一种烟曲霉真菌KLZNF17及其发酵产物与抗菌应用

技术领域

本发明属于微生物次级代谢产物领域，具体涉及一种烟曲霉真菌KLZNF17及其发酵产物与抗菌应用。

背景技术

细菌生物膜(Bacterial biofilm,BBF)，以下简称“生物膜”，是指附着于有生命或无生命物体表面包裹在由细菌自身分泌的细胞外基质中的具有三维组织结构的细菌群体，被认为是造成耐药菌耐药性增强及感染难以治愈的重要原因之一。针对生物膜目前尚无特效药物，寻找满足临床需要的新型抗菌、抗生物膜活性成分成为迫切需要。随着人们对普通环境微生物的反复研究，从该类资源中找到新型抗菌、抗生物膜活性化合物愈发困难。因此，越来越多的研究者开始将抗生素药源研发聚焦于研究相对较少的特殊生态环境(以下简称“特境”)中的微生物，尤其是从特境微生物中发掘抗生素活性成分。目前特境微生物抗生素活性天然药物研究主要集中于海洋生境、红树林湿地以及昆虫肠道等，而高海拔微生物的研究相对较少。滇西北黄芪属植物生长于高寒环境中，其根际微生物更具抗逆性，在进化过程中可能会产生特殊的活性物质。本发明对采集自云南省迪庆藏族自治州香格里拉市南部小中甸镇(海拔3 225m)的中甸黄芪植物根际微生物进行研究，利用宏基因组测序技术与传统微生物纯培养法对中甸黄芪植物根际微生物物种多样性进行探究，并利用HPLC、UPLC-MS对菌株次生代谢产物进行化学多样性筛选，结合“微量肉汤稀释法”、“孔板法”等进行抗菌、抗生物膜活性筛选，获得了一种可生产抗生物膜活性物质的曲霉属真菌。

发明内容

本发明提供一种曲霉属真菌KLZNF17，其特征在于所述曲霉属真菌KLZNF17的菌种保藏信息如下：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年6月30日；保藏编号：CGMCC No.40717；分类命名：烟草色曲霉Aspergillus tabacinus。

本发明的另一实施方案提供一种上述曲霉属真菌KLZNF17的粗提物，其特征在于所述粗提物的制备方法包括如下步骤：

(1)将上述曲霉属真菌KLZNF17接种至PDB培养基中，28℃摇床培养3d得种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液转接到大米培养基中，置于28℃静置培养28-30d得发酵物；

(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，其中发酵液用乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液后减压浓缩、干燥，即得所述粗提物。

步骤(1)中所述摇床培养的转速为150-180r/min；

步骤(2)中种子液的转接量优选10％-12％；

步骤(3)中乙酸乙酯的用量为发酵液体积的1-2倍。

本发明的另一实施方案提供一种上述曲霉属真菌KLZNF17粗提物，其特征在于所述粗提物经HPLC分析，其次级代谢产物在27min至44min出现，HPLC分析条件如下：

高效液相色谱仪：安捷伦Agilent 1260；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(规格5μm，4.6mm×250mm)；色谱条件：流速1.0mL/min，进样量5μL；检测波长：190、210、254和330nm；流动相：水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱程序：0-35min，5％-100％ B；35-40min，100％ B；40-41min，100％-5％ B；41-46min，100％ B。

本发明的另一实施方案提供上述曲霉属真菌KLZNF17的粗提物的制备方法，其特征在于包括本发明所述的任一步骤。

本发明的另一实施方案提供上述曲霉属真菌KLZNF17粗提物作为抗菌药物的应用。所述抗菌药物优选用于治疗革兰氏阳性菌引起的疾病。

本发明的另一实施方案提供上述曲霉属真菌KLZNF17粗提物在制备抗MRSA生物膜活性的药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以上述曲霉属真菌KLZNF17粗提物作为有效成分。所述药物组合物用于治疗革兰氏阳性菌引起的疾病或者用于抗MRSA生物膜。

本发明的另一实施方案提供上述曲霉属真菌KLZNF17在制备抗菌活性粗提物或次级代谢产物中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述曲霉属真菌KLZNF17在制备抗MRSA生物膜活性的粗提物或次级代谢产物中的应用。

本发明涉及的试剂、仪器、微生物培养、发酵、粗提物的制备、分析、活性测试等方法，均为本领域常规实验方法，本领域的技术人员可以合理选择具体的操作方式。例如KLZNF17发酵制备粗提物时，PDB培养基、大米培养基均为本领域常规培养基，可通过商业购买，也可按照已有配方(或适当调整)自行配制。

附图说明

图1是曲霉属真菌KLZNF17菌株图。

图2是实施例1制备的粗提物的HPLC图。

图3是实施例1制备的粗提物的抗MRSA生物膜活性图，图A是CV染色结果图，图B是MTT染色结果图。

图4是KLZNF17次级代谢产物(实施例1制备的粗提物)的抗MRSA生物膜活性潜力分析图。

具体实施方式

实施例1KLZNF17粗提物的制备

(1)将曲霉属真菌KLZNF17(GDMCC No.40717)接种至PDB培养基(购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)中，28℃、150r/min摇床培养3d得种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液转接至大米培养基中(接种量10％)，置于28℃静置培养28d得发酵物；

(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，其中发酵液用1.5倍体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液后减压浓缩、干燥，即得所述粗提物。

实施例2KLZNF17粗提物的HPLC分析

高效液相色谱仪：安捷伦Agilent 1260；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(规格5μm，4.6mm×250mm)；色谱条件：流速1.0mL/min，进样量5μL；检测波长：190、210、254和330nm；流动相：水(A)-甲醇(B)，梯度洗脱程序：0-35min，5％-100％ B；35-40min，100％ B；40-41min，100％-5％ B；41-46min，100％ B。

采用上述HPLC条件，对实施例1制备的粗提物进行分析，以大米空白培养基为对照，结果如图2，KLZNF17的次生代谢产物出现在27min至44min，极性中等偏小。

实施例3抗菌活性测试

供试菌株：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus ATCC 43300,MRSA ATCC 43300)、金黄色葡萄球菌(S.aureusATCC 25923)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis ATCC 12228)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae ATCC 13813)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis NCIB 3610)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC13883)。

抗菌活性检测采用“微量肉汤稀释法”，参考文献[Microbiology China,2022,49(9):3813-3836,微生物学报,2021,61(4):862-874]方法进行，将病原指示菌接种至液体LB培养基中，于37℃、160r/min培养8-12h，将培养好的菌液稀释至5×10

结果表明，实施例1制备的粗提物具有广谱抗菌活性，即对6株革兰阳性受试病原菌及1株革兰阴性菌肺炎克雷伯菌ATCC 13883均表现出中等至较强的抗菌活性(MIC范围为15.00-50.00μg/mL)

实施例4抗生物膜活性

以MRSA生物膜为供试对象，抗生物膜活性测定包括抑制生物膜形成和清除成熟生物膜活性两个方面。具体方法参照文献[Frontiers in Microbiology,2021,12:709826.]进行。

(1)抑制生物膜形成活性筛选：挑取MRSA单菌落置于LB液体培养基中37℃、160r/min培养过夜，将培养好的菌液稀释至约5×10

(2)清除成熟生物膜活性筛选：吸取浓度为5×10

CV染色结果(与剩余的生物膜量有关)显示，实施例1制备的粗提物在在低于其MIC值时即在30μg/mL下对MRSA生物膜生长有明显抑制作用(图3A)但抑膜率低于50％(图4A)

MTT染色结果(与膜内活菌数有关)显示，实施例1制备的粗提物在浓度为150-300μg/mL时同样显示出明显的清除MRSA生物膜活性但无明显的剂量依赖性(图3B和图4B)，且在浓度为100μg/mL下清除率就达到50％以上。

综合上述活性结果发现，KLZNF17的粗提物对MRSA的生物膜抑制活性浓度均在其MIC值以下，这一现象表明这两株菌株发酵液EA粗浸膏发挥抗MRSA生物膜作用并非是通过简单“杀菌”作用来实现的，但其具体作用机制仍需深入研究。