一种薹用白菜CMS类型鉴定的特异性多重PCR分子标记引物及应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种薹用白菜CMS类型鉴定的特异性多重PCR分子标记引物及应用。

背景技术

薹用白菜由十字花科芸薹种中以花薹为食用器官的变种或亚种组成，主要包括红菜薹、菜心以及白菜薹。薹用白菜主要由幼嫩花薹为食用器官，一直是我国南方地区重要的十字花科蔬菜品类。近年来，我国北方省份也在大力发展薹用白菜的规模化种植，其中菜心已实现周年供应，正成为新兴的大宗叶菜类蔬菜。

早期的薹用白菜杂交品种选育主要利用自交不亲和技术，该技术生产杂交种成本较高，需通过人工剥蕾繁殖亲本，杂交种纯度也受亲本的自交不亲和性强弱影响。对于薹用白菜而言，其食用器官是花薹而非种子，利用CMS选育杂交种时无需将父本改造为恢复系，只需创制出母本的不育系即可。因此，近年来一些在油菜中成熟使用的CMS在薹用白菜杂交品种选育中也被广泛应用。Polima CMS是最早在油菜育种中成熟应用的CMS类型，其不育性由orf224基因控制。Polima CMS已被转育到薹用白菜中，但该类型CMS本身在甘蓝型油菜中便存在败育不彻底的现象(在生长中后期或低温时会出现微粉)，其败育程度在其它十字花科蔬菜中变得更不稳定，对其应用也产生了一定限制。Ogura CMS也是在油菜中应用较为成功的CMS，其败育性彻底，最初在萝卜中发现并通过细胞工程手段导入到了油菜中，不育性由orf138基因控制。Ogura CMS在转育到不同类型十字花科蔬菜如芥菜、白菜与甘蓝类蔬菜后，仍可保持败育彻底的特性，因此Ogura CMS现阶段也是在十字花科蔬菜中广泛应用的CMS类型。Hau CMS是华中农业大学继Polima CMS后发现的另一个在油菜中具有应用价值的CMS类型，其败育特性由orf288控制，远缘杂交导入油菜后仍可保持败育彻底的特性，该CMS已有报道在菜心及白菜薹育种均得到应用。

与使用原始的不育源或油菜作为不育胞质供体相比，以已有的CMS薹用白菜不育系及CMS杂交品种作为不育胞质供体可提高不育系创制效率，如近年来新育成的红菜薹品种“申紫薹仙，”菜心品种“粤翠2号”及白菜薹品种“天成早薹1号”均是基于已有的薹用白菜不育系进行的母本不育系转育。现阶段Polima，Ogura与Hau CMS类型均已转育到薹用白菜中，为育种家提供了便利。然而一些CMS类型在表型上较为相似，如Ogura与Hau CMS需要通过分子标记才能区分，同时在育种实践中我们也发现已有的Polima分子标记无法将Polima与Hau CMS区分开，已有的Polima分子标记在Hau CMS材料及部分薹用白菜品种中存在假阳性问题。

因此在现阶段薹用白菜育种中需要特异性更强的CMS类型鉴定分子标记，以实现对当前薹用白菜品种CMS类型的精准鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种薹用白菜CMS类型鉴定的特异性多重PCR分子标记引物，所述的分子标记引物为一个引物组，该引物组能同时对三种CMS类型与正常可育材料进行鉴定，在薹用白菜中表现出良好的适用性。

本发明的另一个目的在于提供了上述引物组在薹用白菜CMS类型鉴定中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

将Polima CMS、OguraCMS及Hau CMS对应的基因序列orf224、orf138及orf288分别与NCBI数据库中的PolimaCMS、Ogura CMS、Hau CMS的线粒体基因组序列(NCBI登录号依次为：FR715249，AB694744，KF736092)、白菜正常胞质的线粒体基因组序列(NC_016125)及核基因组序列(GCF_000309985)进行逐一比对，根据同源性序列的水平来评估三个CMS类型基因的特异性。其中基因与线粒体/核基因组间的比对利用NCBI中的序列间Blast功能完成，鉴定到高度同源的序列后，进一步使用EMBL-EBI数据库中的MUS CLE软件对同源性序列进行比对分析。最终获得了一组可同时对三种CMS类型与正常可育材料进行鉴定的引物组，该引物组对应的分子标记命名为Brcms_M，所述的引物组如下：

Polima CMS：F:TATCAGCGTTGGTCGCCC和R:GGTCCGACGCCGAAATGACCA、Hau CMS：F:AGCACACTCCTAGCGAAGCAAC和R:CGGCTAACGCATTACTCCCT AGC、

Ogura CMS：F:GGCCCATATTTGGCTAAGCTGGT和R:GTCAAAGCAATTGGGTTC ACAAAGCA、

和正常胞质：F:GCCGGATTAGCAGGAGGAAGGT和R:ACGGCAGAGACTACTGAC CCTC。

本发明还包括，上述引物组在薹用白菜CMS类型鉴定中的应用；在薹用白菜CMS育种中的应用。

以上所述的应用中，优选的，所述的CMS类型包括：Polima CMS、OguraCMS和/或HauCMS；

以上所述的应用中，其应用过程中使用的PCR体系为：

PCR反应体系为10μL，反应体系中各成分组成为：1.0μL10X Easy Taq buffer，0.2μLd NTP，0.1μL Easy Taq酶，2.0μL待测样品DNA，浓度为10μM的Polima正向与反向引物各加1.2μL，浓度为10μM的Hau正向与反向引物各加0.2μL，浓度为10μM的Ogura正向与反向引物各加0.8μL，浓度为10μM的通用引物的正向与反向引物各加0.4μL，最后加1.5μL的ddH

扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度为58℃，时间30s，72℃延伸45s，共进行35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明针对在Polima、Ogura及Hau三种CMS开发的分子标记Brcms_M能在一个PC R体系中同时对三种CMS类型与正常可育材料进行鉴定，在薹用白菜中表现出良好的适用性。已有Polima分子标记在Hau CMS材料及薹用白菜中均出现了假阳性结果，而Brcms_M与已有Polima分子标记比较过程中表现了良好的特异性，未出现假阳性。

附图说明

图1为orf224基因与Hau CMS中的同源性序列比对结果示意图；

其中红色箭头所示为Polima特异分子标记的正反向引物序列位置。

图2为Polima CMS特异性扩增引物及分子标记Brcms_M准确性的验证示意图；

其中：A.Polima分子标记P1122检测结果；B.Polima分子标记Pol_3132检测结果；C.本申请开发的Polima分子标记；D.分子标记Brcms_M检测结果。

每个标记检测结果中各泳道信息:M，DNA Ladder DL2000 1，靓红70(Polima CMS对照)2，鄂红2号(Polima CMS对照)3，FanY-9A-1(Hau CMS对照)4，FanY-9A-2(Hau CMS对照)5，紫御60(Ogura CMS对照)6，鄂红5号(Ogura CMS对照)7，胭脂红(红菜薹地方品种)8，JHK(红菜薹自交系)9，四九菜心(菜心常规种)10，汉珍1号(菜心常规种)11，快大黄叶(白菜薹常规种)12，BCT16018(白菜薹自交系)。

图3为28份薹用白菜CMS类型鉴定结果示意图；

其中泳道：M，DNA Ladder；Pol，PolimaCMS对照品种鄂红2号；Hau，Hau CMS对照品种FanY-9A；Ogu，Ogura CMS对照品种紫御60；WT，正常胞质对照品种十月红；1-28为28份薹用白菜品种在表2中的编号。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

薹用白菜CMS类型鉴定的特异性多重PCR分子标记Brcms_M的获得：

1)Polima CMS特异性序列的筛选与引物设计：

将Polima CMS对应的不育性基因orf224分别与NCBI数据库中Ogura CMS、Hau CMS的线粒体基因组序列(NCBI登录号依次为AB694744，KF736092)、白菜正常胞质的线粒体基因组序列(NC_016125)及核基因组序列(GCF_000309985)进行逐一比对，鉴定orf224在这些基因组中的同源序列。其中基因与线粒体/核基因组间的比对利用NCBI中的序列间Bl ast功能完成，鉴定到高度同源的序列后，进一步使用EMBL-EBI数据库中的MUSCLE软件对同源性序列进行比对分析。

经过比对发现orf224在Hau CMS线粒体基因组中存在一段高度同源的序列，为了保证Polima扩增引物的特异性，将正反向引物设计在orf224与对应Hau CMS同源性序列中变异较大的位置即图1中红色箭头区域，并分别在正向引物3’端第6位碱基和反向引物3’端第2位碱基引入错配以提高扩增特异性(表1)，正向引物为：TATCAGCGTTGGTCGCCC，反向引物为：GGTCCGACGCCGAAATGACCA，扩增片段大小为145bp。

Polima CMS特异性扩增引物准确性的验证，共有3组引物进行了验证，分别为上述Polima CMS特异性扩增引物，以及下述两组现有技术对照：

对照组分子标记P1122：F:AGCTGTCTGGAGGGAATC R:ATAACACTACTCTCATCCC TCG，目的条带1777bp；(常建军等2010)。

对照组分子标记Pol_3132：F:AGCTGTCTGGAGGGAATC R:ACGACATCAAGGAGG AAC，目的条带747bp；(危文亮2005；胡胜武等2009)。

待测样品如下：靓红70(Polima CMS对照)、鄂红2号(Polima CMS对照)、FanY-9A-1(Hau CMS对照)、FanY-9A-2(Hau CMS对照)、紫御60(Ogura CMS对照)、鄂红5号(Ogura CMS对照)、胭脂红(红菜薹地方品种)、JHK(红菜薹自交系)、四九菜心(菜心常规种)、汉珍1号(菜心常规种)、快大黄叶(白菜薹常规种)、BCT16018(白菜薹自交系)。以上所述的FanY-9A-1和FanY-9A-2均为FanY-9A(刘志新等2021)的单株。

结果如图2所示，可以看到分子标记P1122与Pol_3132均在Hau CMS中出现假阳性，同时Pol_3132还在部分红菜薹中出现弱阳性目的条带(图2中A，B)，而本发明提供的Polima标记在Hau CMS及其它测试的薹用白菜中均无假阳性(图2中C)。

2)Ogura CMS特异性序列的筛选与引物设计

按照1)的方式，将Ogura CMS对应的不育性基因orf138进行比对，结果表明orf138的序列特异性较高，在与其它类型胞质与正常胞质线粒体及核基因组进行比对后，均未鉴定到同源性较高的序列，因此直接以其序列模板进行引物设计。

正向引物序列为：GGCCCATATTTGGCTAAGCTGGT反向引物序列为：GTCAAAGCAATTGGGTTCACAAAGCA，目的条带大小为339bp。

3)Hau CMS特异性序列的筛选与引物设计

按照1)的方式，将Hau CMS对应的不育性基因orf288进行比对，结果表明orf288在各CMS线粒体基因组及核基因组中均存在高度同源序列，因此以衡双平等从Hau CMS线粒体基因组中鉴定的特异性序列进行引物设计。

正向引物序列为：AGCACACTCCTAGCGAAGCAAC反向引物序列为：CGGCTAACGCATTACTCCCTAGC，目的条带大小为537bp。

4)可育材料与不育材料鉴定的特异性序列的筛选与引物设计

在正常胞质与三种类型CMS胞质间的保守序列区域设计通用引物，若只能扩增出通用引物的目的条带，则为正常可育材料；若同时扩增出通用引物条带与对应CMS引物的条带则检测的材料为对应的CMS类型；若无任何条带扩增便是操作原因导致的检测失败。

保守区域通过mVISTA比对软件对三种CMS类型及正常可育胞质的线粒体基因组序列进行比对获得保守区域序列后，设计通用引物，正向引物为:GCCGGATTAGCAGGAGGA AGGT反向引物为：ACGGCAGAGACTACTGACCCTC，目的条带大小为245bp。

5)引物组合的构成及判定方式

对上述获得的PolimaCMS,Hau CMS,Ogura CMS及通用引物混合在一起进行多重PCR的优化，以实现一次PCR反应同时将三种CMS及正常胞质同时区分开的目的，获得多重PCR分子标记命名为Brcms_M。该标记的检测体系为：

PCR反应体系为10μL，反应体系中各成分组成为：1.0μL10X Easy Taq buffer，0.2μLd NTP(10mM),0.1μL Easy Taq酶(5U·μL

扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度为58℃，时间30s，72℃延伸45s，共进行35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

将获得的PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，若出现145bp+245bp带型则为Polima CMS；若出现537bp+245bp带型则为Hau CMS；若出现339bp+245bp带型则为Ogura CMS；仅出现245bp则为正常可育的薹用白菜品种。

将Brcms_M在不同的CMS类型对照及正常胞质的不同薹用白菜品种中进行测试，各阳性对照的目的条带清晰可见，在Hau CMS材料及不同薹用白菜品种中均无假阳性结果，也表现出良好的特异性(图2中D)。

表1Brcms_M标记信息

表格中引物浓度指各标记引物在10μL PCR反应液中的终浓度，PolimaCMS引物中加粗显示碱基为引入错配的碱基。

实施例2：

使用Brcms_M对28份薹用白菜品种进行CMS类型鉴定：

申请人前期通过武汉市大东门种子市场与湖北汉蔬创一农业科技有限公司收集了一批主流的红菜薹、白菜薹与菜心商品种以及处于初步示范阶段的杂交组合，将其中符合CMS遗传特性即当代表现出不育特性、作母本与常规可育材料杂交后的F

申请人使用Brcms_M对这28份品种进行检测，成功地对这28份CMS品种进行了区分，育性表现基本与标记鉴定的结果相吻合，表明Brcms_M具有良好的应用效果。

其中表现为Ogura CMS特征即花朵败育彻底的品种均鉴定为Ogura CMS，而表现为Polima CMS特征即花朵不完全败育的材料均鉴定为Polima CMS(图3，表2)，两份特殊育性材料被鉴定为Ogura CMS。

表2 28份CMS薹用白菜品种信息及CMS类型鉴定结果