一种基于QuEChERS与实时直接分析质谱联用快速测定鱼肉中地西泮残留的方法

技术领域

本发明涉及一种基于QuEChERS与实时直接分析质谱联用快速测定鱼肉中地西泮残留的方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

地西泮又名安定，属苯二氮卓类镇静剂，具镇静、抗惊厥等作用。在水产养殖中，地西泮不仅可作为生长促进剂添加到饲料中提高水产品的生长速度，还可在养殖及运输过程中降低水产品对环境的应激反应提高其存活率，备受养殖户青睐；但地西泮有蓄积毒性，对人体肝脏、脑及运动神经等器官具毒副作用，已被禁止用于动物饲养及产品生产过程。

GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定在动物性食品中不得检出地西泮，因此，有必要开发一种适用于鱼肉中地西泮残留检测的前处理和检测方法。

目前，地西泮检测方法主要包括酶联免疫法、液相色谱法(HPLC)、气相色谱－质谱法(GC－MS)和液相色谱串联质谱联用法(HPLC－MS/MS)等。酶联免疫法不能准确定性，只能作为初筛方法；HPLC法检出限较高，但杂峰干扰大；GC－MS法往往需要对目标物进行衍生，操作比较复杂繁琐；HPLC－MS/MS操作繁琐，耗时长，成本高。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷与不足，本发明提供了一种基于QuEChERS与实时直接分析质谱联用快速测定鱼肉中地西泮残留的方法，该方法快速高效且灵敏度高，能够有效的解决现有技术中鱼肉中地西泮残留无法快速测定的问题。

本发明的目的是提供一种Quechers与实时直接分析质谱联用快速测定鱼肉中地西泮残留的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)样品前处理

取待测黑鱼样品于离心管中，加入0.1％乙酸铵-乙腈溶液，振荡，超声，离心，取上清液转入QueCHERs净化管中，振荡提取，离心，取上清液氮吹至干，加入乙腈复溶，过滤膜，即得待测样品液；

(2)定量关系模型构建

配制一系列的基质地西泮标准溶液，过滤膜后，采用DART-MS分析，以基质地西泮标准溶液浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，构建定量关系模型；

(3)待测样品中地西泮的检测

将步骤(1)所制备的待测样品液采用DART-MS分析，并依据步骤(2)构建的定量关系模型，计算待测样品中地西泮的含量。

在一种实施方式中，步骤(1)所述振荡是将离心管放置在振荡器上振荡提取3～5min。

在一种实施方式中，步骤(1)所述超声条件为：30～40kHz，时间为5～10min。

在一种实施方式中，步骤(1)所述离心条件为：4000～8000r/min，时间为5～10min。

在一种实施方式中，步骤(1)所述振荡提取的时间为3～5min。

在一种实施方式中，步骤(1)所述乙腈复溶的体积为1～2ml。

在一种实施方式中，步骤(1)所述滤膜为0.22μm滤膜。

在一种实施方式中，步骤(1)所述待测黑鱼样品与0.1％乙酸铵-乙腈溶液的质量体积比为1:5，g/ml。

在一种实施方式中，步骤(2)所述DART-MS检测分析条件为：

离子源参数：正离子采集，反应监测模式，氦气，气体温度400℃，0.6mm/s传输速度，地西泮的母离子/定量离子/定性离子为285.1/193/154。

在一种实施方式中，步骤(2)所述基质地西泮标准溶液是指采用空白鱼肉基质配制地西泮标准溶液；所述空白鱼肉基质为空白鱼肉样品经过步骤(1)前处理方法获得的空白鱼肉基质。

在一种实施方式中，步骤(2)所述一系列的基质地西泮标准溶液的浓度范围为1～10ng/mL。

在一种实施方式中，步骤(2)所述构建定量关系模型为：y＝9973.5x+98.0,R

本发明的第二个目的是提供一种由上述所述方法在检测鱼肉中地西泮含量中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明检测鱼肉中地西泮的方法具有高灵敏度、重复性好等优势，平均回收率在88.4％至90.4％，批间相对标准偏差范围为14.4％至15.1％,检出限低至5μg/kg；

(2)本发明首次建立了鱼肉中地西泮QuEChERS与实时直接分析质谱联用检测法，实现了地西泮在鱼肉中的快速检测，并且前处理简单，检测时间大大缩短。

附图说明

图1为地西泮标准品实时直接分析质谱母离子检测谱图；

图2为地西泮标准品实时直接分析质谱子离子检测谱图；

图3为本发明实施例1中构建的定量关系曲线图；

图4为本发明实施例3中不同试剂提取地西泮回收率数据图；

图5为本发明实施例4中不同进样温度下地西泮峰面积和峰型图；A为峰面积图；B为峰型图；

图6为本发明实施例5中不同进样速度下地西泮峰面积和峰型图；A为峰面积图；B为峰型图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

本发明实施例中所涉及的仪器包括：直接实时分析质谱，Q-trap 4500质谱仪；METTLER TOLEDO AL204电子天平；Allegra X-30R离心机；heidolph自动涡旋仪。QueCHERs净化管(货号：64506)购自于北京迪马科技有限公司。

实施例1

一种基于QuEChERS与实时直接分析质谱(DART-MS)联用快速测定鱼肉中地西泮残留的方法，所述方法包括：

(1)样品前处理

分别称取2g待测黑鱼样品和空白黑鱼样品于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL0.1％乙酸铵-乙腈溶液，在多管平行振荡器上振荡提取3min，在37kHz下超声提取5min，于8000r/min离心5min，取上清液转入QueCHERs净化管中，净化管在多管平行振荡器上振荡提取3min，4000r/min离心5min，取上清液氮吹至干，分别得待测样品和空白基质样；待测样品加入2ml乙腈复溶，过0.22μm滤膜，即得待测样品液；

(2)定量关系模型构建

准确移取地西泮标准工作溶液，用乙腈稀释配置成系列浓度1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL的地西泮标准溶液；将步骤(1)得到的空白基质分别采用系列浓度地西泮标准溶液复溶，制得浓度梯度为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、8ng/mL、10ng/mL地西泮基质匹配标准溶液，过0.22μm滤膜后，采用DART-MS分析，以地西泮标准溶液浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，构建定量关系模型；

(3)待测样品中地西泮的检测

将步骤(1)所制备的待测样品液采用DART-MS分析，并依据步骤(2)构建的定量关系模型，计算待测样品中地西泮的含量。

其中，DART-MS检测分析条件为：

离子源参数：正离子采集，反应监测模式，氦气，气体温度400℃，0.6mm/s传输速度，地西泮的母离子/定量离子/定性离子为285.1/193/154。

构建的定量关系模型为:y＝9973.5x+98.0,R

实施例2回收率和精密度测定

取空白基质样品，分别添加地西泮5、10、50μg/kg 3个不同浓度，每个浓度平行6份，按照实施例1的方法进行前处理和检测样品中地西泮的含量，计算回收率和室内变异系数。

结果如表1所示，地西泮平均回收率在88.4％～90.4％，满足《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB 27404-2008)附录F.1关于被测组分含量＜0.1mg/kg时回收率范围在60％～120％的要求；批间相对标准偏差在14.4-15.1％左右。

表1地西泮检测方法的回收率和批间相对标准偏差

实施例3提取试剂的选择

参照实施例1的方法，采用各种萃取溶剂对鱼肉中的地西泮进行前处理，地西泮的加标浓度为10μg/kg，并采用DART-MS分析，测定鱼肉中地西泮的含量，并计算回收率；萃取溶剂分别为：(A)0.1％乙酸铵-乙腈；(B)0.1％乙酸铵-水和乙腈(水和乙腈的体积比为1:9)；(C)甲醇-乙腈(体积比1:1)；(D)乙腈；(E)0.1％甲酸-乙腈；(F)0.1％乙酸-乙腈；(G)0.1％乙酸-甲醇；(H)1％氨水-乙腈；(I)1％氨水-甲醇；

结果如图4所示，只有0.1％乙酸铵-乙腈作为提取溶剂时，样品中地西泮的提取效率最高，回收率能够达到92.7％；说明，0.1％乙酸铵-乙腈作为提取溶剂与其它溶剂相比，更加能够提高鱼肉样品中地西泮的检测准确度。

实施例4进样温度的选择

在DART-MS分析过程中，DART的气体温度会显著影响样品的解吸和电离，进而影响到目标检测物的信号响应强度。

将10ng/ml的用乙腈稀释的地西泮标准品进行检测，调整DART的气体温度分别为300、350、400、450和500℃，测定对目标检测物的响应峰面积。

结果如图5，图5A所示，温度在300到500℃之间，目标检测物的峰面积随着温度的增加而增加；但从出峰的形态来看图5B，400℃时，峰型最好，对应的峰面积更准确；高于400℃，目标物的峰型出现裂峰现象，不稳定，且损耗机器。

实施例4进样速度的选择

DART-MS采样方式为：将点有样品的TIP头置于自动采样器的采样架上，当自动采样器匀速经过实时直接分析离子源的离子化区域时，样品被离子化，然后通过陶瓷管取样口进入三重四极杆质谱仪分析。在此过程中，样品的进样速度与样品在离子化区域的通过时间呈反比。当进样速度较慢离子化时间增加，容易造成峰展宽，影响定量准确性。反之，当进样速度过快时，样品在离子化区域停留时间过短，使样品不能完全解吸附，从而降低灵敏度。

将10ng/ml的用乙腈稀释的地西泮标准品进行检测，结果如图6中A和B所示，当线速度过慢时，0.2-0.4mm/s检测一个样品需要3-5分钟，不能体现出DART-MS快速检测的优势，且样品，峰形较宽，响应也较低；本实验采取0.6mm/s的进样速度，检测一个样品时间为40-50s,在保证检测速度的情况下，又能呈现良好峰型。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。