has-miR-548a-3p在制备辅助诊断毒性心肌炎产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种has-miR-548a-3p在制备辅助诊断毒性心肌炎产品中的应用。

背景技术

心肌炎是心肌的炎性疾病，病毒感染为最常见原因，其临床表现各异，轻症者多表现为胸闷、胸痛、心悸等不适，严重者可引起心功能不全、心律失常，而重症心肌炎可引起心源性休克甚至猝死。重症心肌炎死亡率较高，约为70％-80％。重度病毒性心肌炎，病情凶险，死亡率极高，及时积极的治疗，病程也能长达一个月甚至数年。其发病比较迅速，如治疗不及时，则治疗效果较差，预后不良。

但病毒性心肌炎的临床诊断难度较大，传统诊断方法包括病史、心电图、血清标志物、心脏超声及心脏核磁缺乏敏感性及特异性；确诊需进行心内膜心肌活检，但由于其有创性，临床应用严重受限。因此亟待寻找具有高特异性、敏感性且无创的病毒性心肌炎检测方法。

循环中游离的miRNA含量较少且不稳定，易被核糖核酸酶分解，游离miRNA作为稳定诊断标志物及治疗手段的前景并不明确；然而，外泌体是一种细胞外囊泡，由脂质双分子层构成外壳，内部包含多种蛋白质及核酸成分，几乎由体内所有细胞分泌并存在于全身多种体液中；外泌体脂质双分子层可以保护内部的蛋白质和核酸，使其免于降解，在循环中稳定存在；因此，若根据这类外泌体miRNA设计针对于病毒性心肌炎的诊断试剂盒，有助于推动心肌炎的诊治水平，也为心肌炎的进一步研究提供新的思路。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于血浆外泌体的has-miR-548a-3p在制备辅助诊断毒性心肌炎产品中的应用，本发明所述has-miR-548a-3p在病毒性心肌炎患者的血浆外泌体中表达量显著提高，因此，通过检测所述has-miR-548a-3p能够实现病毒性心肌炎的辅助诊断。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种来源于血浆外泌体的has-miR-548a-3p在制备辅助诊断毒性心肌炎产品中的应用，所述has-miR-548a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述产品为生物制剂或试剂盒。

本发明第二方面提供了一种用于辅助诊断毒性心肌炎的试剂盒，所述用于辅助诊断毒性心肌炎的试剂盒包括识别所述has-miR-548a-3p的标记物。

优选地，所述标记物为所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物或结合所述has-miR-548a-3p的生物大分子。

优选地，所述生物大分子包括抗体、抗体功能片段、RNA结合蛋白和RNA结合蛋白功能片段。

优选地，所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物的引物序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明第三方面提供了一种用于辅助诊断毒性心肌炎的生物制剂，所述用于辅助诊断毒性心肌炎的生物制剂包括识别所述has-miR-548a-3p的标记物。

优选地，所述标记物为所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物或结合所述has-miR-548a-3p的生物大分子。

优选地，所述生物大分子包括抗体、抗体功能片段、RNA结合蛋白和RNA结合蛋白功能片段。

优选地，所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物的引物序列如SEQ ID NO：2所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

本发明通过对病毒性心肌炎患者及健康对照组血浆外泌体中has-miR-548a-3p表达量检测，发现has-miR-548a-3p的表达量显著提高，因此通过检测所述has-miR-548a-3p的表达量，能够实现对病毒性心肌炎的辅助诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例1中RNA测序得出的外泌体miRNA的表达差异情况；

图2是本发明实施例2中qRT-PCR验证6种miRNA的差异表达结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

本发明实施例提供了一种has-miR-548a-3p在制备辅助诊断毒性心肌炎产品中的应用，所述has-miR-548a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体地，其5’端到3’端的序列为：CAAAACUGGCAAUUACUUUUGC。

在本发明中，对上述产品的类型不作具体限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，在一实施方式中，上述产品类型可以为生物制剂，在其他实施方式中，上述产品类型也可以为试剂盒。

本发明另一实施例提供了一种用于辅助诊断毒性心肌炎的试剂盒，所述用于辅助诊断毒性心肌炎的试剂盒包括识别所述has-miR-548a-3p的标记物。

通过识别所述has-miR-548a-3p的标记物对所述has-miR-548a-3p进行识别，实现对所述has-miR-548a-3p表达量的检测，进而能够根据所述has-miR-548a-3p表达量的检测结果实现病毒性心肌炎的辅助诊断。

在一实施方式中，所述标记物可以为所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物；在其他实施方式中，所述标记物可以为结合所述has-miR-548a-3p的生物大分子。

进一步地，所述生物大分子可以为抗体、抗体功能片段、RNA结合蛋白和RNA结合蛋白功能片段。

为了更好地实现对has-miR-548a-3p的检测，在一实施方式中，所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，具体为GCAAAACTGGCAATTACTTTTGC。

本发明又一实施例提供了一种用于辅助诊断毒性心肌炎的生物制剂，所述用于辅助诊断毒性心肌炎的生物制剂包括识别所述has-miR-548a-3p的标记物。

通过识别所述has-miR-548a-3p的标记物对所述has-miR-548a-3p进行识别，实现对所述has-miR-548a-3p表达量的检测，进而能够根据所述has-miR-548a-3p表达量的检测结果实现病毒性心肌炎的辅助诊断。

在一实施方式中，所述标记物可以为所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物；在其他实施方式中，所述标记物可以为结合所述has-miR-548a-3p的生物大分子。

进一步地，所述生物大分子可以为抗体、抗体功能片段、RNA结合蛋白和RNA结合蛋白功能片段。

为了更好地实现对血浆外泌体中的has-miR-548a-3p的检测，在一实施方式中，所述has-miR-548a-3p互补的cDNA的结合引物的引物序列如SEQ ID NO：2所示，具体为GCAAAACTGGCAATTACTTTTGC。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1

本实施例为采用了高通量测序技术对病毒性心肌炎患者与对照组(正常人)的外泌体中miRNA的表达量进行了检测；

检测结果如图1所示；

由图1可知：

外泌体miRNA在两组之间存在显著差异，其中差异性表达的miRNA共有28种，其中14种上调，14种下调。

实施例2

本实施例为qRT-PCR检测病毒性心肌炎(8人)和正常健康(8人)对照组中miRNA的表达情况：

根据表达差异情况，从实施例1得到的28中miRNA筛选得到6种表达差异最大的miRNA，具体分别为has-miR-500b-5p、has-miR-208a-3p、has-miR-197-5p、has-miR-548a-3p、has-miR-6782-5p、has-miR-412-5p；

采集病毒性心肌炎患者及健康对照组外周血标本，经超高速离心法分离获得外泌体，使用Magen HiPure Serum/Plasma miRNA Kit分离外泌体中miRNA，将两组样本的RNA逆转录成cDNA，再通过qRT-PCR扩增定量，检测结果如图2所示；

由图2可知：

发现病毒性心肌炎患者has-miR-500b-5p和has-miR-548a-3p与实施例1的测序结果保持一致，而且病毒性心肌炎患者中has-miR-548a-3p显著提高；因此，可以通过对has-miR-548a-3p进行特异性的检测能达到辅助诊断病毒性心肌炎的目的。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。