一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和检测领域，具体为一种检测鳜虹彩病毒抗体胶体金试纸条的制备方法及其应用。

背景技术

虹彩病毒最初在昆虫体内发现，后来从爬行动物、鱼类、软体动物、原虫、乃至藻类和植物体内分离到了虹彩病毒。多数虹彩病毒是非致病性的，有些虹彩病毒可引起鱼类的疾病，危害比较大。

鳜鱼是传统的食用鱼类，养殖周期短、经济效益高。虹彩病毒对鳜鱼养殖危害很大，尤其是传染性脾肾坏死病毒ISKNV，会引起鳜鱼爆发性死亡，严重危害鳜鱼养殖产业的发展。感染虹彩病毒的鳜鱼体表症状不明显或者口腔周围、鳃盖、鳍条基部、尾柄处充血。有的病鱼眼球突出，有蛀鳍现象。解剖可见肝脏、脾脏和肾脏肿大，并有出血点，肠壁充血或出血，肠内充满黄色粘稠物。

一般检测鳜虹彩病毒的方法是通过酶联免疫标记、免疫荧光技术、免疫胶体金电镜技术等，对其抗体进行检测。这些方法具有高灵敏度、强特异性，可用于定性或半微量、微量和超微量定量分析。然而，在实际应用中，上述免疫实验需要专业人员进行操作，并且对特异性抗体的要求高，检测仪器设备比较复杂，检测时间长。这些弊端的存在体现了快速简便的临床检测方法开发的必要性和重要性。同时，由于试纸条的样品孔中滴加的样品为鳜鱼的全血样品，如果操作速度慢导致凝血，可能会出现液体不能充分层析到试纸条顶部，从而出现试纸条无效现象。

胶体金免疫层析试验(GICA)使用硝酸纤维素膜(NC)作为载体，胶体金标记的抗原或抗体作为示踪剂。胶体金免疫层析试纸条具有价格低廉、操作简便、检测快捷和特异性强的优点，这种检测已被用于新冠肺炎病毒抗原的诊断。目前，GICA技术已被广泛应用于妊娠检测、病原体抗体和抗原检测、疾病相关的蛋白检测等。GICA技术已经成为目前动物医学快速检测中最快速、敏感的免疫学检测方法之一。该技术中免疫复合物将被截留或富集在检测带上，标记物(胶体金)会呈现直观的显色试验现象。若样品中不含待检测物，则会同游离标记物一起到达质控线。

需要对现有技术加以改进，不用对样品进行处理，实现以全血或血清为样本，快速便捷地检测鳜虹彩病毒，对于水产养殖的病害防控具有重要意义。

发明内容

本发明旨在克服现有技术中的不足，提供一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条。

本发明的另一个目的是提供利用上述试纸条检测鳜虹彩病毒或鳜虹彩病毒抗体的方法。

一种检测鳜虹彩病毒抗体的胶体金侧流免疫试纸条，包括依次重叠的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

样品垫用pH＝7.3-7.5、含0.15％-0.25％ TritionX-100的PBS缓冲液预处理；结合垫用pH＝7.3-7.5、含1.5％-2.5％ Tween-20、4％-6％海藻糖的PBS缓冲液预处理；

结合垫承载胶体金标记的MCP蛋白；

硝酸纤维素膜上设置检测线和质控线，检测线用Protein A标记，质控线用MCP多克隆抗体标记。所述的MCP多克隆抗体为兔源MCP多克隆抗体。

胶体金颗粒的平均粒径为20nm左右，最大吸收峰对应的OD值大于0.8，本发明的一个优选方式中，最大吸收峰对应的OD值大于0.9。

结合垫中，胶体金与MCP蛋白的质量比为50-90：1，优选为50-75，在本发明的一个优选方式中，为55-60：1。

所述胶体金的制备方法为：浓度为0.005wt％-0.015wt％的氯金酸溶液煮沸加入柠檬酸三钠，搅拌并加热至溶液为紫红色，继续加热5-15min。氯金酸与柠檬酸三钠的质量比为1：1-3，优选为1：2。

检测线上的Protein A含量为0.8-1.2μg/cm，优选为1μg/cm。

质控线上的MCP多克隆抗体含量为0.5-0.7μg/cm，优选为0.6μg/cm。

上述胶体金侧流免疫试纸条的制备方法，包括如下步骤：

(1)结合垫和样品垫分别预处理，并在硝酸纤维素膜上划质控线和检测线，经过预处理的结合垫用金标抗原溶液浸润并烘干；

所述结合垫的预处理方法为：将结合垫用pH＝7.3-7.5、含1.5％-2.5％Tween-20、4％-6％海藻糖的PBS缓冲液浸泡并烘干；

所述样品垫的预处理方法为：将样品垫用pH＝7.3-7.5、含0.15％-0.25％TritionX-100的PBS缓冲液浸泡并烘干；

(2)依次组装硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫。

步骤(1)中，用于预处理的PBS缓冲液的浓度为0.005-0.02mol/L。

步骤(1)中，所述的金标抗原溶液制备方法为：

(i)在pH＝8-10的条件下，用胶体金标记MCP蛋白；胶体金与MCP蛋白的质量比为50-90：1；

(ii)加入BSA至终浓度0.8％-1.2％；

(iii)离心后取沉淀用pH＝7.3-7.5、含0.8％-1.2％ BSA和4％-6％海藻糖的PBS缓冲液复溶；PBS缓冲液的浓度为0.005-0.02mol/L。

优选的，步骤(i)中，在pH＝9的条件下，用MCP蛋白标记胶体金。

胶体金与MCP蛋白的质量比优选为50-75，在本发明的一个优选方式中，为55-60：1。

优选的，步骤(ii)中，BSA终浓度为1％。

优选的，步骤(iii)中，用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L、含1％ BSA和5％海藻糖的PBS缓冲液复溶。

优选的，金标抗原溶液中，胶体金的含量为0.4-0.6mg/mL；更优选为0.4-0.5mg/mL。

本发明的一个优选方案，步骤(1)中，所述结合垫的预处理方法为：将结合垫用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L、含1.5％-2.5％ Tween-20、4％-6％海藻糖的PBS缓冲液浸泡并烘干。

本发明的一个优选方案，步骤(1)中，所述样品垫的预处理方法为：将样品垫用pH＝7.4、浓度为0.01mol/L、含0.2％ TritionX-100的PBS缓冲液浸泡并烘干。

上述胶体金侧流免疫试纸条，能够检测水产品全血或血清中的鳜虹彩病毒抗体，可用于制备鳜虹彩病毒检测试剂。可以快速便捷地检测鳜虹彩病毒以及对鱼类IgM抗体水平进行监测。

检测的方法为：将检测样品滴加到样品垫上，并观察检测线和质控线。所述的检测样品为全血或血清。

本发明创造性地将鳜虹彩病毒主衣壳蛋白MCP与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源MCP多克隆抗体作为质控线，并通过选择适合的方法对样品垫、结合垫进行预处理，所获得的胶体金试纸条可以使用全血或血清进行测试，与常见的其它鱼类病毒血清不存在交叉反应，如鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性血清、草鱼呼肠孤病毒阳性血清、大口黑鲈蛙虹彩病毒阳性血清。可通过检测样品中的鳜虹彩病毒抗体，来检测鳜虹彩病毒。试纸条灵敏度高，最低检测限可以检测到1：100稀释的阳性血清抗体，试纸条检测线的深浅程度可以用于初步判断鱼体中的抗体水平，还可能实现定量检测。本发明能够实现以全血或血清为样本，快速便捷地检测鳜虹彩病毒以及监测鱼类IgM抗体水平，对于水产养殖的病害防控具有重要意义，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1所制备的胶体金颗粒电镜图。

图2为实施例4中，引物检测攻毒后的鳜鱼脾肾组织中鳜虹彩病毒基因的电泳图。

图3为实施例2中，不同pH值下胶体金标记MCP蛋白的OD曲线(A)和显色结果(B)。

图4为实施例2中，最适pH值下，不同MCP蛋白标记量胶体金的显色结果。

图5为实施例4中鳜虹彩病毒抗体胶体金试纸条特异性检验结果。

图6为实施例4中鳜虹彩病毒抗体胶体金试纸条灵敏性检验结果。

具体实施方式

实施例1胶体金的制备

将玻璃容器清洗干净，加入100mL浓度为0.01％的氯金酸溶液，置于磁力加热搅拌器上加热搅拌，待溶液彻底煮沸3min后迅速加入1％柠檬酸三钠溶液2mL，搅拌并持续加热，溶液变黑再变紫红色后，继续加热10min待反应完全，待冷却后补充到原体积，此时溶液呈酒红色，透亮无沉淀。胶体金浓度约0.058mg/mL，用分光光度计以及透射电镜进行质量鉴定。

通过透射电镜观察胶体金颗粒，图1所示，胶体金颗粒呈单个分布，形状大小较为均匀，粒径约20nm左右。

通过紫外分光光度计测定，结果显示，胶体金吸光度最大吸收峰波长为520nm，最大吸收峰对应的OD值约为0.920，以上参数说明烧制的胶体金质量良好，可以用于试纸条的制作。

根据回归方程Y＝0.786X+505.53(Y为最大吸收波长，X为粒径大小)可知，胶体金的平均粒径大小约为20nm。

实施例2胶体金抗原溶液的制备

取用0.2mol/L K

用PBS溶液将MCP蛋白分别稀释至0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002mg/ml，将胶体金溶液调节至pH＝9，向3mL胶体金溶液中分别加入0.1mL不同稀释浓度的MCP蛋白，充分混合后静置30min，随即加入0.1mL 10％ NaCl溶液充分混合均匀后，静置2h，如图4所示。并使用分光光度计测定每个稀释浓度在520nm处OD值。

根据分光光度计测定胶体金不同抗原标记量在波长为520nm对应的OD值，结果显示随着抗原标记量的增加OD值随之升高，在达到峰值后，随着抗原标记量的继续增加OD值开始降低，其最大值处对应的MCP蛋白浓度为0.02mg/mL；即体系中含有0.174mg胶体金和0.002mgMCP蛋白。观察颜色变化，加入抗原过少也会导致胶体金溶液产生聚沉变成蓝紫色。考虑成本情况，胶体金溶液均匀无聚沉的最低抗原标记量120％-150％为最适浓度。

取800μL实施例1的胶体金溶液(以Au计0.0464mg)于离心管中，将离心管置于冰上操作，调节至pH＝9，涡旋3min，静置3min；向胶体金溶液中加入1.3-1.4μL的MCP蛋白溶液(0.8μg)，涡旋3min，静置3min；加入200μL5％BSA溶液(1x PBS配制)使BSA终浓度为1％，涡旋3min，静置3min；然后4℃，1500rpm，20min离心；观察无沉淀则效果良好，继续4℃，9900rpm，30min离心；此时胶体金应沉淀于底部，吸除上清，沉淀用100μL的金标蛋白复溶液(含5％海藻糖、1％BSA的0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液)重悬，保存至4℃，为金标抗原溶液。

实施例3试纸条的制备

(1)将结合垫(金标垫)用裁条机切割成9mm的细条，用预处理液(0.01mol/L含2％Tween-20、5％海藻糖的PBS缓冲液，pH＝7.4)浸泡30min，37℃干燥箱烘干1h，收于干燥袋中备用。用实施例2制备好的金标抗原溶液滴加到结合垫上，浸润结合垫，置于37℃干燥箱干燥1h。

将样品垫用裁条机切割成15mm的细条，用预处理液(0.01mol/L含0.2％TritionX-100的PBS缓冲液，pH＝7.4)浸泡30min，37℃干燥箱烘干1h，收于干燥袋中备用。

将吸水纸用裁条机切割成17mm的细条，收于干燥袋中备用，为吸收垫。

用XYZ三维划膜喷金仪对硝酸纤维素膜(NC膜)进行划线，用Protein A溶液在检测线(T)处划线，划线体积为1ul/cm；用兔源MCP多克隆抗体在质控线(C)处划线，划线体积为1ul/cm；置于37℃干燥箱干燥1h。

(2)取PVC底板置于贴条机上，依次组装硝酸纤维素膜、金标垫(结合垫)、样品垫和吸水垫，各部分重叠2mm固定在PVC底板上，将贴好的试纸板用裁条机切成4.2mm宽的试纸条。

步骤(1)中，取硝酸纤维素膜(NC膜)，将兔源MCP多克隆抗体稀释成1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL依次划线，划线体积为1ul/cm，组装成试纸条，检测阴性血清和阳性血清，15min后根据显色情况确定质控线(C线)最适划线浓度。结果显示，抗体浓度在0.6mg/mL以上时显色明显，而抗体浓度在0.6mg/mL以下时显色不清晰，因此质控线最适划线浓度为0.6mg/mL。

取硝酸纤维素膜(NC膜)，将Protein A稀释成1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL依次划线，划线体积为1ul/cm，组装成试纸条，检测阴性血清和阳性血清，15min后根据显色情况确定检测线(T线)最适划线浓度。结果显示蛋白浓度在1.0mg/mL显色最为明显，因此检测线最适划线浓度为1.0mg/mL。

实施例4特异性和灵敏度检测

先准备感染的鳜鱼样本：取鳜鱼阳性组织样本充分研磨后离心取上清，过滤回收获得病毒液，保存与-150℃，用于攻毒。

将攻毒后的鳜鱼取血制备血清，并取肾脏使用DNA提取试剂盒提取DNA后进行PCR检测，其结果显示约在1300bp处有一条带，与阳性对照一致，说明攻毒后鱼体感染了鳜虹彩病毒(图2)。

室温下，吸取鳜鱼全血，静置析出血清取200μL滴加到样品孔内进行检测。质控线(C线)无条带即表明该试纸条无效；当金标抗原可以和质控线C线的多克隆抗体结合，在质控线有条带时，如果血清中有待测抗体则会和金标抗原结合，并在检测线T线上与标记的Protein A结合，此时T线显色结果判定为阳性；当T线无条带则结果判定为阴性。基于此，本发明所制备得到的检测鳜虹彩病毒抗体胶体金试纸条的判断标准为：质控线无条带，试纸条无效；质控线和检测线有条带，阳性；质控线有条带，检测线无条带，阴性。

(一)特异性

用鳜虹彩病毒ISKNV阳性血清、鲤疱疹病毒Ⅱ型CyHV-2阳性血清、草鱼呼肠孤病毒GCRV阳性血清、大口黑鲈蛙虹彩病毒LMBV阳性血清，验证潜在交叉反应。结果如图5，该试纸条与其它阳性血清没有交叉反应，表明该试纸条具有良好的特异性。

取全血进行检测，结果相同。

(二)灵敏度

使用该试纸条检测倍数稀释的鳜虹彩病毒阳性血清(用蒸馏水或者pH＝7.4的无菌PBS稀释)，检测线随着抗体浓度的降低而变浅，稀释至1:100时仍呈阳性(图6)。

取鳜鱼全血进行检测，结果相同，稀释至1:100时依然呈阳性。

并且图6显示，试纸条检测线的深浅程度可以用于初步判断鱼体中的抗体水平，还可能实现定量检测。

稀释后的全血或者血清仍然可以检测到抗体，表明本发明的试纸条灵敏度良好。而且操作简便、速度快，能满足现场快筛的需求。

对比例

用0.01mol/L pH＝7.4磷酸盐缓冲液处理样品垫，用0.01mol/L pH＝7.4的磷酸盐缓冲液+5％海藻糖处理结合垫，其余同实施例3，组装试纸条。结果显示，滴入的全血样本或者血清样本无法层析到最上端。采用实施例3的处理液，得到的试纸条可以正常层析。