/孔)，37℃避光显色10min，然后加入终止液(50μl/孔)，采用酶标仪在450nm进行读数。100μl TMB显色液由50μl A液和50μl B液组成，市售产品(索莱宝，北京，PR1210)。终止液：2M硫酸溶液。酶标仪型号为MicrotiterplateReader 680(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。

血浆样本中狂犬病毒特异性IgG含量见图3。T1组、T2组、T3组和A1组小鼠特异IgG含量在接种后21-35天显著高于C1组(P<0.05)。A1组小鼠的特异IgG含量在接种后14天、42天和49天显著高于其它处理组(P<0.05)。

血浆样本中狂犬病毒特异性IgG1含量见图4。T1组和A1组小鼠的特异IgG1含量在接种后14天显著高于C1组(P<0.05)，T1组、T2组、T3组和A1组小鼠的特异IgG1含量在接种后21、35天、49天显著高于C1组(P<0.05)，T2组和A1组小鼠的特异IgG1含量在接种后42天显著高于C1组(P<0.05)，A1组小鼠的特异IgG1含量在接种后14和28天显著高于其它处理组(P<0.05)。

血浆样本中狂犬病毒特异性IgG2a含量见图5。T1组、T2组和T3组小鼠的特异IgG2a含量在接种后7天显著高于C1组(P<0.05)，T1组、T2组、T3组和A1组小鼠的特异IgG2a含量在接种后14天显著高于C1组，A1组小鼠的特异IgG2a含量在接种后21天显著高于C1组、T1组、T2组和T3组(P<0.05)，T1组、T2组和A1组小鼠的特异IgG2a含量在接种后35天显著高于C1组(P<0.05)，T1组、T2组、T3组和A1组小鼠的特异IgG2a含量在接种后49天显著高于C1组。A1组小鼠的特异IgG2a含量在接种21天显著高于其它处理组(P<0.05)。

五、流式细胞术分析小鼠外周血中T和B细胞分化情况

试验第7天和第49天，小鼠尾静脉取血。检测B细胞时，先进行步骤1至4，然后进行步骤5。检测T细胞时，先进行步骤1至4，然后进行步骤6。

1、将150μl血液转移至流式管中，加入3ml红细胞裂解液(SolarBio，R1010)，室温孵育20min。

2、完成步骤1后，4℃、500g离心(升降速9)10min，弃上清，用3ml PBS缓冲液重悬沉淀并洗涤，4℃、500g离心(升降速9)10min，弃上清，用100μl PBS缓冲液细胞重悬沉淀。

3、在步骤2得到的100μl重悬液中加入流式抗体，4℃避光孵育30min。

检测T细胞时，加入的流式抗体为：CD3抗体、CD4抗体、CD8抗体、CD44抗体、CD62L抗体、CD103抗体、CD25抗体和CD69抗体，每种抗体加入量为1μl，总计8μl。

检测B细胞时，加入的流式抗体为：CD19抗体、CD27抗体、CD38抗体和IgD抗体，每种抗体加入量为1μl，总计4μl。

各个抗体的配色方案见表1。

表1流式抗体配色方案

4、完成步骤3后，加入3ml PBS缓冲液进行洗涤，4℃、500g离心(升降速9)10min，弃上清，用100μl PBS缓冲液细胞重悬沉淀。

5、检测B细胞

将100μl步骤4得到的细胞悬液和100μl PBS缓冲液混匀，然后上机分析。

6、检测T细胞

(1)完成步骤4后，加入1ml 1x Fix/Perm固定液(BD，Pharmingen转录因子缓冲液套装，562574)4℃避光孵育40min。

(2)完成步骤(1)后，每管加入1ml 1x Perm/Wash洗涤液洗涤一次，4℃、500g离心(升降速9)10min，弃上清，用100μl PBS缓冲液重悬沉淀。

(3)完成步骤(2)后，加入1μl FOXP3流式抗体，4℃避光孵育30min。

(4)完成步骤(3)后，每管加入2ml 1x Perm/Wash洗涤液洗涤一次，4℃、500g离心(升降速9)10min，弃上清，用200μl PBS缓冲液重悬沉淀，然后上机分析。

上机分析采用BD FACSymphony A5流式细胞仪，分析各类免疫活性细胞的圈门逻辑参见表2。

表2流式细胞术划门逻辑

小鼠外周血特异免疫T细胞活性亚群数量的变化见图6、图7、图8、图9和图10。T1组、T2组、T3组和A1组小鼠血液中的Tc、Th、T

小鼠外周血特异免疫B细胞活性亚群数量的变化见图11、图12、图13和图14。T1组、T2组、T3组和A1组小鼠血液中的浆细胞(Plasma cells、PC)、IgM记忆B细胞(B

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。