基于mtDNACOⅠ基因检测捕食天敌肠道内棉花粉蚧的分子标记及应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及检测捕食天敌肠道内棉花粉蚧的分子标记及应用。

背景技术

棉花粉蚧，又名扶桑绵粉蚧(Phenacoccus solenopsis)，最早于1898年在美国新墨西哥州公园两种杂草Boerhavia spicata和Kallstroemia brachystylis根部的红火蚁(Solenopsis geminata)巢穴中被发现。1991年在美国得克萨斯州首次发现棉花粉蚧危害棉花；21世纪初期，通过苗木、接穗及果品的调运等方式迅速蔓延至周边国家和地区。2005年该虫扩散至亚洲、大洋洲、非洲部分国家，印度、巴基斯坦等主要产棉国受害严重。2008年6月，我国广州市园林植物扶桑树上首次发现棉花粉蚧危害，很快入侵我国大部分省份，危险性综合评价值为0.886。棉花粉蚧是典型的多食性害虫，截至2015年，危害全球范围内55个属的202种植物，包括大田作物、蔬菜、观赏植物、果树甚至杂草。棉花受害最严重，其次是秋葵、茄子、番茄、芝麻、向日葵。天敌是调节和控制害虫种群数量的最重要因子，天敌群落的组成在不同生境不同区域间的差异很大。粉蚧的捕食天敌资源丰富，一种粉蚧可有多种捕食天敌，一种捕食天敌可以捕食多种粉蚧，明确天敌种类及捕食效能，是引进或释放天敌，维持天敌控制效能的关键。

DNA条形码技术的发展和普及，为物种分类、鉴定和检测工作提供了快速有效的研究方法和手段。该技术主要利用线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I(mt COⅠ)的特定标准区域做模板进行物种鉴定，该段基因序列长度适中，相对保守又有足够的变异，且不存在内含子，是蛋白编码基因，便于比对，可通过翻译检测错误，极少出现重组、插入和缺失。最早由Hebert等利用mtDNA COⅠ作为DNA条形码的基础，对11个门13320个物种的mt COⅠ基因序列进行分析，发现此基因区段能够很好地对被研究物种进行鉴定(Hebert P D N，CywinskaA，Ball S L.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings：Biological Ciences，2003，270：313-321)。随后，该技术也被应用到昆虫生态学食物链的解析研究中，即通过特异的引物检测植食性昆虫或捕食者肠道内含物或排泄物中残存的寄主植物或被捕食者的mtDNA COⅠ来确定食物链中的营养关系。但目前还缺少通过mtDNA COⅠ基因研究棉花粉蚧与捕食天敌的营养关系的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可检测捕食天敌肠道内棉花粉蚧的分子标记及应用，选取mtDNA COⅠ基因的特异性片段作为棉花粉蚧的分子标记，该分子标记可用于检测捕食天敌肠道内棉花粉蚧的DNA，可以快速、简便地评估捕食者和棉花粉蚧之间的营养关系，明确棉花粉蚧的捕食天敌种类及优势天敌。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

分子标记在检测捕食天敌肠道内棉花粉蚧的应用：所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括以下方法：根据所述的分子标记设计引物，通过设计的引物扩增捕食天敌肠道内含物DNA，如果扩增出所述的分子标记(235bp)则捕食天敌肠道内含有棉花粉蚧。

优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO.3和4所示。

本发明的技术思路：动物线粒体基因组包括2个核糖体RNA(16SrRNA、12SrRNA)基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因(细胞色素cytb，细胞色素C氧化酶3个亚基CO1、CO11、COIII，ATP2个亚基，NDAH7个亚基)，其中蛋白编码基因COI长度适中，且不存在内含子，便于比对，且可通过翻译检测错误，极少出现重组、插入和缺失等，广泛作为DNA条形码用于物种的鉴定和检测。从理论上讲，15个碱基位点就有4

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.可以对所研究范围内所有天敌种群的捕食活动进行系统研究，节省田间观察或实验室活体观察的时间成本及捕食的偶然性和不确定。

2.可以根据天敌肠道的靶标DNA的检出率，从分子水平上判定优势天敌物种类群。

3.可以检测出天敌对棉花粉蚧捕食后22小时以内情况。

附图说明

图1为分子标记引物对COF351/COR585 PCR扩增的电泳图，从左到右的泳道依次为：1为Marker500，2、3为棉花粉蚧，4为清水对照。

图2为引物对COF419/COR585 PCR扩增的电泳图，从左到右的泳道依次为：1为Marker500，2、3为棉花粉蚧，4为棉蚜，5为空白对照。

图3为分子标记引物对COF351/COR585在棉花粉蚧及同域生物中PCR扩增的电泳图。从左到右的泳道依次为(1-19)：Marker500，棉花粉蚧，棉铃虫，红铃虫，斜纹夜蛾，甜菜夜蛾，盲蝽，叶蝉，棉蚜，棉叶螨，棉蓟马，烟粉虱，七星瓢虫，龟纹瓢虫，六班月瓢虫，异色瓢虫，三突花蛛，蚂蚁，寄生蜂。

具体实施方式

实施例1棉花粉蚧mtDNACOⅠ基因模板的获得及特异性标记引物的设计

发明人从田间采集棉花粉蚧的样本，使用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit提取样本总DNA提取，引物PCO-F1(5′-CCTTCAACTAATCATAAAAA TATYAG-3′)和LEP-R1(5′-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3′)扩增棉花粉蚧mtDNACOⅠ基因，经上海生工ABI7300测序，获得长度为704bp的序列(如SEQ ID NO.1所示)，在NCBI上Blast，确认扩增的片段为棉花粉蚧的线粒体基因部分片段。

由于动物线粒体基因富含A/T，部分序列保守性强，我们根据引物设计原则，针对模板序列设计多条引物，其中包括5条正向引物，6条反向引物(如表1)。根据扩增长度300bp内，两两组合配对，并经过NCBI Blast及PCR扩增，最终获得特异性分子标记引物COF351(5′-CAGGTTGAACTTTATACCCTCC-3′)和COR585(5′-GCTCTTGAAAGTACTGGAATTG-3′)，扩增的目的片段长度235bp(如SEQ ID NO.2所示)。而其它引物组合则不能扩增出目的片段，或者扩增后在非靶标害虫中有非目标条带扩增，如COF419/COR585引物对，不仅在棉花粉蚧的DNA模板中扩增出180bp左右的条带，还可以在棉蚜的DNA模板中扩增出相应条带(见图2)。

表1设计的引物名称及核苷酸序列

实施例2分子标记引物特异性的检测

以与棉花粉蚧同域发生的节肢动物(其中害虫包括：棉铃虫、红铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、盲蝽、叶蝉、棉蚜、烟粉虱、棉叶螨、棉蓟马、七星瓢虫、龟纹瓢虫、六班月瓢虫、异色瓢虫、三突花蛛、大草蛉、班氏跳小蜂，各种天敌饥饿48h)的DNA作为模板，以取食棉花粉蚧的七星瓢虫成虫作为阳性对照，清水作为阴性对照，以引物对COF351和COR585进行扩增，检验分子标记引物的特异性。

PCR反应体系为25μL，含2.5μL 10×Buffer，2.0μL dNTPs(10mmol/L)，引物COF351和COR585 0.5μL(10μmol/L)，Taq酶0.3μL(5U/μL)，2.5μL模板DNA(50ng/μL)，其余用dd H

结果如图3所示，只在阳性对照中检测到目标条带，约235bp，其余的模板DNA均未扩增出目标片段。

实施例3特异性分子标记引物在检测不同消化时间七星瓢虫肠道中棉花粉蚧的应用

将在室内以蚕豆蚜为食饲养的七星瓢虫成虫饥饿48h后，每头饲喂棉花粉蚧成虫1头。选取30min内具有取食行为的瓢虫，于25℃恒温分别放置不同时间，期间不提供任何食物，仅提供少量清水。七星瓢虫取食后分别放置0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、48h，于-20℃单头无水乙醇冻存待测，每处理10头重复。然后以引物对COF351和COR585分别对七星瓢虫腹内的棉花粉蚧基因进行检测，PCR反应体系和程序同实施例2。结果显示：在七星瓢虫取食消化22小时内能100％在其肠道内检测到棉花粉蚧的mtDNA COⅠ，24h后检出率为80％，即该分子标记引物可以100％检测出在棉田22h内取食过棉花粉蚧的七星瓢虫，而取食24h后检出率开始下降，见表2。

表2七星瓢虫取食棉花粉蚧后不同消化时间肠道内的阳性检出率

实施例4田间天敌捕食行为的mtDNA COⅠ分子标记检测

2022年7月15日至9月15日棉花粉蚧盛发期，在棉田内随机采集捕食性瓢虫类和蜘蛛类天敌，单头分装，1h内带回实验室，立即于-20℃无水乙醇冻存待测。天敌DNA提取与PCR扩增体系和反应程序与实施例2一致。mtDNA COⅠ基因标记检测结果表明：20头七星瓢虫中有7头肠道内检测到棉花粉蚧的mtDNA COⅠ分子标记，阳性检出率为35％；18头龟纹瓢虫中5头肠道内检测到棉花粉蚧的mtDNA COⅠ基因片段；而异色瓢虫、六斑月瓢虫和蜘蛛类肠道内阳性检出率为0。可见，七星瓢虫与龟纹瓢虫在田间偏好捕食棉花粉蚧，而异色瓢虫、六斑月瓢虫和蜘蛛类在田间则可能并未捕食扶桑绵粉蚧(见表3)。

表3田间天敌捕食行为的mtDNA COI分子标记检测结果