一种用于防治十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌及其筛选方法、应用和衍生菌株发酵液

技术领域

本发明涉及链霉菌技术领域，特别涉及一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌及其筛选方法、应用衍生菌株发酵液。

背景技术

根肿病是由专性寄生的芸薹根肿菌引起的，是世界范围内十字花科植物最严重的土传病害之一。据估计，全球因根肿病造成的作物损失为10-15％，严重感染的油菜作物可能会遭受30-100％的产量损失。与根肿病相关的主要症状是在十字花科植物根上形成根肿，限制了植株对地上部生长所需的水分和养分的吸收，植株发育迟缓、开花加速和过早衰老，芸薹属作物油菜会降低产量和油质，最终受感染植物的根系解体，休眠孢子释放到土壤中，在土壤中保持其感染潜力可以长达20年，这使得难以对根肿病进行防治。

传统的选育抗病品种防治根肿病的方法产生的效果十分有限，目前根肿病的防治还是主要依赖于化学农药，但大规模地使用农药也无法根治根肿病。为了减少使用化学农药防治根肿病带来的环境污染问题，人们在不断发掘防治根肿病的生物资源。土壤中含有丰富的放线菌，土壤放线菌是重要的植物病害生物防治微生物资源。通过土壤梯度稀释涂布法、平板对峙法、形态学鉴定，以及分子生物学鉴定等方法，可筛选并鉴定出土壤拮抗放线菌。

中国专利申请号202211726509.5公开了一种可防治根肿病的黄暗乐链霉菌及其应用，所述黄暗色链霉菌CD1-1在平板上对多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液代谢产物对根肿病有很好的防控效果，根肿菌休眠孢子的萌发抑制率为32.64％，白菜根部根毛侵染抑制率为10.93％，经CD1-1发酵液处理的白菜盆栽防治效果为49.33％，提前7d处理时，白菜盆栽防治效果为66.10％；但是该专利防治肿病拮抗放线菌的研究中，止步于盆栽试验，没有进一步测定目标放线菌在田间自然环境下对根肿病的防治效果，这不利于放线菌在根肿病生物防治中的应用与推广，拮抗放线菌还可能存在大田环境中定殖能力不理想的情况，这就会使其对植物病害的防治效果不稳定。

发明内容

针对现有技术中对大田环境中的十字花科植物根肿病的链霉菌生物防治技术仍旧缺失的情况，本发明提供一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌，对芸薹根肿菌休眠孢子有较高的校正致死率，应用到防治大田内十字花科植物根肿病上有显著效果；本发明还提供一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌的筛选方法，能从大田菜地土壤中筛选出能应用到防治大田内十字花科植物根肿病上的生黑孢链霉菌；本发明还提供一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌在防治大田内十字花科植物根肿病上的应用，应用于防治大田内十字花科植物根肿病上有显著效果；本发明还提供一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌制备的菌株发酵液，对芸薹根肿菌休眠孢子有较高的校正致死率和降低休眠孢子对十字花科植物的根毛侵染率。

本发明以以下技术方案实现：

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌，所述生黑孢链霉菌Streptomyces melanosporofaciens为从发生根肿病的十字花科菜田土壤中分离筛选出来的菌株，命名为X216菌株，于2023年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC No：M2023723；所述X216菌株在大田环境下对十字花科植物根肿病的防治效果达到30.84±3.91％～43.16±1.40％。

优选的，X216菌种具有链霉菌的形态特征，并且生理生化特性显示X216菌株具有产淀粉酶、纤维素酶和β-1，3-葡聚糖酶的能力。

优选的，使用所述X216菌株制备的菌株发酵液对芸薹根肿菌休眠孢子处理数天后对芸薹根肿菌休眠孢子的校正致死率显著高于同期孢子经75％百菌清、50％多菌灵和20％氟啶胺处理的致死率。

优选的，使用所述X216菌株制备的菌株发酵液处理被芸薹根肿菌休眠孢子感染的十字花科植物数天后，芸薹根肿菌休眠孢子对十字花科植物的根毛侵染率显著低于同期孢子经75％百菌清和50％多菌灵处理的根毛侵染率。

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)采集的土壤添加至无菌水中混匀成浓度为10

2)将步骤1)培养出来的菌落一计数，并且分别在高氏一号培养基上把计数后的各个菌落分离，用平板划线法纯化得菌落二；

3)将步骤2)纯化得到的菌落二用细胞壁结构与芸薹根肿菌相似的病原菌作为为指示菌进行筛选，即筛选出X216菌株。

指示菌中的棉花枯萎病原菌即尖孢镰刀菌，与芸薹根肿菌细胞壁成分相似，可以根据细胞壁结构相似因而影响到菌株间的相互作用相似的原理，推导出筛选出来的菌株能对芸薹根肿菌细胞产生有效的拮抗作用；在土壤中提取出来的待测菌株与指示菌平板拮抗实验时，显示出拮抗效果显著的菌株即为本发明所需要筛选的X216菌株，发现所采用的草莓疫病菌、草莓根腐病菌、茄子褐纹病菌、辣椒枯萎病菌、茭白镰刀菌、柑橘砂皮病菌、玉米大斑病菌都起到了指示菌的作用。

优选的，步骤5)中所述筛选包括以下步骤：

(1)初筛：所述指示菌分为初筛指示菌和复筛指示菌，将初筛指示菌活化，将初筛指示菌饼接种在高氏一号培养基平板中央，同时在初筛指示菌四周接种从土壤里分离出的待测菌，每株待测菌重复数次，恒温培养，数天后观察有无抑菌带形成；

(2)复筛：采用平板对峙法测定步骤(1)初筛出的菌株对复筛指示菌的拮抗效果；将复筛指示菌菌饼接种在高氏一号培养基中央，待测菌株划线接种于复筛指示菌饼两侧，距复筛指示菌菌饼与平皿边缘距离相等得实验组，以只接种复筛指示菌菌饼的空白平板为对照组；所述实验组设置多个；

(3)将步骤(2)的复筛指示菌替换成其它复筛指示菌，再进行筛选，所有实验组恒温培培养数天后，计算抑菌率。

优选的，所述指示菌为棉花枯萎病菌、草莓疫病菌、草莓根腐病菌、茄子褐纹病菌、辣椒枯萎病菌、茭白镰刀菌、柑橘砂皮病菌、玉米大斑病菌中的一种或多种。

一种上述用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌或一种上述用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌的筛选方法制备的生黑孢链霉菌在用于防治大田内十字花科植物根肿病中的应用。

一种使用上述的一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌或使用上述的一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌的筛选方法制备的生黑孢链霉菌制备的菌株发酵液。

本发明的有益效果：

(1)本发明采用从发生了根肿病的油菜地里筛选出能与指示菌相抗拮的生黑孢链霉菌，相较现有的化学农药有效提升了对芸薹根肿菌休眠孢子的致死率，降低了芸薹根肿菌休眠孢子对十字花科植物的根毛侵染率，对根肿病防治起到显著效果，并且直接推广到田间自然环境下对十字花科植物根肿病的防治起到显著效果。

(2)本发明采用的生黑孢链霉菌相较现有的化学农药，有更高的环境友好性，替代农药因而减少了化学农药向土壤中渗透造成环境污染。

(3)本发明的生黑孢链霉菌来自油菜田土壤，取材容易，易于复制增殖，成本低，工艺简单，有利于大规模的工业化推广。

附图说明

图1为X216菌株菌落特征及其显微结构，A、B：菌落正背面；C：在高氏一号培养基上的菌落形态；F：在PDA培养基上的菌落形态；D：菌丝形态；E：孢子丝。

图2为X216菌株产淀粉酶(A)、纤维素酶(B)、和β-1，3-葡聚糖酶(C)的检测结果。

图3为X216菌株和不同药剂对根肿病休眠孢子的致死效果。

图4为X216菌株和不同药剂对油菜根肿病的温室防治效果，A：CK；B：X216菌株发酵液原液；C：X216菌株发酵液稀释2倍；D：X216菌株发酵液稀释5倍；E：100g/L氰霜唑SC稀释1000倍；F：75％百菌清WP稀释500倍；G：50％多菌灵WP稀释600倍；H：生石灰占土比例1.2g/kg。

图5为X216菌株和不同药剂防治油菜根肿病的田间试验结果，A：CK；B：X216菌株发酵液原液；C：X216菌株发酵液稀释2倍；D：X216菌株发酵液稀释5倍；E：100g/L氰霜唑SC稀释1000倍；F：75％百菌清WP稀释500倍；G：50％多菌灵WP稀释600倍；H：生石灰占土比例1.2g/kg。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明；本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括；例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素；此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合；本发明实施例和对比例中所用的实验原料均为市售产品。

实施例1

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的生黑孢链霉菌的筛选方法，包括以下步骤：

初筛：用打孔器(d＝5mm)在活化后的棉花枯萎病菌平板上打孔，将棉花枯萎病菌的菌饼接种在高氏一号琼脂培养基平板中央，同时在菌饼的四周对称地接种从土壤里分离出的不同微生物。每株菌重复3次，倒置平板于28℃恒温培养箱中培养，5d后观察有无抑菌带形成。

复筛：采用平板对峙法测定初筛出的菌株对棉花枯萎病菌、草莓疫病菌、草莓根腐病菌、茄子褐纹病菌、辣椒枯萎病菌、茭白镰刀菌、柑橘砂皮病菌、玉米大斑病菌的拮抗效果。将病原菌菌饼(d＝5mm)接种在高氏一号琼脂培养基中央，待测菌株划线接种于病原菌菌饼两侧，距病原菌菌饼与平皿边缘距离相等，以只接种病原菌菌饼的平板为对照。每个处理设6个重复，于28℃恒温培养箱中倒置培养7d后，计算抑菌率。将分离筛选所得的一株具有较强拮抗效果的菌株命名为X216，其对棉花枯萎病菌、草莓疫病菌、草莓根腐病菌、茄子褐纹病菌、辣椒枯萎病菌、茭白镰刀菌、柑橘砂皮病菌、玉米大斑病菌的抑制效果如表1所示，得到X216菌株。

如图1所示，从湖南省衡阳市衡阳县西渡镇发生油菜根肿病的土壤中分离筛选出的生黑孢链霉菌X216菌株在高氏一号固体培养基上28℃培养，菌落呈现出明显的放射状。菌落前期为白色近圆形，生长缓慢；菌丝可在固体培养基内呈放射状生长，菌丝生长密集紧实，菌落略突起、质地略硬；后期菌落中间逐渐变黑色，并随时间延长产生浅黄色可溶性色素。在PDA培养基上，菌株生长情况与在高氏一号培养基上有较大差异。菌落生长速度比在高氏一号上稍快，菌落最开始呈浅黄色褶皱状，然后会在褶皱上长出密集的白色或淡黄色菌丝，菌落明显突起；后期菌落变黑，会产生黄色色素，使培养基被染成浅黄色。将插片培养后的盖玻片用于显微观察，该菌株的菌丝交织生长、密集相连，无隔膜，直径为0.5-1.1μm，孢子丝呈弯曲状。

表1 X216菌株对不同供试病原菌的抑制效果

Table 1 Inhibition rate of X216 strain against different pathogens

将分离筛选所得的一株具有较强拮抗效果的菌株命名为X216，其对棉花枯萎病菌、草莓疫病菌、草莓根腐病菌、茄子褐纹病菌、辣椒枯萎病菌、茭白镰刀菌、柑橘砂皮病菌、玉米大斑病菌的抑制效果如表1所示。X216菌株对上述八种病原菌的抑制率为51.87％～71.19％，其对与根肿菌休眠孢子细胞壁成分相似的棉花枯萎病菌的抑制率为(63.84±1.35)％。

对比例1

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的化学农药为100g/L氰霜唑。

对比例2

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的化学农药为20％氟啶胺。

对比例3

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的化学农药为75％百菌清。

对比例4

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的化学农药为50％多菌灵。

对比例5

一种用于防治大田内十字花科植物根肿病的化学农药为生石灰。

对照组

无菌水。

1、采用芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液检测X216菌株、氰霜唑、氟啶胺、百菌清、多菌灵的抗芸薹根肿菌休眠孢子的效果：

芸薹根肿菌休眠孢子悬浮液的制备：将保存于-20℃的油菜根肿病肿根解冻并置于25℃黑暗条件下腐烂5d。用粉碎机搅碎肿根，加无菌水搅拌均匀后用8层纱布过滤；滤液500r/min离心15min，弃沉淀收集上清液；用50mL离心管2500r/min离心5min，收集沉淀，重复3-4次以获取更多根肿菌休眠孢子；用2％氯胺T消毒沉淀物20min后再3000r/min离心5min收集沉淀，加无菌水悬浮并离心清洗3次；无菌水悬浮所得沉淀，加入硫酸粘杆菌素、盐酸万古霉素和头孢塞肟钠，使其浓度分别为1、1和6μg/mL，24℃黑暗放置24h后再3000r/min离心5min收集沉淀；加无菌水悬浮沉淀3000r/min离心5min清洗3次；用血球计数板计算休眠孢子浓度，最后用无菌水把休眠孢子悬浮液调至1×10

X216菌株发酵液制备：300mL锥形瓶中装150mL高氏一号液体培养基，接入15块X216菌株的菌饼，温度28℃、摇床转速180r/min培养7d。X216菌株发酵液设置5个实验浓度，用无菌水将X216菌株无菌发酵液的浓度稀释至1、2、5、10、20倍。用根系分泌液稀释根肿菌休眠孢子悬浮液，使其终浓度为1×10

分别在7、10、14d后镜检观察休眠孢子的活性，经操作对比后，染色剂选用2％埃文斯蓝溶液。休眠孢子悬浮液与2％埃文斯蓝溶液以2∶1体积比混合均匀，室温染色24h，移液枪吸取10μL制作临时玻片，在光学显微镜下观察孢子。判断休眠孢子活性的依据是休眠孢子被染色的程度，失去活性的休眠孢子会被染成深蓝色，具有活性的休眠孢子不会被染成蓝色。每次观察100个休眠孢子，3次重复。

在接种3、7、10d后用显微镜对根毛进行观察。每个处理每个时期取4株幼苗根，先用无菌水冲洗幼苗以除去部分根上附着的孢子，然后用50％乙酸配制的苯胺蓝染液(浓度为125mg/L)染色1-2min，再用无菌水洗去幼苗根表面浮色，制作临时玻片并在显微镜下观察和统计被侵染和未侵染的根毛数量，计算根毛侵染率。每次观察100根根毛，重复3次。

如图3所示，经X216菌株无菌发酵液与几种药剂处理后，根肿菌休眠孢子的死亡率显著升高，并且休眠孢子死亡率与时间呈正相关。X216菌株原液与稀释2、5、10、20倍的发酵液均能对休眠孢子起到致死作用，其中原液在处理14d后，对休眠孢子的校正致死率达到(56.59±1.97)％，与同期50％多菌灵WP的致死作用没有显著性差异，但显著高于(P<0.05)75％百菌清WP的校正致死率(51.03±0.80)％和20％氟啶胺SC的致死率(37.62±0.72)％。X216菌株稀释2、5倍的发酵液处理14d后的校正致死率在40～45％，稀释10、20倍的发酵液的致死率为30％左右。在9组处理中，100g/L氰霜唑SC对休眠孢子的致死作用最强，处理14d时校正致死率为(63.08±2.28)％。

2、温室盆栽防效测定

采用菌土法接种芸薹根肿菌，使每克土壤中根肿菌休眠孢子数1.0×10

表2 X216菌株和不同药剂对油菜根肿病的温室防治效果

Table 2 Control effect of different treatments against oilseed rapeclubroot in pot test

表2续表

如图4所示，X216菌株发酵液和不同药剂对油菜根肿病的防治效果与灌根浓度呈正相关。X216菌株发酵原液对油菜根肿病的防治效果为62.14％，与化学农药100g/L氰霜唑SC稀释1000倍的防治效果(67.37％)没有显著性差异，但显著高于(P<0.05)化学农药75％百菌清和50％多菌灵WP对油菜根肿病的防治效果(26.18％，27.23％)。

3、自然田间根肿病防治效果测定

选择多年发生油菜根肿病田块，采用随机区组设计实验，在垄上挖30×30 cm的穴，每穴种植15株油菜，每行4个穴，2行为1个处理，重复3次，全部农事操作一致。生石灰组提前按不同浓度分别将拌好后的土放入穴中，其他处理组在播种时、播种14d，每穴分别用500mL不同处理组的溶液灌根。在油菜出苗45d后，对照组发病后开始调查各组根肿病的发病情况，所得实验数据如表3所示。

表3X216菌株和不同药剂对油菜根肿病的田间防治效果Table 3Control effectof different treatments against oilseed rape clubroot in field test

如图5所示，在油菜大田中使用X216菌株发酵液可以显著降低油菜田根肿病的病情指数，X216菌株发酵原液对油菜根肿病的田间防治效果为43.16％，与100g/L氰霜唑SC稀释2000倍、75％百菌清WP稀释1000倍、50％多菌灵WP稀释1000倍的防治效果相当。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。

对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。