甲烷氧化菌素用于治疗铁相关疾病的用途

技术领域

本发明涉及用于医药(medicine)的将Fe

发明背景

铁超载可发生在患有遗传性血色病、地中海贫血、镰状细胞病、再生障碍性贫血、骨髓发育不良和其它疾病的患者中。遗传性血色病是由于编码参与限制全身铁摄取的蛋白质的基因的突变引起的。约10％的群体是杂合子携带者，0.3-0.5％是纯合子。目前，这些由铁摄取失调引起的疾病通过定期放血(高达500ml/每周！)或铁螯合剂如去铁酮(Ferriprox)、地拉罗司(Exjade，Novartis Net Sales2019:995Mio$，https：//www.novartis.com/Investors/Financial-Data/Product-Sales)和去铁胺(Desferal)治疗。这些螯合剂具有不希望的副作用并且不如放血有效。然而，它们仅能够部分溶解铁沉积物。

此外，脑铁积累与几种神经变性疾病相关，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、痴呆、亨廷顿病(Liu等人，Front Neurosci.2018；12:632；Agraval等人，Free Liotic andMedicine 2018,120,317-329；Moon等人，J Alzheimers病2016，51(3)，737-45)和多发性硬化(Stephenson等人，Nature Reviews Neurology，2014，第10卷，459-468)。

特别地，铁和铁的积累在衰老(senescence)(Masaldan等人，Redox Biol，2018，14:100-115)、老化(ageing)(Timmers等人，NATURE COMMUNICATIONS|(2020)，11,3570)、铁细胞死亡(Li等人，Cell Detation&Disease，11，文章号：88)、酒精性肝病(Kowdley，Gastroenterol Hepatol(NY)，2016，12(11)：695-698)或肌萎缩性侧索硬化(Gajowiak等人，Postepy hig Med Dosw(在线)，2016Jun 30；70(0)：709-21)中起作用。

因此，鉴定能够帮助铁的消耗，特别是溶解铁沉积物的化合物可能是非常有益的。

发明简述

本发明涉及用于医药的将Fe

此外，本发明涉及包含甲烷氧化菌素的药物组合物。

此外，本发明涉及体外将Fe

如实施例中所示，令人惊奇地发现某些甲烷氧化菌素能够络合Fe

附图简要说明

图1：通过MB-SB2将三价铁结合并还原成二价铁

A.分离的50nmol ml

图2.MB-SB2而非MB-OB3b的铁还原酶活性

含有1mM铁嗪加10mM FeCl

图3：MB-SB2而非MB-OB3b的胆汁铁排泄

A.胆汁铁排泄。在肝脏灌注时，MB-SB2将铁带至胆汁，而MB-OB3b则没有。B.粪便铁排泄。腹膜内注射MB-SB2 LPP Atp7b

图4：水氧化与通过MB-SB2还原Fe(III)相耦合

加入20mM FeCl

图5：对照Huh7细胞(人肝癌细胞系)预载入50μM FAC 24小时。然后用0.5mM MB-SB2、0.5mM MB-OB3b和0.5mM DFO处理细胞24小时。与OB3B和DFO相反，MB-SB2显着降低铁预载的Huh7细胞中的细胞铁浓度至未处理水平。统计学分析通过单因素方差分析

FAC：柠檬酸铁铵

UT：未处理的Huh7细胞

对照：用50μM FAC处理24小时的细胞

DFO：去铁胺。

发明详述

以下描述本发明的解决方案，在所附实施例中举例说明，在附图中说明并在权利要求中反映。

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本文使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其它组合”的含义。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括”及其变体如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时用术语“具有”代替。当在本文中使用时，“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。

应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。

本发明涉及用于医药的将Fe

本文所用的术语“甲烷氧化菌素”特别包括修饰的肽，其特征在于存在一个噁唑酮环和第二个噁唑酮、咪唑酮或吡嗪二酮环。这两个环被2-5个氨基酸残基分开。每个环具有相邻的硫代酰胺基团。

优选地，甲烷氧化菌素是MB-SB2，并且包含根据式(I)的一级结构。更优选地，甲烷氧化菌素具有根据式(I)的一级结构并且是MB-SB2。

当络合Fe

当在本文中使用时，术语“络合”和“结合”可互换使用，即例如甲烷氧化菌素“结合”铁应理解为甲烷氧化菌素“络合”铁，反之亦然。术语“络合”通常是指形成由中心离子和被称为配体或络合剂的周围的分子阵列组成的络合物。对于本发明，中心离子是铁(即Fe

在过量Fe

优选地，还原是在催化下进行的，使用甲烷氧化菌素作为催化剂。在本发明中，术语“催化”定义为一种这样的反应，其中“催化剂”分子通过形成中间体，理想地以达到技术上有用的总反应速度的方式，增加反应的反应速度。在本发明中，“催化剂”在形成中间体之后再生，释放出再生的催化剂和预期的式(III)的反应产物。

本发明的甲烷氧化菌素可以利用各种电子供体用于Fe

可以想象，优选地，根据以下等式进行还原：

4FeCl

本领域技术人员将容易理解，通常在将甲烷氧化菌素施用于受试者后形成甲烷氧化菌素-铁复合物，此时甲烷氧化菌素复合物会耗尽受试者体内的(过量)铁。

术语“甲烷氧化菌素”包括天然存在的甲烷氧化菌素及其功能变体、片段和衍生物，其保留络合铁(即Fe

术语“甲烷氧化菌素变体”是指具有“亲本”甲烷氧化菌素的甲烷氧化菌素通式，但与亲本甲烷氧化菌素相比含有至少一个氨基酸取代、缺失或插入的甲烷氧化菌素，前提条件是变体保留本文所述的所需铁结合亲和力和/或生物活性。

“甲烷氧化菌素衍生物”是化学修饰的甲烷氧化菌素。通常，所有类型的修饰都包括在本发明中，只要它们不消除甲烷氧化菌素的有益效果。即，甲烷氧化菌素衍生物优选保留它们所来源的甲烷氧化菌素的铁结合亲和力和/或生物活性。甲烷氧化菌素衍生物还包括如下文所述的稳定化甲烷氧化菌素。

本发明的上下文中可能的化学修饰包括氨基酸残基的酰化、乙酰化或酰胺化。其它合适的修饰包括，例如，用不同长度的聚合物链延伸氨基(例如XTEN技术或

其它可能的修饰可包括去除硫酸酯基和/或用更稳定的咪唑酮或吡嗪二酮基代替噁唑酮基。将II类甲烷氧化菌素的操纵子中的基因添加和/或缺失到I类中或反之亦然将导致环类型改变(注：I类和II类甲烷氧化菌素描述于Semrau等人2020.FEMS MicrobiolLett.367:fn045)。用咪唑酮或吡嗪二酮基团取代噁唑酮基团应将甲烷氧化菌素的稳定性提高到口服给药可能的程度。

为了本发明的目的，如上定义的甲烷氧化菌素还包括其药学上可接受的盐。如本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指对治疗安全且有效的那些甲烷氧化菌素的盐。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、胆碱等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

如前所述，甲烷氧化菌素片段、变体和衍生物优选保留所附实施例中评价的甲烷氧化菌素的有利能力。

甲烷氧化菌素可来源于甲基孢囊菌属菌株SB2(Methylocystis sp.strain SB2)。

如上所述和如实施例2所示，根据本发明的甲烷氧化菌素能够通过将过量的铁Fe

此外，本发明涉及用于治疗铁过载障碍、神经退行性疾病、由红细胞输血引起的铁过载、衰老、老化、嗜铁细胞死亡(ferroptotic cell death)、酒精性肝病或肌萎缩性侧索硬化的甲烷氧化菌素。

铁过载障碍可由选自遗传性血色病、地中海贫血、镰状细胞病、再生障碍性贫血、骨髓发育不良的疾病引起。

神经退行性疾病可以选自阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、亨廷顿病和多发性硬化。

从以下实施例将更好地理解本发明及其优点，这些实施例仅用于说明性目的。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

本发明还涉及一种用于医药，特别是用于上述适应症的包含如上所述的甲烷氧化菌素的药物组合物。

如上所述，本文还设想了包含甲烷氧化菌素的药物组合物。因此，本发明的其他方面包括包含如本文所述的甲烷氧化菌素的药物组合物和所述甲烷氧化菌素用于制造药物组合物的用途。术语“药物组合物”特别是指适于给予人的组合物。然而，本文还设想了适于向非人动物施用的组合物。

药物组合物及其组分(即活性成分和任选的赋形剂或载体)优选是药学上可接受的，即能够引起所需的治疗效果而不引起不希望的或至少可接受的局部或全身性作用。本发明的药学上可接受的组合物可以特别是无菌的和/或药学上惰性的。具体地，术语“药学上可接受的”可以指由管理机构或其它公认的药典批准的用于动物，更特别地用于人类。

本文所述的甲烷氧化菌素优选以治疗有效量存在于药物组合物中。

“治疗有效量”是指引发期望的治疗效果的甲烷氧化菌素的量。确切的剂量将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术确定。治疗功效和毒性可通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如ED

设想药物组合物包含如本文所述的甲烷氧化菌素，特别是稳定形式的甲烷氧化菌素，并且优选治疗有效量的甲烷氧化菌素，任选地与一种或多种载体、赋形剂和/或另外的活性剂一起。

“赋形剂”包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、助溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、湿润剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。用于本发明的药物组合物的示例性的合适载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。

本发明的药物组合物可以配制成各种形式，例如固体、液体、气体或冻干形式，并且可以尤其是软膏剂、乳膏、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体、酏剂、提取物、酊剂或流体提取物(fluid extracts)的形式，或者是特别适合于所需给药方法的形式。本身已知的制备药物的方法在Forth,Henschler,Rummel(1996)Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie,Urban&Fischer中有说明。

根据本发明，可设想多种途径来施用甲烷氧化菌素和药物组合物。通常，给药将通过肠胃外完成，但也可以考虑口服给药。肠胃外递送的方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。优选地，通过腹膜内和静脉内完成给药。

本发明还涉及体外将Fe

优选地，所述甲烷氧化菌素是催化剂，并且存在还原剂。

所述还原剂可以是烟酰胺腺嘌呤核苷酸(Nicotinamidadenindinukleotid)(NADH)或水。

所述溶剂可以是极性质子或非质子溶剂。

优选地，所述溶剂和/或还原剂是水。

优选地，还原以每分钟每甲烷氧化菌素还原0.5至5、更优选0.7至3、最优选1个Fe

优选地，在该过程中产生分子氧。

实施例

实施例1：通过MB-SB2结合三价铁并还原成二价铁(图1)

已经测量了分离出来的50nmol ml

实施例2：铁还原(图2)

用菲洛嗪(Ferrozine)分析法确定铁还原酶活性(1，2)。

1.Carter P.1971.Spectrometric determination of serum iron at thesubmicrogram level with a new reagent(ferrozine).Anal Biochem 40:450-458.

2.Moody MD,Dailey HA.1983.Aerobic ferrisiderophore reductase assayand activity stain for native polyacrylamide gels.Anal Biochem 134:235-239.

实施例3：肝灌注实验(图3A)

来自LPP Atp7b

实施例4：粪便铁排泄(图3B)

LPP Atp7b

实施例5：水的氧化(图4)

在Coy厌氧室(气氛95％ Ar 5％ H

通过监测

将气体样品手动注入Agilent 7890B GC系统(Santa Clara，CA，USA)，配有7250Accurate-Mass Q-TOF GC/MS和DB5-ms柱。除了