一种转录因子ZBTB18在制备防治糖脂代谢紊乱的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种转录因子ZBTB18在制备防治糖脂代谢紊乱的药物中的应用。

背景技术

随着人们物质生活水平的不断提高和生活方式的改变，尤其是高热量食物摄入增加和体力活动减少，导致患有脂肪肝、糖尿病和肥胖等代谢性疾病的人群比例日趋增加且愈发低龄化。其中糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病，是诱发心血管疾病，肝、肾疾病以及生殖功能障碍等非传染性疾病的主要风险因素。尽管糖尿病已严重影响国民的生活质量，给国家和家庭带来沉重的经济负担，成为不可忽视的公共卫生问题和社会负担，但对其研究与治疗始终面临发病机制未完全解析、有效治疗药物不足等诸多瓶颈问题。因此，深入研究肝脏葡萄糖代谢调控网络，鉴定肝脏中维持葡萄糖代谢稳态的关键基因及潜在药物靶点不仅有助于完善糖尿病的发病机理，还可为其临床治疗提供新的理论依据和策略，具有重要的科学意义。

糖脂代谢紊乱会引起多种代谢性疾病，如中心性肥胖、糖尿病或糖调节受损、高血压、血脂异常等，并且这些疾病均以胰岛素抵抗为共同病理基础。糖尿病是一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌和或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，可引起严重的并发症，包括肾衰竭、失明、严重腿足损伤(甚至需要截肢)、冠心病与中风，是目前世界范围内严重的健康问题。其中2型糖尿病(T2DM)约占95％，又称非胰岛素依赖型糖尿病，主要特点是葡萄糖排出机能不良、肝细胞合成的甘油三酯增多、胰岛素抵抗等。肥胖已经成为全球性公关卫生问题，它是指体内脂肪过度堆积而对健康造成负面影响的身体状态。内脏脂肪的积聚可引起机体代谢变化，导致某些疾病发生，如糖尿病、高血压、肝胆疾病和心脑血管疾病等。肥胖是2型糖尿病(T2DM)的主要病因之一，2型糖尿病患者前期也会出现肥胖，二者关系密切。糖脂代谢紊乱首先涉及肝脏、胰腺和骨骼肌等组织，过高的肝葡萄糖输出是2型糖尿病的显著标志。因此肝脏糖脂代谢的重要调控途径是研究代谢疾病发病机理和治疗的关键问题。

目前对该病的药物治疗，主要是双胍类药物如二甲双胍；促胰岛素分泌药物如瑞格列奈；二肽基肽酶IV抑制剂药物如维格列汀、西格列汀；以及α-糖苷酶抑制剂(中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2020年版)[J].中华糖尿病杂志,2021,13(4):315-409)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术可选择药物不多的缺陷和不足，提供一种转录因子ZBTB18在制备防治糖脂代谢紊乱的药物中的应用，同时为糖脂代谢紊乱疾病提供了一种新的治疗方案。

本发明的目的是提供一种含有转录因子ZBTB18的重组病毒在制备防治糖脂代谢紊乱的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种防治糖脂代谢紊乱的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

ZBTB18，又被称为ZNF238、RP58、TAZ-1和C2H2-171，是一种含有C2H2型锌指结构的蛋白。目前，已有研究发现ZBTB18过表达可显著抑制肿瘤生长，具有抗肿瘤效果。本发明研究发现ZBTB18过表达可以降低糖尿病小鼠血糖，并改善糖尿病小鼠的葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗能力。

因此，本发明提供一种转录因子ZBTB18在制备防治糖脂代谢紊乱的药物中的应用。

进一步地，所述转录因子ZBTB18负载在重组病毒载体上。

优选地，所述重组病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体或腺病毒(Ad)载体。

优选地，所述糖脂代谢紊乱包括中心性肥胖、糖尿病、糖调节受损、高血压或血脂异常。

进一步地，所述转录因子ZBTB18降低空腹血糖并提高胰岛素含量。

本发明研究发现AV-ZBTB18过表达的糖尿病小鼠在三个耐受实验中血糖含量均有显著降低，即本发明所述转录因子ZBTB18改善肝脏糖异生、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。

进一步地，所述转录因子ZBTB18同时增加肝脏中p-AKT和p-GSK3β蛋白表达。p-AKT和p-GSK3β是PI3K/AKT/GSK3β信号通路中的关键信号分子，p-AKT和p-GSK3β蛋白表达增加，表示PI3K/AKT/GSK3β信号通路被激活，激活后的信号通过能促进糖原合成和葡萄糖转运，从而降低血糖水平，从而发挥降血糖的功能。

优选地，所述转录因子ZBTB18在肝脏中过表达。

进一步地，所述药物的剂型为片剂、粉剂、颗粒剂、针剂、胶囊、口服液或缓释剂。

同时，本发明还提供一种防治糖脂代谢紊乱的药物，包括本发明所述的转录因子ZBTB18，以及药学上可接受的载体。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种转录因子ZBTB18及含有转录因子ZBTB18的重组病毒在制备防治糖脂代谢紊乱的药物中的应用，通过动物实验发现ZBTB18过表达能降低糖尿病小鼠血糖，升高胰岛素含量；改善葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗；激活调控血糖的功能PI3K/AKT/GSK3β信号通路，从而达到防治糖尿病等一系列糖脂代谢紊乱引起的相关疾病。此外，本发明为深入研究肝脏葡萄糖代谢调控网络，鉴定肝脏中维持葡萄糖代谢稳态的关键基因及潜在药物靶点提供理论依据，并且有助于完善糖尿病的发病机理。

附图说明

图1为糖尿病模型小鼠和糖尿病对照组小鼠ZBTB18的相对mRNA水平数据统计图及ZBTB18的蛋白表达图(A)、肥胖模型小鼠和Ctrl对照组ZBTB18的相对mRNA水平数据统计图及ZBTB18的蛋白表达图(B)、SD对照组和高脂喂养ZBTB18的相对mRNA水平数据统计图及ZBTB18的蛋白表达图(C)、解剖前禁食6h小鼠和正常喂养对照小鼠ZBTB18的相对mRNA水平数据统计图及ZBTB18的蛋白表达图(D)、OA&PA(油酸(OA)和棕榈酸(PA))处理后MPHs(小鼠肝脏原代细胞)mRNA水平数据统计图及ZBTB18的蛋白表达图(E)、OA&PA(油酸(OA)和棕榈酸(PA))处理后MPHs(小鼠肝脏原代细胞)ZBTB18免疫荧光表达显微图(F)。

图2为ZBTB18过表达病毒感染的db/db小鼠和对照组db/db小鼠肝脏和脂肪中ZBTB18的蛋白表达图(A)、ZBTB18过表达病毒感染的db/db小鼠和对照组db/db小鼠的空腹血糖和血清胰岛素含量数据统计图(B)。

图3是AAV-Gfp和AAV-ZBTB18感染的db/db小鼠葡萄糖耐受实验(GTT)、胰岛素耐受实验(ITT)、丙酮酸钠耐受实验(PTT)数据统计图。

图4是ZBTB18过表达病毒感染小鼠和对照组db/db小鼠肝脏中糖脂代谢相关基因表达图(A)、小鼠肝脏中p-AKT、AKT、p-GSK3β和GSK3β的蛋白表达图(B)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

葡萄糖耐量检测实验(GTT)目的是指机体对血糖浓度的调节能力。小鼠在给予葡萄糖注射或灌胃后，使血糖升高，刺激胰岛素分泌、肝糖原合成增加，分解受抑制，肝糖原输出减少，体内组织对葡萄糖利用增加。胰岛素抵抗实验(ITT)目的是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。丙酮酸耐量实验(PTT)目的是评价动物糖异生的能力，丙酮酸是糖异生的底物，用丙酮酸或丙酮酸钠盐注射后通过测量小鼠血糖上升幅度评估小鼠的糖异生能力。因此，可以通过检测小鼠血糖含量来评估其葡萄糖耐量、胰岛素抵抗和糖异生能力。具体如下：

实施例1肝脏蛋白ZBTB18在不同葡萄糖代谢紊乱模型动物和细胞中表达

1、实验材料：

实验动物：6-8周db/db小鼠(糖尿病小鼠)6只、6-8周ob/ob小鼠(肥胖小鼠)6只和6-8周db/m小鼠(糖尿病对照组小鼠)6只，均为雄性，体重50±2g，均购自中国广东药康生物科技有限公司；6-8周C57雄性小鼠30只，体重25±2g，均购自广州中医药大学动物实验中心。饲养于广州中医药大学实验动物中心。

2、实验方法：

(1)实验动物分组及喂养

将动物分为db/db小鼠(糖尿病小鼠)、ob/ob小鼠(肥胖小鼠)、db/m小鼠(糖尿病对照组小鼠)、Ctrl组小鼠(对照组C57小鼠)、SD组(标准喂养C57小鼠组)、HFD(高脂饮食C57小鼠组)、Fasted组(C57小鼠禁食6小时)、Fed组(C57小鼠正常喂养组)，共8组，每组6只。

所有小鼠均可自由获取食物和水(普通饲料)，并在25℃环境下维持12/12h的光暗循环。HFD(高脂饮食C57小鼠组)用含有60％高脂饲料的饲料喂养建立DIO模型(高脂饮食诱导肥胖小鼠模型)。上述所有动物喂养84天后，Fasted解剖取肝脏前禁食6小时，其余组小鼠正常饮食解剖取肝脏进行后续实验。

(2)细胞培养和预处理

油酸：简称OA；棕榈酸：简称PA；BSA为是无游离脂肪酸的BSA，其结合油酸的效果更好。

油酸储备液配置实验步骤：

(1)配置0.1M的NaOH溶液：准确量取8mg的NaOH，溶于2mL的1640完全培养基中。

(2)配置100mM的OA中间液：称取0.2mmol的OA(油酸式量为282.46，常温下密度为0.89g/mL，0.2mmol的油酸即为56.5mg，换算成体积即量取63.5uL的油酸液体)，滴加到(1)中配置的0.1M NaOH溶液中，70℃水浴条件下不断搅拌，大约10min，直至液体不分层，且溶液中无固体颗粒或浑浊。(此步骤为皂化反应)

(3)配置10％BSA溶液：量取1.8g BSA(fatty acid free，FAF)，加入到18mL 1640完全培养基中，放在70℃水浴锅中预热。

(4)将(2)中得到的100mM OA中间液趁热加入到(3)中的10％BSA溶液中，放置在70℃水浴锅中不断搅拌，可见溶液变成黄色澄清状，即得10mM的OA储备液，0.22um滤头过滤后，1mL/tube分装在1.5ml EP管中，-20℃冻存备用。

配置棕榈酸，步骤不变，按照相应的式量换算即可。

OAPA造模：分离C57普通小鼠原代肝细胞(MPHs)，并在RPMI-1640培养基(10％胎牛血清，100单位/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)中培养。用OA&PA暴露24h，然后收集细胞进行后续分析，以不经OA&PA暴露普通小鼠原代肝细胞(MPHs)作为对照。

(3)Western blot

解剖各组小鼠获取肝脏组织，从各组动物肝脏、对照组小鼠原代肝细胞、经OA&PA暴露后的小鼠原代肝细胞中分离的蛋白质样品进行裂解、均质和浓度检测，使用RIPA裂解缓冲液和BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime,Biotechnology,Beijing,China)。随后，将80～100μg的蛋白上传到10％的SDS-PAGE凝胶上，将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用ZBTB18特异性抗体进行western blot检测其表达水平。

(4)实时定量PCR

使用Trizol试剂盒(Takara)从各组动物肝脏、对照组小鼠原代肝细胞、经过OA&PA暴露后的小鼠原代肝细胞和普通小鼠原代干细胞中分离总RNA，以β-actin为内参基因，检测ZBTB18 mRNA表达；取总RNA 2μL按Thermo Scientific公司的Revert Aid ReverseTranscriptase(逆转录酶)说明将其逆转录为cDNA；将逆转录后的cDNA做10倍稀释，以β-actin为内参基因，取等量cDNA(2μL)进行染料法PCR反应，统计时以目的基因与内参基因之比值作为最终相对定量值。

引物序列：

(5)免疫荧光实验

在Servicebio(武汉塞维尔生物科技有限公司)按照先前的方案进行。用ZBTB18(Proteintech，中国)的一抗在40℃下孵育肝脏切片或MPHs，然后用指定的二抗孵育。使用共聚焦激光扫描显微镜(徕卡)或显微镜(奥林巴斯)获取荧光图像。

3、实验结果

荧光定量PCR及Western blot分析结果表明：糖尿病小鼠(图1A)，n＝6；肥胖小鼠(图1B)，n＝6；HFD(高脂饲料)喂养小鼠(图1C)，n＝6；禁食和喂养小鼠(图1D)，n＝6，ZBTB18在以上各组的代谢紊乱的小鼠实验组中均显示表达降低，这表明ZBTB18功能障碍与糖脂代谢紊乱疾病存在密切联系。荧光定量PCR及Western blot(图1E)和免疫荧光(图1F)显示经OA&PA处理后的MPHs中ZBTB18表达量显著降低，这表明ZBTB18能对营养环境变化做出迅速反应。

实施例2小鼠血糖检测

1、实验材料

实验动物：6～8周龄db/db小鼠12只(购自中国广东药康生物科技有限公司)。

实验耗材：表达ZBTB18的腺相关病毒(AAV-ZBTB18)和表达绿色荧光蛋白的腺相关病毒(AAV-Gfp)及其质粒均购于汉恒生物科技有限公司(上海)、ELISA试剂盒(睿信生物科技有限公司)

2、实验方法：

(1)实验动物分组及干预

将db/db小鼠适应性喂养一周后分为两组分成两组，AAV-ZBTB18组和AAV-Gfp组，每组6只。将含有1.0～1.5*10

(2)观察与取材

持续观察感染完腺病毒的小鼠活动状态；感染腺病毒7～9d后解剖小鼠收集肝脏和血浆进一步分析。

(3)小鼠血清葡萄糖及血清胰岛素含量水平检测

感染AAV-Gfp和AAV-ZBTB18病毒的两组共12只db/db小鼠，禁食6小时后采用眼球采摘取血浆，静置20分钟后离心(4000rpm，15min)吸取上层血清。用ELISA试剂盒(睿信生物科技有限公司)检测血清葡萄糖及血清胰岛素含量。(4)Western Blot

解剖小鼠获取肝脏组织，称取适量肝组织0.9％生理盐水，冰上匀浆制备成10％肝组织匀浆，随后蛋白质进行裂解、均质和浓度检测，使用RIPA裂解缓冲液和BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime,Biotechnology,Beijing,China)。随后，将80-100μg的蛋白上传到10％的SDS-PAGE凝胶上，将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。使用ZBTB18特异性抗体进行western blot检测其表达水平。

3、实验结果：

实验结果表明通过尾静脉注射AAV-ZBTB18的db/db小鼠肝脏和脂肪(Adipose)中ZBTB18表达量增加(图2A)，这表明ZBTB18的过表达能减轻糖尿病小鼠的肝脏脂肪变性。与对照组AAV-Gfp相比，AAV-ZBTB18过表达的小鼠空腹血糖和血清胰岛素含量显著降低(图2B)，这表明AAV-ZBTB18过表达小鼠血糖紊乱得到了改善。

实施例3小鼠的葡萄糖耐受实验、胰岛素耐受实验、丙酮酸钠耐实验

1、实验材料：

实验动物：6～8周龄db/db小鼠12只(购自中国广东药康生物科技有限公司)。

实验耗材：表达ZBTB18的腺相关病毒(AAV-ZBTB18)和表达绿色荧光蛋白的腺相关病毒(AAV-Gfp)及其质粒均购于汉恒生物科技有限公司(上海)。葡萄糖检测仪(艾科灵睿)、血糖条(艾科灵睿)、葡萄糖、生理盐水。

2、实验方法：

(1)实验动物分组及干预

将db/db小鼠适应性喂养一周后分为两组：AVV-Gfp组和AAV-ZBTB18组，每组小鼠6只。将含有1.0～1.5*10

(2)GTT实验和PTT实验

在GTT实验和PTT实验中，先将小鼠禁食过夜16小时，再在尾静脉注射d-葡萄糖(1～2g/kg)或丙酮酸钠(0.5～1.5g/kg)，并于0、15、30、45、60、90和120min使用葡萄糖监测仪(On Call EZIV，中国)检测血糖水平。

(3)ITT实验

在ITT实验中，先将小鼠禁食6h，注射胰岛素(0.5～0.75U/kg)后，在0、15、30、45、60、90和120min测定血糖。

3、实验结果：

从图3可以看出，与AVV-Gfp相比，AAV-ZBTB18感染的db/db小鼠空腹血糖(小鼠0min的血糖)和胰岛素水平降低，这表明这些小鼠的葡萄糖紊乱得到改善，ZBTB18过表达可以改善小鼠葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，继续监测进行GTT、ITT和PTT的小鼠120分钟内的血糖变化情况，从图3可以看出，与AVV-Gfp相比，AAV-ZBTB18感染的db/db小鼠在三个耐受实验中血糖含量均有显著降低，表明ZBTB18过表达可以改善小鼠葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗,以及降低小鼠的糖异生能力。

实施例4小鼠糖脂代谢相关基因和蛋白的表达

1、实验材料：

实验动物：6～8周龄db/db小鼠12只(购自中国广东药康生物科技有限公司)。

实验耗材：表达ZBTB18的腺相关病毒(AAV-ZBTB18)和表达绿色荧光蛋白的腺相关病毒(AAV-Gfp)及其质粒均购于汉恒生物科技有限公司(上海)。

2、实验方法：

(1)实验动物分组及干预

qPCR实验分组：将db/db小鼠适应性喂养一周后分为两组：AVV-Gfp组和AAV-ZBTB18组，每组小鼠6只。将含有1.0～1.5*10

Western blot实验分组：四组小鼠(均为db/db鼠(糖尿病小鼠)购自中国广东药康生物科技有限公司)，每组6只：分别为只感染了AAV-GfP病毒的小鼠、只感染了AAV-ZBTB18病毒小鼠、注射了胰岛素并感染了AAV-GfP病毒的小鼠；注射了胰岛素并感染了AAV-ZBTB18病毒的小鼠。

(2)观察与取材

持续观察感染完腺病毒的小鼠活动状态；感染腺病毒7～9d后，只感染了AAV-GfP病毒的小鼠、只感染了AAV-ZBTB18病毒小鼠立即解剖小鼠收集肝脏进一步分析；注射了胰岛素并感染了AAV-GfP病毒的小鼠；注射了胰岛素并感染了AAV-ZBTB18病毒的小鼠在解剖前10min腹腔注射10倍小鼠体重的胰岛素。

(3)实时定量PCR(qPCR)

实时定量PCR(qPCR)使用Trizol试剂盒(Takara)从动物肝脏样本中分离总RNA，以β-actin为内参基因，检测Pparα(m)、Pepck(m)、G6pase(m)等mRNA表达；取总RNA 2μL按Thermo Scientific公司的RevertAid Reverse Transcriptase说明将其逆转录为cDNA；将逆转录后的cDNA做10倍稀释，以β-actin为内参基因，取等量cDNA(2μL)进行染料法PCR反应：反应条件为95℃预变性30s；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环；溶解曲线95℃ 15s，60℃30s，95℃ 15s；统计时以目的基因与内参基因之比值作为最终相对定量值。

引物序列表

(4)Western blot：从肝脏样本中分离的蛋白质样品进行裂解、均质和浓度检测，使用RIPA裂解缓冲液和abicinchoninic acid Protein assay kit(Beyotime,Biotechnology,Beijing,China)。随后，将80-100μg的蛋白上传到10％的SDS-PAGE凝胶上，将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。检测p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β蛋白水平表达。

3、实验结果：

从图4A中可以看出ZBTB18明显过表达时会改变db/db小鼠糖脂代谢相关基因，具体表现在，ZBTB18过表达会上调MgII(m)、Pparα(m)、Acadvl(m)、Acads(m)、Cpt2(m)、Aco2(m)、基因，下调Ppargc-1α(m)、Pepck(m)、G6pase(m)基因，结果表明ZBTB18可以通过调节糖脂相关基因，改善胰岛素不良信号通路。Western blot结果显示，仅感染AAV-GfP病毒和仅感染了AAV-ZBTB18病毒小鼠肝脏中AKT和GSK3β及其磷酸化蛋白表达变化不显著，这是因为ZBTB18作为响应胰岛素的蛋白，没有胰岛素就起不到响应胰岛素的作用，正常情况下的小鼠体内胰岛素并不多，所以PI3K/AKT/GSK3β胰岛素信号通路蛋白表达也不强烈。而注射胰岛素后的db/db小鼠肝脏中ZBTB18过表达可增强AKT和GSK3β的磷酸化，有助于db/db小鼠从葡萄糖和脂质紊乱中恢复(图4B)，改善胰岛素信号通路。PI3K/AKT/GSK3β是重要的胰岛素信号通路，调控血糖的功能主要依靠此信号通路。胰岛素首先与细胞膜外的胰岛素受体(IR)结合使胰岛素受体构象发生改变，并在酪氨酸激酶(PTK)的作用下磷酸化，进而激活胰岛素受体底物(IRS)，引起下游信号分子的级联反应，如磷脂酞肌醇酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/AKT)。蛋白激酶B以磷酸化形式被活化，活化后抑制下游糖原合成酶的活性，促进糖原合成和葡萄糖转运，从而降低血糖水平。该信号通路发生障碍可导致胰岛素抵抗。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。