用于增强免疫力的方法和组合物

相关申请

本申请要求2021年4月12日提交的美国临时专利申请号63/173,947的优先权，其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。

发明背景

近年来，病毒和细菌感染在世界范围内变得越来越普遍，并呈现严重的公共健康威胁。例如，由严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的呼吸道疾病的冠状病毒-2019(COVID-19)全球流行病已经影响全世界近12亿人，包括超过260万人死亡，对公共健康的威胁因大量的无症状携带者而正在加剧。几种有潜力的治疗剂目前正在被积极研究和开发，以用于预防或者治疗COVID-19，从而预防或改善其对受累患者的损害作用，而同时实验疫苗正广泛地被分配到一般人群中。

因此，对控制病毒和细菌感染以及减轻或消除它们的相关作用的新的、有意义的治疗方法存在迫切需要。本研究的目的是鉴定用于预防严重感染结果和治疗感染症状的肠道微生物功能途径和微生物代谢物。刺激这些肠道微生物功能途径或直接补充有益微生物代谢物是增强免疫力，治疗病毒或细菌感染(包括COVID-19)和促进从这些病毒或细菌疾病中恢复的潜在有效的手段。本发明通过举例说明在病毒或细菌感染期间肠道微生物群的改变以及治疗性微生物和细菌代谢物在预防、治疗和恢复由这种感染引起的疾病和病况中的潜在作用来满足这种需要和其它相关的需要。

发明内容

在由病毒或细菌病原体引起的感染性疾病以及对这些疾病的预防，治疗和从其恢复的背景下，本发明人进行了对肠道微生物功能途径和微生物代谢物的广泛研究。相关的途径和代谢物已经被鉴定，现在它们为增强或改善个体的免疫力和预防或治疗(例如，降低疾病严重程度)以及促进从感染性疾病如COVID-19中恢复提供了新的方法和组合物。

在第一方面，本发明提供了在个体中增强免疫力，预防或治疗诸如COVID-19的病毒或细菌感染，或减轻疾病症状或严重程度的方法。所述方法包括向个体施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包含至少一种短链脂肪酸、L-异亮氨酸或一种或多种表3中所示的代谢物，或产生短链脂肪酸或L-异亮氨酸或这类代谢物的细菌，或它们的任意组合，条件是受试者除此以外不需要用短链脂肪酸或L-异亮氨酸或这类代谢物治疗。在一些实施方案中，施用步骤包括经口摄入组合物，例如呈片剂、胶囊剂、溶液/悬浮液、乳液、糊剂、粉末剂的形式，或呈食品或饮料物品或其添加剂的形式。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种短链脂肪酸，任选地两种或更多种不同的短链脂肪酸的组合。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种短链脂肪酸和L-异亮氨酸。在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种产生短链脂肪酸或L-异亮氨酸或所述代谢物的细菌，任选地两种或更多种不同细菌物种的组合，例如青春双歧杆菌和陪伴粪球菌(Coprococcus comes)。在一些实施方案中，短链脂肪酸是乙酸、丙酸、丁酸或异丁酸。在一些实施方案中，短链脂肪酸可以是丁酸、丁酸盐或丁酸甘油酯。在一些实施方案中，细菌是产生丁酸的革兰氏阳性厌氧细菌。在一些实施方案中，所述细菌是普拉梭菌。在一些实施方案中，细菌是双歧杆菌属的物种，例如青春双歧杆菌或陪伴粪球菌，然而在一些情况下不是青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的任何一种，或者至少不是青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的两种，三种或更多种的组合。在一些实施方案中，受试者已经被诊断患有COVID-19或处于被SARS-CoV2感染的风险中。在一些实施方案中，特别是当受试者正在寻求治疗(例如，减轻症状或疾病严重程度)或预防COVID-19时，所述方法还包括向受试者施用已知有效抑制SARS-CoV2并促进患者从COVID-19恢复的一种或多种药剂(例如，伊维菌素、维生素C、维生素D、槲皮素、褪黑激素、锌、阿奇霉素、羟基氯喹、氟伏沙明或氟西汀，或其任意组合)，其可以在相同的组合物中或在第二单独的组合物中。在一些实施方案中，受试者虽然正在从COVID-19恢复，但在疾病的活动阶段结束后4周或更长时间仍然受长期持续的症状的困扰。

在相关方面，本发明提供了组合物用于改善受试者免疫力的新用途。所述组合物包含有效量的(1)以下中的至少一种，可能两种或更多种的活性成分：短链脂肪酸、L-异亮氨酸、表3中所示的代谢物，和产生所述短链脂肪酸或L-异亮氨酸或所述代谢物的细菌；和(2)生理学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物基本上由活性成分加上一种或多种赋形剂组成。在一些实施方案中，受试者被诊断为患有COVID-19或受试者处于感染SARS-CoV-2的风险中，从而寻求对疾病的预防或治疗(例如，降低疾病严重程度或症状)。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于经口摄入，例如以片剂、胶囊剂、溶液/悬浮液、乳液、糊剂、粉末剂的形式，或以食品或饮料物品或其添加剂的形式。在一些实施方案中，所述组合物包含短链脂肪酸和L-异亮氨酸，或至少两种或更多种短链脂肪酸的组合，具有或不具有L-异亮氨酸。在一些实施方案中，所述组合物中的生理上可接受的赋形剂是淀粉、菊粉、燕麦麸、麦麸、纤维素、瓜尔胶或果胶。在一些实施方案中，特别是当组合物用于预防或治疗COVID-19时，组合物可以进一步包含已知有效抑制SARS-COV2并促进患者从COVID-19恢复的一种或多种药剂(例如，伊维菌素、维生素C、维生素D、槲皮素、褪黑激素、锌、阿奇霉素、羟基氯喹、氟伏沙明或氟西汀或其任何组合)。在一些实施方案中，所述细菌是产生丁酸的革兰氏阳性厌氧细菌。在一些实施方案中，所述细菌是普拉梭菌。在一些实施方案中，所述细菌是双歧杆菌属的物种，例如青春双歧杆菌或陪伴粪球菌。在一些情况下，所述细菌不包括青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的任一种，或者所述细菌不包括青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的两种或三种或更多种。

在第二方面，本发明提供了用于在受试者中提高免疫力、用于预防或治疗受试者的诸如COVID-19的病毒或细菌感染如、或用于减轻疾病症状或严重程度的试剂盒。所述试剂盒包括至少两个，可能更多的容器，每个容器含有包含有效量的一种或多种活性成分的组合物，所述活性成分可以是短链脂肪酸、L-异亮氨酸或表3中命名的化合物，或产生短链脂肪酸或L-异亮氨酸或所述化合物的细菌，或以上的任何组合。例如，第一和第二容器含有两种不同的组合物，所述两种不同的组合物包含两种不同的短链脂肪酸或产生相同或不同的短链脂肪酸的两种不同的细菌物种，例如产生丁酸的革兰氏阳性厌氧细菌。所述试剂盒可以进一步包括含有已知有效抑制SARS-COV2和促进患者从COVID-19恢复的一种或多种药剂(例如，伊维菌素、维生素C、维生素D、槲皮素、褪黑激素、锌、阿奇霉素、羟基氯喹、氟伏沙明或氟西汀或其任何组合)的额外容器。此外，用户说明手册可以包括在试剂盒中，用于说明试剂盒的适当使用。

附图的简要说明

图1.COVID-19患者(n＝55)的粪便样品收集和住院时间的示意图。“CoV”表示患有COVID-19的患者。“D0”表示患者的发病日期。

图2.COVID-19患者的功能性肠道微生物组谱的改变。a.COVID-19和非COVID-19个体中微生物功能途径的组成，其通过基于Bray-Curtis差异的NMDS(非度量多维标度)图观察。b.COVID-19和非COVID-19对照中微生物途径的丰富度，其基于Chao1指数进行评价。通过曼-惠特尼检验确定显著性的p值，并表示为***p<0.001。c.宿主因素对微生物途径组成的效应量。通过PERMANOVA分析确定效应量和统计学显著性。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

图3.微生物途径与COVID-19严重程度的关系。a.微生物途径与疾病严重程度呈显著负相关。b.微生物途径与疾病严重程度呈正相关。将患有COVID-19的患者分类为轻度患者(n＝40，包括具有轻度COVID-19症状的患者)和非轻度患者(n＝15，包括具有中度，重度和危重COVID-19症状的患者)。微生物途径的丰度与疾病严重程度之间的相关性通过微生物组多变量关联与线性模型2(MaAsLin2)来评估。

图4.粪便SCFA和L-异亮氨酸生物合成与血浆测定结果的相关性。a、b、c.血浆参数与疾病严重程度呈正相关。d、e、f.血浆参数与疾病严重程度呈负相关。通过MaASLin2测定相关性分析。轻度患者包括具有轻度COVID-19症状的患者，而非轻度患者包括具有中度，重度和危重COVID-19症状的患者。g.血浆参数与微生物途径的斯皮尔曼相关性。蓝色圆圈和正值表示正相关，红色圆圈和负值表示反相关。大小和阴影表示相关性的大小，其中较暗的阴影显示出比较亮的阴影更高的相关性。

图5.COVID-19恢复后，SCFA和L-异亮氨酸生物合成的的微生物功能受损延长。a.非COVID-19对照以及COVID-19患者在基线和出院后的微生物途径的组成，其通过基于Bray-Curtis差异的NMDS(非度量多维标度)图观察。通过PERMANOVA分析确定基线样品与出院后样品之间的统计学显著性。b.非COVID-19对照以及COVID-19患者中在基线和出院后的微生物途径的丰富度，其基于Chao1指数进行评价。通过曼-惠特尼检验确定显著性的p值，并表示为*p<0.05。c.汇总COVID-19患者出院后肠道微生物组功能性变化的热图。图左边的标记表示微生物途径，右边的标记表示这些微生物途径的亲代类别。具有较高相对丰度的途径被着色为红色，而具有低相对丰度的途径被着色为蓝色。模块1代表这样的微生物途径，其在COVID-19患者中在基线时富集，并且在出院后向非COVID-19对照返回。模块2代表这样的微生物途径，其在COVID-19患者中呈现减少并且在出院后向非COVID-19对照返回。模块3代表这样的微生物途径，其与非COVID-19对照相比在COVID-19的患者呈现减少，同时在出院后保持持续减少。

图6.COVID-19中SCFA和L-异亮氨酸的粪便浓度降低。a.COVID-19患者和非COVID-19对照中包括戊酸、丙酸、异戊酸、异丁酸、己酸、丁酸和乙酸的短链脂肪酸的粪便浓度。b.COVID-19患者和非COVID-19对照中L-异亮氨酸、尿素和L-精氨酸的粪便浓度。轻度患者包括具有轻度COVID-19症状的患者，而非轻度患者包括具有中度，重度和危重COVID-19症状的患者。通过韦尔奇t检验确定统计学显著性。COVID-19患者与非COVID-19对照的显著性差异表示为*p<0.05，非轻度患者与非COVID-19对照的显著性差异表示为#p<0.05，###p<0.01和###p<0.001。

图7.对照(n＝9)和合生元组(n＝22)的COVID-19患者在基线和第5周的血浆乙酸浓度的比较。通过配对威尔科克森符号秩检验分析血浆乙酸浓度变化的组间比较。说明了在基线和第5周来自相同患者的血浆乙酸浓度。来自同一患者的点用灰线连接。

图8.通过重复的测量相关性分析了血浆乙酸浓度与来自COVID-19患者鼻咽拭子的SARS-CoV-2病毒的实时RT-PCR的循环阈值(CT)的相关性。每个点代表来自每个样品的血浆乙酸浓度和CT值。来自同一患者的样品用相同的颜色表示。彩色线显示每名患者的重复的测量相关拟合。

图9.通过重复的测量相关性分析了来自COVID-19患者的血浆乙酸浓度与青春双歧杆菌和陪伴粪球菌的相对丰度之间的相关性。每个点代表来自每个样品的血浆乙酸浓度和青春双歧杆菌和陪伴粪球菌的相对丰度。来自同一患者的样品用相同的颜色表示。彩色线显示每名患者的重复测量相关拟合。

图10.通过重复的测量相关性分析了来自COVID-19患者的血浆乙酸浓度与未分类的拟杆菌属(Parabacteroides)、内脏臭气杆菌(Odoribacter splanchnicus)、未分类的嗜胆菌属(Bilophila)和沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)的相对丰度之间的相关性。每个点代表来自每个样品的血浆乙酸浓度与未分类的拟杆菌属、内脏臭气杆菌、未分类的嗜胆菌属和沃氏嗜胆菌的相对丰度。来自同一患者的样品用相同的颜色表示。彩色线显示每名患者的重复测量相关拟合。

图11.COVID-19基线和非COVID-19粪便样品中生物体对微生物途径的贡献。微生物的丰度基于相对对数表达(RLE)通过Deseq2归一化。

图12.火山图分析显示了接受SIM01组的COVID-19患者在第5周和基线之间血浆代谢物丰度的倍数变化。水平线描绘了统计学显著性的阈值，其中p<0.05，并且垂直线指示[log2倍变化]的阈值，其>1。具有标记的红点是指在SIM01组中显著上调但在对照组中没有显著上调的那些代谢物。

图13.通过非靶向代谢组学分析鉴定了在SIM01补充后显著上调的20种代谢物的丰度。

定义

“短链脂肪酸(SCFA)”是具有少于6个碳原子的脂肪酸。本文所用的SCFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和2-甲基丁酸以及它们的化学衍生物如盐、酯等。

本文所用的术语“SARS-CoV-2或严重急性呼吸综合症冠状病毒2”是指引起冠状病毒疾病2019(COVID-19)的病毒。它也被称为“COVID-19病毒”。

本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对受试者中的靶生物过程的任何可检测的负面影响，例如靶基因的RNA/蛋白表达、靶蛋白的生物活性、细胞信号转导、细胞增殖、生物体特别是微生物的存在/水平。通常，抑制反映在与对照比较时，靶过程、或上述的下游参数之一中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低。“抑制”还包括100％的降低，即完全消除、预防或清除靶生物过程或信号。其它相对术语如“抑制(suppressing)”、“抑制(suppression)”、“降低(reducing)”和“降低(reducion)”在本公开中以类似的方式使用，是指降低至不同的水平(例如，与对照水平相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低)直至完全消除靶生物过程或信号。另一方面，本公开中使用的术语如“活化(activate)”、“活化(activating)”、“活化(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促进(promote)”、“促进(promoting)”、“增强(enhance)”、“增强(enhancing)”或“增强(enhancement)”涵盖不同水平(例如，与对照水平相比，至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％，60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高，例如3、5、8、10、20倍的增加)的正向变化。

本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括解决疾病或病况的存在或后来发生此类疾病或病况的风险所采取的治疗性和预防性措施。其涵盖用于减轻进行中的症状、抑制或减缓疾病进展、延迟症状发作或消除或减少由此类疾病或病况引起的副作用的治疗性或预防性措施。本背景下的预防性措施及其变型不需要100％消除事件的发生；相反，它们是指抑制或降低这种发生的可能性或严重程度或延迟这种发生。

术语疾病的“严重程度”是指疾病发展对患有该疾病的患者的良好状态和健康造成不良影响的水平和程度，例如短期和长期的身体、精神和心理缺陷，直到并且包括患者的死亡。疾病的严重程度可以反映在必需的治疗性和维持措施的性质和数量，患者恢复所需的持续时间，可能的恢复程度，患者完全恢复的百分比，需要长期护理的患者的百分比，和死亡率中。

接受本发明的组合物或治疗方法的“患者”或“受试者”是任何年龄、性别和种族背景的人，通常是成年人，其可能未被诊断患有任何特定疾病或病症但需要增强免疫力(例如，处于病毒或细菌感染的风险中)，或其已经被诊断患有涉及诸如COVID-19的病毒或细菌感染的疾病或病症，表现出一种或多种相关的症状，或其已经被诊断为涉及病毒或细菌感染(例如COVID-19)的这样的疾病或病症并且已经基本上从该疾病中恢复，当仍持续经历残留的症状(例如乏力、头痛、恶心、头晕、肌肉或关节痛或一般虚弱)持续长期的时间段(例如在疾病的活动阶段结束后至少4周，即，如阴性核酸/PCR测试所示，不再检测到病毒或细菌病原体的存在)。通常，接受根据本发明方法的治疗以提高免疫力的患者或受试者除此以外不需要用相同的治疗剂进行治疗。例如，如果COVID-19患者正在接受根据所要求保护的方法的治疗，则该患者未患有被相同的治疗剂治疗的与COVID-19无关的另一种疾病(例如，心血管疾病、糖尿病、胃肠病症和疾病，例如炎性肠病(IBD)、肠易激综合症(IBS)或通过丁酸可治疗的结肠炎)。尽管患者可以是任何年龄的，但在一些情况下，患者是至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85岁；在一些情况下，患者可以是40至45岁，或50至65岁，或65至85岁。

本文所用的术语“有效量”是指施用物质产生治疗效果的量。所述效果包括预防，校正或抑制疾病/病况和相关并发症的症状进展至任何可检测的程度，例如病毒或细菌感染和相关病症(例如COVID-19)的一种或多种症状。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical DosageForms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(1999)；和Pickar,Dosage Calculations(1999))。

术语“约”在用于提及给定值时表示涵盖该值的±10％的范围。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”赋形剂是这样的物质，其不是生物有害的或在其他方面不需要的，即赋形剂可以与生物活性剂一起施用于个体而不引起任何不需要的生物效应。赋形剂也不会以有害的方式与其中包含赋形剂的组合物的任何组分相互作用。

术语“赋形剂”是指可存在于本发明组合物的最终剂型中的任何本质上辅助的物质。例如，术语“赋形剂”包括媒介物、粘合剂、崩解剂、填充剂(稀释剂)、润滑剂、助流剂(流动增强剂)、压缩助剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、悬浮剂/分散剂、成膜剂/包衣剂、调味剂和印刷油墨。

术语“抗细菌剂”是指能够抑制、阻抑或防止细菌物种的生长或增殖的任何物质。具有抗细菌活性的已知药剂包括通常阻抑广谱细菌物种增殖的各种抗生素，以及可抑制特定细菌物种增殖的药剂，例如反义寡核苷酸、小抑制RNA等。术语“抗细菌剂”类似地定义为包括具有杀死几乎所有细菌物种的广谱活性的药剂和特异性阻抑靶细菌增殖的药剂。

当在描述含有活性成分的组合物的上下文中使用时，术语“基本上由....组成”是指这样的事实，组合物不含有具有活性成分的任何类似或相关生物活性或能够增强或阻抑活性的其它成分，而一种或多种非活性成分如生理上或药学上可接受的赋形剂可存在于组合物中。例如，基本上由有效治疗疾病如COVID-19或减轻疾病严重程度的药剂(例如，SCFA或L-异亮氨酸或表3中所示的一种或多种化合物)组成的组合物是不含有任何其他药剂的组合物，所述其他药剂可对相同病症(例如，COVID-19)具有任何可检测的预防或治疗作用或可增强或降低所述活性成分对所述病症的预防或治疗作用。

发明的详细描述

I.引言

SARS-CoV-2感染与改变的肠道微生物群组成有关。在SARS-CoV-2感染中，参与短链脂肪酸代谢的肠道细菌的系统发育组呈现减少。本研究旨在表征COVID-19患者在疾病消退前后肠道微生物组的功能谱。对来自具有COVID-19的55例未用抗生素的患者和70例非COVID-19对照的粪便样品进行鸟枪宏基因组测序。在住院期间和直到清除SARS-CoV-2病毒1个月后收集连续的粪便样品(多达6个时间点)。结合疾病严重程度和血液免疫和炎性标志物来评估粪便微生物途径。还测定了疾病消退前后粪便样品中微生物功能的变化，并使用代谢物靶分析来验证这些功能。

与非COVID-19对照相比，COVID-19患者显示出肠道微生物组功能的显著变化(p<0.05)，其特征在于用于短链脂肪酸(SCFA)或L-异亮氨酸生物合成的肠道微生物组的能力受损和尿素产生的能力增强。代谢物靶分析显示COVID-19患者的粪便样品中SCFA和L-异亮氨酸的显著较低的粪便浓度。在COVID-19患者中，粪便样品中受损的SCFA和L-异亮氨酸生物合成在恢复后长达1个月持续。SCFA和L-异亮氨酸生物合成的缺乏和尿素产生的增加与疾病严重程度和血浆CXCL-10浓度，血小板计数，白蛋白和血红蛋白水平显著相关(均p<0.05)。

COVID-19患者的肠道微生物组表现出受损的SCFA和L-异亮氨酸生物合成能力，其甚至在疾病消退后持续。这两种微生物功能与宿主免疫应答相关，这强调了肠道微生物功能在SARS-CoV-2感染发病机理和结果中的重要性。

除对SCFA和L-异亮氨酸的有益作用外，本研究还揭示了对L-1,2-丙二醇降解，双歧杆菌分流(shunt)或4-脱氧-L-苏型-己-4-烯吡喃醛酸盐(酯)(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranuronate)的有益作用，以及对尿素循环途径的负面作用。这些发现转化为施用SCFA(例如乙酸、丙酸、丁酸/异丁酸、戊酸/异戊酸和己酸)或L-异亮氨酸(包括产生SCFA或L-异亮氨酸的细菌)，增强L-1,2-丙二醇降解，双歧杆菌分流或4-脱氧-L-苏型-己-4-烯吡喃醛酸盐(酯)的化合物，或抑制、阻抑或破坏患者的脲素循环途径的用于增强免疫力，例如用于预防、治疗或改善从COVID-19的恢复的化合物。

II.药物组合物和施用

本发明还提供了药物组合物，其包含有效量的短链脂肪酸(SCFA)、L-异亮氨酸、表3中所示的代谢物中的任一种、或产生SCFA或L-异亮氨酸或表3的代谢物的细菌，所述细菌在预防性和/或预防性应用中用于增强人的免疫力或用于降低涉及病毒或细菌感染的疾病的风险，治疗这种疾病或病症(包括降低疾病严重程度和促进恢复)，例如COVID-19。本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明的合适制剂可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

本发明的药物组合物可以通过各种途径施用，例如通过经口摄入的全身施用或使用直肠栓剂的局部递送。施用药物组合物的优选途径是对于70kg的成年人每天以约0.1-20、约0.14-14g、约0.5-5g、约1-3g，例如约1-2或约1.4g的SCFA或L-异亮氨酸或代谢物的日剂量，或能够产生等量的SCFA或L-异亮氨酸或代谢物的活细菌经口施用。合适的剂量可以以单一日剂量或以合适的间隔提供的分开的剂量，例如以每天两次，三次，四次或更多次的亚剂量施用。

为了制备含有SCFA、L-异亮氨酸，表3中所示的任何一种化合物或产生SCFA或L-异亮氨酸或表3中所示的化合物的细菌菌株或其任何组合的药物组合物，使用一种或多种惰性和药学上可接受的载体。药物载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括，例如，粉末剂、片剂、可分散颗粒、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。固体载体可以是一种或多种还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质；它也可以是封装材料。

在粉末剂中，载体通常是精细分散的固体，其与精细分散的活性组分例如SCFA如丁酸或产生SCFA的革兰氏阳性厌氧细菌菌株混合。在片剂中，将活性成分与具有所需结合特性的载体以合适的比例混合，并压制成所需的形状和大小。

为了制备栓剂形式的药物组合物，首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物熔化，并通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔化的均质混合物倒入合适尺寸的模具中并使其冷却和固化。

粉末剂和片剂优选含有约5重量％至约70重量％的活性成分(例如，一种或多种SCFA，例如丁酸或产生至少一种SCFA的革兰氏阳性厌氧细菌菌株)。合适的载体包括，例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。

药物组合物可以包括活性成分的制剂，例如，一种或多种SCFA，例如丁酸或L-异亮氨酸、表3中的代谢物或能够产生至少一种SCFA、L-异亮氨酸、表3的代谢物或其任何组合的革兰氏阳性厌氧细菌菌株，其中封装材料作为载体提供胶囊，其中活性成分(具有或不具有其他载体)被载体包围，使得载体因此与活性成分关联。以类似的方式，也可以包括囊剂。片剂、粉末剂、囊剂和胶囊剂可用作适于经口施用的固体剂型。

液体药物组合物包括，例如，适于经口施用或局部递送的溶液，悬浮液和适于经口施用的乳剂。活性组分(例如，一种或多种SCFA，例如丁酸，或L-异亮氨酸，或表3中命名的代谢物，或能够产生至少一种SCFA,L-异亮氨酸或所述代谢物的革兰氏阳性厌氧细菌菌株)的无菌水溶液或活性组分在包括水，缓冲水，盐水，PBS，乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适于直肠施用的液体或半液体组合物的实例。所述组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。

无菌溶液可以通过将活性组分(例如，一种或多种SCFA或L-异亮氨酸或表3中所示的化合物)溶解在期望的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜滤器以对其进行灭菌，或可选地，通过在无菌条件下将无菌活性组分溶解在先前灭菌的溶剂中来制备。可以将所得水溶液包装以原样使用，或冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水性载体组合。制剂的pH通常为3-11，更优选5-9，最优选7-8。

含有活性剂的药物组合物可被施用以用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，将组合物以足以预防、治愈、逆转或至少部分减缓或阻止病况及其并发症的症状的量施用于已经患有由病毒或细菌感染例如COVID-19引起的疾病或病症的患者。足以实现此目的的量定义为“治疗有效剂量”。有效用于该用途的量将取决于疾病或病况的严重程度和患者的体重和一般状态，但通常对于70kg的患者为每天约0.05g至约5g的活性剂(例如，SCFA或L-异亮氨酸或表3中所示的化合物中的任一种，或能够产生它们的细菌菌株)，更常用的是对于70kg的患者，剂量为每天约0.05g至约1g的活性剂。

在预防性应用中，将含有活性剂的药物组合物以足以推迟或预防症状发作的量施用于易感由病毒或细菌感染(例如COVID-19)引起的疾病或病症的患者或除此之外处于由病毒或细菌感染(例如COVID-19)引起的疾病或病症的风险中的患者。这样的量定义为“预防有效剂量”。在这种使用中，活性剂的精确量再次取决于患者的健康状态和体重，但对于70kg患者/天，通常为约0.05g至约5g的活性剂，对于70kg患者/天，更通常为约10mg至约1g。

组合物的单次或多次施用可以由治疗医师选择剂量水平和模式来进行。在任何事件中，药物制剂应提供足以有效治疗性地或预防性地改善、减轻或逆转患者的相关症状或延迟症状发作的量的活性剂。

III.其他治疗剂

其他已知的一种或多种治疗剂可以与在本发明的实践中的活性剂(例如SCFA、L-异亮氨酸、表3中所示的一种或多种化合物或能够产生SCFA或L-异亮氨酸或所述化合物的活细菌菌株)组合使用，以用于预防病毒或细菌感染(例如COVID-19)引起的疾病或病症、降低其风险、治疗、降低其严重程度和促进从其恢复。在预防性或治疗性应用中，这些先前已知的治疗剂中的一种或多种可以与有效量的活性剂一起在单一组合物中或分别在两种或多种不同组合物中同时给予患者。

例如，已知有效用于预防或治疗COVID-19的药物和补充剂包括伊维菌素、维生素C、维生素D、褪黑激素、槲皮素、锌、羟基氯喹、氟西汀或氟伏沙明，以及一种或多种抗生素如阿奇霉素或强力霉素，可以与一种或多种细菌如青春双歧杆菌或陪伴粪球菌的组合一起使用。然而，在一些情况下，所述组合物不包括青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的任一种，或不包括青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌中的任两种、三种或更多种。它们可以与本发明的活性剂组合使用，以降低个体的SARS-COV2感染风险和通过降低疾病严重程度(包括发病率和死亡率)，减轻疾病的一种或多种症状，以及促进从该疾病的恢复来治疗COVID。特别地，锌、羟基氯喹和阿奇霉素/强力霉素的组合以及伊维菌素、维生素C、维生素D、褪黑激素、槲皮素和锌的组合在COVID预防和治疗中都表现出高功效。因此，这些已知的药物/补充剂组合可以与SCFA、L-异亮氨酸，表3中所示的一种或多种代谢物，或能够产生SCFA或L-异亮氨酸或所述代谢物的活细菌细胞的活性剂一起用于本发明的方法中。

两种示例性组合物分别包含(1)SCFA、L-异亮氨酸、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌(任选地与低聚木糖、低聚果糖和抗性糊精一起)；和(2)醋酸锌、醋酸钙、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、低聚果糖，麦芽糖糊精。

IV.试剂盒

本发明还提供了根据本文公开的方法提高个体免疫力或治疗感染性疾病如COVID-19的试剂盒。所述试剂盒通常包括多个容器，每个容器包含含有SCFA、L-异亮氨酸或能够产生SCFA或L-异亮氨酸的活细菌菌株或其组合的组合物。任选地，提供这样的组合物的另外的容器可以包括在试剂盒中，所述组合物包含另一种治疗有效的化合物或已知有效用于预防和/或治疗疾病，包括改善症状和减轻疾病的严重程度，以及促进从该疾病恢复(例如在上一节中描述的或相关技术领域中已知的那些)的化合物的组合。在试剂盒的一些变型中，单一容器可包含药物组合物，其包含两种或更多种有效治疗疾病(例如，COVID-19)的成分，例如SCFA、L-异亮氨酸或能够产生SCFA或L-异亮氨酸加上上一部分中所述的或相关研究领域中已知的那些的活细菌菌株。试剂盒可以进一步包括提供关于如何分配药物组合物的说明的信息材料，包括对可以治疗的患者的类型的描述(例如，已经接受感染性疾病(例如，COVID-19)的诊断或已经被认为具有感染该疾病的高风险的人类患者，例如，由于具有风险职业，例如医疗护理)，以及不包括在所要求保护的方法中的患者的类型(例如，患有胃肠疾病如炎性肠病、肠易激综合症或结肠炎的那些)、施用剂量、频率和方式等。

实施例

以下实施例仅以说明的方式提供，而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可改变或修改以产生基本上相同或类似结果的各种非关键参数。

实施例1：与COVID-19相关的途径和代谢物

引言

由严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒疾病(COVID-19)主要感染呼吸系统，但也影响其它器官，包括胃肠道(GI)道

已知肠道微生物群调节对呼吸道病毒感染的宿主免疫应答

重要的微生物活性是肠道微生物群的整个群落的累积功能的反映，并且该群落的平衡及其输出决定了对健康或疾病的净贡献

在本研究中，对55例具有COVID-19的未用抗生素治疗的患者进行了前瞻性调查，并从入院随访直至出院后30天。利用宏基因组和代谢组学分析，表征了肠道微生物组功能的变化和纵向动态与疾病严重程度和免疫应答的关系。使用靶向代谢组学分析进一步验证该发现以检查粪便微生物代谢物的改变。

方法

受试者招募和样品收集

本研究由临床研究伦理委员会(参考号2020.076)批准，并且所有患者提供了书面知情同意书。如先前的研究所述

粪便DNA提取

在Zuo等人中描述了详细的方法

鸟枪宏基因组学测序和剖析

使用Nextera DNA Flex Library Prep Kit(Illumina,California USA)从提取的DNA制备测序文库，并在位于香港中文大学的肠道微生物群研究中心的IlluminaNovaSeq 6000系统上测序。每个样品获得平均2600±330万个读数(6G数据)，3200±460万个读数。

如下使用Trimmomatic v0.36过滤并品质修整原始序列读数

使用humann2 v0.11.1从真菌富集DNA(Franzosa,2018#6)的宏基因组中提取细菌分类群和功能组成的图谱

血浆细胞因子测量

在抗凝剂处理的管中收集的全血样品以2000x g离心10分钟并收集上清液。细胞因子趋化因子的浓度使用MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic BeadPanel-Immunology Multiplex Assay(Merck Millipore,Massachusetts USA)在Bio-Plex200系统(Bio-rad laboratories,California,USA)上测量。使用人NT-proBNP ELISA试剂盒(Abcam,Cambridge,UK)测量NT-proBNP的浓度。

对粪便代谢物的定量

通过GC-MS/MS分析检测短链脂肪酸(SCFA)，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸。使用了Agilent 7890B气相色谱仪与具有DB-5MS柱的7000D质谱仪(30m长×0.25mm i.d.×0.25μm膜厚度，J&W Scientific,USA)。以1.2mL/min的流速使用氦作为载气。以无分流模式进行注射，并且注射体积为2μL。将烘箱温度在90℃保持1分钟，以25℃/min的速率升高至100℃，以20℃/min的速率升高至150℃，并在150℃保持0.6分钟，以25℃/min的速率进一步升高至200℃，在200℃下保持0.5分钟。在运行3分钟后，以多反应监测模式分析所有样品。注射器入口和输送管线的温度分别保持在200℃和230℃。

通过LC-MS分析检测L-异亮氨酸、尿素和L-精氨酸。LC-ESI-MS/MS系统(UPLC,ExionLC AD，网站：sciex.com.cn/；MS，

统计学分析

将关于细菌分类群的丰度和功能的数据输入Rv3.5.1。细菌分类群的数据通过总和标度(TSS)归一化，并且关于功能性的数据通过Deseq2(v1.26.0)基于相对对数表达(RLE)归一化。使用vegan程序包(v2.5-3)基于Bray-Curtis差异进行非度量多维标度(NMDS)分析。使用Deseq2(v 1.26.0)鉴定COVID-19患者和非COVID-19对照之间的不同微生物功能途径。使用在Huttenhower Lab Galaxy实例(网站：huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)中实施的多变量线性分析模型(MaAsLin)统计框架来鉴定微生物途径与疾病严重程度的关联。应用cor和cor.test功能评价微生物途径与患者血浆参数之间的斯皮尔曼相关性。使用pheatmap程序包(v1.0.10)产生热图。

资料可用性

在BioProject登记号PRJNA689961下的Sequence Read Archive中可获得为本研究产生的原始序列资料。

结果

COVID-19患者的临床特征

招募了55例实验室确诊为SARS-CoV-2感染的住院患者[28例男性；平均值±标准误差(s.e.),28.8±0.3岁]和70例对照。人口统计，临床特征和粪便收集时间表示于表1和图1中。COVID-19患者的中位数住院时间为27天(IQR，4-45天)。18名患者在出院后随访长达1个月[中位数(IQR)，21(14.5-23.6)天]。所有患者都未用抗生素，并且14例(25.4％)接受了至少一种抗病毒药物。入院时17例(30.9％)患者出现发热，5例(9.1％)患者出现腹泻，24例(43.6％)患者出现呼吸症状。根据COVID-19严重程度分级标准

表1研究受试者的临床特征

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a

b

COVID-19患者的功能性肠道微生物组改变

为了解SARS-CoV-2感染如何影响COVID-19患者肠道微生物组的功能，从粪便宏基因组中提取了功能谱，包括基因丰度及其对应的途径。首先研究COVID-19患者和非COVID-19对照在基线处的微生物途径的组成(在入院后收集的第一粪便样品)。非度量多维标度(NMDS)分析显示COVID-19患者中微生物途径的组成与非COVID-19对照显著不同(图2a,PERMANOVA检验，p<0.001)。在所有检查的宿主因素(年龄，性别，共病，COVID-19疾病严重程度，粪便SARS-CoV-2病毒载量和抗病毒药物)中，SARS-CoV-2感染和COVID-19疾病严重程度均显著影响肠道微生物群的组成，其中COVID-19疾病严重程度显示最大的效应量(R2＝0.052,p<0.05,PERMANOVA检验，图2c)。此外，与非COVID-19对照相比，COVID-19患者在其粪便中显示出显著较低的微生物途径丰富度(图2b,p<0.01)。这些结果表明SARS-COV-2感染与肠道微生物组的功能谱改变有关。

有益微生物功能的减少及其与COVID-19严重程度的关联

接下来询问哪种微生物功能主要驱动COVID-19患者和对照的差异。通过DESeq2进行的差异分析表明，与非COVID-19对照相比，COVID-19患者在基线处的粪便样品中，28条微生物途径呈现减少，11条途径呈现富集(表2,FDR<0.05)。在患有COVID-19的患者中，28条呈现减少的途径中有10条与碳水化合物降解有关，这表明SARS-CoV-2感染的肠道微生物组降解碳水化合物的能力受损。与非COVID-19对照相比，在COVID-19患者中，参与丙酸和乙酸的生物合成的L-1,2-丙二醇降解和双歧杆菌分流途径分别减少了5.6和2.9倍(表2)。相比之下，在患有COVID-19的患者中，尿素循环途径的丰度比对照高1.9倍。这些数据表明，COVID-19患者表现出短链脂肪酸产生能力受损，并表现出尿素生物合成能力增强。然后通过MaAsLin2分析将39种不同的途径与COVID-19疾病严重程度相关联。包括4-脱氧-L-苏型-己-4-烯吡喃醛酸盐(酯)降解，L-异亮氨酸生物合成III和来自钴啉醇酰胺I途径的腺苷钴胺素补救在内的三种途径显示出与COVID-19严重程度的显著负相关(图3a,FDR q<0.05)，而L-赖氨酸生物合成III，辫苷生物合成，尿素循环，preQ0生物合成和磷酸泛酸生物合成I显示与COVID-19严重程度的显著正相关(图3b,FDR q<0.05)。其中，4-脱氧-L-苏型-己-4-烯吡喃醛酸盐(酯)降解途径与丙酮酸的产生有关，丙酮酸是短链脂肪酸发酵的关键代谢物

表2在COVID-19患者和对照中差异表达的途径

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粪便SCFA与L-异亮氨酸生物合成与血浆测量结果的相关性

SARS-CoV-2感染可以在COVID-19患者的子集中诱导功能障碍的免疫应答和因此的细胞因子风暴综合症，导致更重度的疾病结果

已知肠道微生物群调节宿主中先天和适应性免疫系统的发育和功能

为了探索在恢复后的患者中肠道微生物组的功能是否恢复，从19例患者中收集出院后的粪便样品(出院后天数，中位数(IQR)，21(16-23.5)天)(图1)。非度量多维标度(NMDS)分析表明，COVID-19患者在恢复后的微生物途径的组成似乎远离患者的基线样品聚簇(p<0.05，基线样品对比出院后样品，PERMANOVA)，并变得与非COVID-19对照相当(图5a)。类似地，与基线相比，COVID-19患者出院后的微生物途径的丰富度更高，并且显示出与非COVID-19对照相当的水平(图5b)。这些数据表明肠道微生物组的整体功能可以在疾病消退后恢复。研究在疾病消退后COVID-19患者中是否恢复了不同的微生物功能途径(显示在表2中)。在COVID-19基线微生物组中表现不足的16种微生物途径在疾病消退后表现出持续的减少(图5c)。有趣的是，这些途径中的62.5％(16条中有10条)参与碳水化合物降解，表明COVID-19患者显示出对碳水化合物降解的微生物功能的持续损害。此外，即使在疾病消退后，参与SCFA和L-异亮氨酸的双歧杆菌分流，L-1,2-丙二醇降解，4-脱氧-L-苏型-己-4-烯吡喃醛酸盐(酯)降解和L-异亮氨酸生物合成III仍呈现减少，表明在COVID-19患者中SCFA生物合成和L-异亮氨酸生物合成的能力持续受损。这些数据表明患者的肠道微生物组功能在COVID-19消退后仅部分恢复，而几种特定的微生物功能仍然持续受损。

COVID-19中SCFA和L-异亮氨酸的粪便浓度降低

粪便代谢组提供微生物活性的功能性读出，并且可用作介导宿主-微生物组相互作用的介质

对哪些细菌物种对这些微生物途径的变化贡献最大进行了检验。没有一条途径由任何单一物种支配，这表明这些途径的改变可能由它们的功能的群落水平改变引起(图11)。值得注意的是，细菌普拉梭菌是4-脱氧-L-苏型-己-4-烯吡喃醛酸盐(酯)降解途径和L-异亮氨酸生物合成III(图11c和d)两者的主要贡献者，这表明普拉梭菌在对抗SARS-CoV-2感染中可能具有有益的作用。

讨论

在本项研究中，首次表明COVID-19患者在肠道微生物功能方面具有显著的改变，其具有受损的短链脂肪酸(SCFA)产生能力。由于微生物群落组成中存在显著的个体间差异，因此描述微生物功能或代谢物在理解它们对疾病发病机理的贡献中是重要的。SCFA，包括丁酸盐，以及丙酸盐和乙酸盐，可以通过启动抗炎免疫细胞和抑制炎症信号传导途径发挥抗炎作用

在氨基酸消化和吸收过程中，肠道微生物群也在操纵氨基酸库和谱中起关键作用，从而介导宿主的生理方面

此外，已知肠道微生物群依赖性尿素代谢与宿主尿素平衡相关，并参与疾病进展

本研究具有几个优点。受试者都没有用抗生素(已知其影响微生物组)，并且用连续的粪便样品收集随访直到出院之后。特别引人注目的发现是人的肠道微生物功能的明显特征(即受损的SCFA)在病毒清除后持续存在，并且这些变化可能有助于所谓的“长COVID”的症状，包括乏力和肌肉无力。尽管这仍然是推测性的，但它需要进一步的研究。由于SCFA和L-异亮氨酸的产生受膳食纤维和蛋白质的影响，在住院期间收集患者的饮食记录以消除饮食的影响。所有患者均接受医院提供的标准医院饮食，这符合中国香港常用的习惯性饮食。因此，饮食中的显著变化或改变不太可能影响该发现。

总之，本研究表明，在COVID-19中，肠道微生物功能受到扰动，包括SCAF和L-异亮氨酸生物合成降低和尿素产生增加。它强调肠道微生物组功能受损与COVID-19严重程度之间的相关性。需要进一步的研究来更好地理解受损的肠道微生物功能如何参与炎症和疾病结果，以及探索微生物功能产物和代谢物对抗COVID-19的治疗潜能。

实施例2：与COVID-19相关的短链脂肪酸

方法

受试者招募和样品收集

本试验性研究包括除了标准护理外还接受合生元配方的合生元组的25名受试者以及仅接受标准护理的对照组(对照)的10名受试者。从2020年8月13日至2020年10月9日，在香港韦尔斯亲王医院招募了18岁或以上的住院患者，其基于阳性逆转录酶聚合酶链反应(PCR)试验确认了SARS-CoV-2感染的诊断。进入重症监护病房或使用呼吸机，已知有活动性心内膜炎病史，在进行血液透析，或在募集时怀孕的受试者被排除。排除由于免疫抑制而具有已知增加的感染风险的受试者，例如先前器官或造血干细胞移植、中性粒细胞减少症(ANC<500个细胞/μl)或HIV和CD4<200个细胞/μl。本研究中使用的合生元配方含有双歧杆菌菌株(250亿个CFU/胶囊)和益生元(低聚半乳糖、低聚木糖、抗性糊精)的混合物，并且以两次相等的剂量(每天两次4个胶囊)施用。在韦尔斯亲王医院内部制备胶囊剂，并由我们的中心临床研究药房(Clinical Research Pharmacy)分配。根据两个独立的健康中国人宏基因组数据集(N＝1400)中与COVID-19减少的细菌物种的正相关性，得到选择用于该配方的益生菌物种，并且在100例COVID-19患者的宏基因组数据中进一步验证

粪便DNA提取和鸟枪宏基因组测序和剖析

与实施例1中所述的方法相同。

血浆中短链脂肪酸(SCFA)的靶向检测

将50μl灭活血浆样品加入到含有100μL磷酸(36％v/v)溶液的1.5mL EP管中。将混合物涡旋3分钟。加入150μL MTBE(含有内参)溶液，然后涡旋3分钟，并在冰上超声5分钟。然后，将混合物在4℃下以12000r/min离心10分钟。收集上清液，并用于6种SCFA(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸)的气相色谱-质谱(GC-MS/MS)分析。Agilent 7890B气相色谱仪与具有DB-5MS柱的7000D质谱仪(30m长×0.25mm i.d.使用×0.25μm膜厚度，J&WScientific，USA)用于进行糖的GC-MS/MS分析。以1.2mL/min的流速使用氦作为载气。以无分流模式进行注射，并且注射体积为2μL。将烘箱温度在90℃下保持1min，以25℃/min的速率升高至100℃，以20℃/min的速率升高至150℃，保持0.6min，以25℃/min的速率升高至200℃，在运行3min后保持0.5min。以多反应监测模式分析所有样品。注射器入口和输送管线温度分别为200℃和230℃。

鼻咽拭子中SARS-CoV-2病毒载量的检测

用实时RT-PCR测定测量鼻咽拭子的SARS-CoV-2病毒载量。用QIAamp Viral RNAMini Kit(Qiagen,Hilden，Germany)从鼻咽拭子样品中提取病毒RNA。用实时RT-PCR定量SARS-CoV-2RNA。从Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)购买了由美国疾病控制及预防中心(US Centers for Disease Control and Prevention)设计的引物-探针组N1(2019-nCoV_N1-F：5’-GAC CCC AAA ATC AGC GAA AT-3’，2019-nCoV_N1-R：5’-TCT GGTTAC TGC CAG TTG AAT CTG-3’和2019-nCoV_N1-P：5’-FAM-ACC CCG CAT TAC GTT TGGACC-BHQ1-3’)。1步实时RT-PCR反应含有10μL提取的制剂，4μLTaqMan Fast Virus 1-StepMaster Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)，最终反应体积为20μL。引物和探针浓度分别为0.5μM和0.125μM。用StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)进行循环条件，25℃2分钟，50℃15分钟，95℃2分钟，随后进行45个循环的95℃15秒和55℃30秒。

细胞因子测量

在室温(RT)下以1,500xg离心全血10分钟而不用制动后收集血浆样品。使用Custom Premix Human Cyto Panel A 47Plex(Millipore,#HCYTA-60K-47C)测量血浆中细胞因子和趋化因子的浓度。在第一次解冻时测量所有样品。

血浆代谢物的非靶向测量

对于非靶向代谢物测量，加入50μL血浆和300μL纯甲醇。将混合物涡旋3分钟并在4℃下以12,000rpm离心10分钟。然后收集上清液并在4℃下以12,000rpm离心5分钟。离心后，将混合物在-20℃冷冻30分钟，然后在4℃以12000r/min离心3分钟。使用150μL上清液进行板上分析。使用LC-ESI-MS/MS系统分析样品提取物。使用三重TOF质谱仪在信息依赖的基础上获得MS/MS光谱。

统计学分析

使用成对威尔科克森符号秩检验比较来自不同时间点的SCFA、IL-6和代谢物的浓度。分别用R中的Hmim和rmcorr程序包，通过重复的测量相关性，来评估SARS-COV-2的细菌相对丰度或CT值和SCFA的纵向相关性以及IL-6和代谢物的相关性。使用ggplot2或corr程序包可视化所有的图。

结果

评价乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸的血浆浓度。其中，在治疗后，合生元组中的乙酸浓度显著增加(p<0.001)，而在对照组中则没有(p＝0.65)(图7)。通过重复的测量相关分析表明，鼻咽拭子中SARS-CoV-2的循环阈值(CT)与血浆乙酸浓度呈正相关(R＝0.48,p＝0.046)，这表明血浆乙酸浓度与病毒载量呈负相关(图8)。合生元治疗后，合生元组的患者中11种物种的相对丰度发生明显变化。其中，青春双歧杆菌和陪伴粪球菌的相对丰度与血浆乙酸的浓度呈正相关(图9)，而未分类的拟杆菌属、内脏臭气杆菌、未分类的嗜胆菌属和沃氏嗜胆菌的相对丰度与血浆乙酸的浓度呈负相关(图10)。

对来自SIM01组中的所有25名受试者和对照组中的10名受试者的血浆样品进行非靶向代谢组分析。鉴定了总共743种具有鉴定信息的化合物，其中20种化合物在SIM01组中上调，但在对照组中没有上调(图12、13)。在这些SIM01相关的代谢物中，其中的15种与SIM01组中的IL-6呈显著负相关(表3)。IL-6是一种促炎性细胞因子，其可导致与COVID-19的严重程度呈正相关的高炎症反应。因此，表3中所列的一种或多种化合物的补充可有益于减轻COVID-19症状并预防COVID-19患者的重症。

表3在接受SIM01的患者中与IL-6呈负相关的代谢物

本申请中引用的所有专利，专利申请和其它出版物，包括GenBank登录号和等同物，出于所有目的通过引用整体并入本文。

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