一种用于葡萄红、白肉性状鉴定的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于葡萄红、白肉性状鉴定的SNP分子标记及其应用。

背景技术

红肉葡萄果皮、果肉及种子中均富含花青素，具有较强的抗氧化活性，为潜在的功能性果品。目前，红肉葡萄品种较少，且均为酿酒葡萄，包括Mitos、Marquette、Yan-73和阿科龙(acolon)等，主要作为染色品种使用。现有的红肉葡萄品种已成为红肉鲜食和酿酒葡萄杂交育种的重要亲本。

葡萄红皮/绿皮性状为典型的质量性状，由一对等位位点控制，该位点包含两个邻近的转录因子MYBA1和MYBA2，进化过程中MybA1启动子区插入反转座子Gret1导致该基因不表达，MYBA2编码区产生两个SNP导致编码区提前终止、蛋白无活性，当以上两个突变同时存在且为纯合突变时导致葡萄果皮不着色(绿皮葡萄)。相似的，在苹果、梨、猕猴桃等果树作物上，MYBA1的同系蛋白分别控制以上果皮着色。

葡萄果肉颜色也为质量性状，目前关于葡萄果肉着色机制尚不清楚。

发明内容

针对现有技术问题，本申请提供了一种用于葡萄红、白肉性状鉴定的SNP分子标记及其应用。本申请首次提出了可以鉴定葡萄红、白肉性状的SNP分子标记(SNP14181484)，该分子标记位于葡萄基因组chr2号染色体的14181484bp位置，红肉葡萄中该位点碱基为T，白肉葡萄中碱基为C。

本发明提供上述SNP分子标记在葡萄杂交育种上的应用，尤其是杂交育种后代早期筛选上的应用。

本发明针对上述SNP分子标记，进一步提供了用于葡萄红、白肉性状鉴定的特异引物对，其中正向引物序列(SNPRF-F)为：5ˊ-GAATTAAGGAATTACTGGTGTGC-3ˊ(如SEQ ID NO.1所示)，反向引物序列(SNPRF-R)为：5ˊ-GAAGGAGCCGGTCTCTTG-3ˊ(如SEQ ID NO.2所示)。该特异性引物对能够有效扩增上述SNP分子标记序列，扩展效率高，特异性强，能满足PCR产物测序要求。从而可以据此判断葡萄的红/白肉株系。

本发明还提供了鉴定葡萄红、白肉性状的试剂盒，包括上述特异引物对。

更进一步的，本发明提供了一种葡萄红/白肉性状鉴定的方法，以上述特异性引物对或上述试剂盒对葡萄DNA进行PCR反应，对PCR产物测序，根据SNP14181484位点碱基，确定株系的红、白肉性状。

优选的，所述的PCR反应扩增长度374bp，PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；然后进行以下循环，94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环；最后72℃延伸8分钟。

更优选的，PCR产物可以直接利用ABI 3730XL测序仪进行测序。

本发明的有益效果为：

本发明首次研究发现的与红肉性状连锁的SNP分子标记，并针对该分子标记设计适宜的引物对，通过PCR扩增和测序技术实现红/白肉株系的区分、鉴定，尤其适合葡萄杂交育种方面的应用，能有效提高优选率、缩短育种年限，提高育种效率，加快红肉葡萄品种选育进程等。

附图说明

图1实施例1中F1后代SNP14181484与葡萄红/白肉性状匹配分析图，图中RF代表红肉后代，WF代表白肉后代。

图2实施例1中F1后代SNP14181484突变类型分析结果图。

图3实施例4中5个葡萄品种的SNP14181484与红/白肉性状匹配分析图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。除特殊说明外，以下实施例中均采用常规技术操作完成。

实施例1葡萄F1代分离群体的构建

父本为阿科龙(Acolon,Vitis vinifera)，德国酿酒葡萄品种，果粒较小，果皮蓝黑色，果肉富含花青素，呈紫红色，糖度高，酸度中等，属于晚熟品种。母本为阳光玫瑰(Shine Muscat,Vitis vinifera),鲜食葡萄，原产日本，果粒大，果皮绿色，果肉不积累花青苷，为白肉，糖度高，酸度中等，中晚熟品种。

父本和母本杂交得到F1，共128株。

果肉着色性状调查表明，94株表型为红肉性状，34株为绿肉性状，比值为2.8：1，卡方检验符合孟德尔3：1分离规律，表明红色果肉性状为单基因控制的质量性状。果肉花青苷含量测定表明母本阳光玫瑰为0，父本阿科龙为11.6mg.g

实施例2

从实施例1中的F1后代中随机选取25个红肉株系，25个白肉株系以及父母本，用CTAB法分别提取其基因组DNA，具体方法如下：

1)取1～2g新鲜叶片放入预冷的研钵中，加入液氮，研磨成粉末；

2)将粉末转入15ml离心管中，加入5ml提取液(Tris-HCl,pH8.0，100mmol/L；EDTA,pH8.0，50mmol/L；NaCl，500mmol/L；SDS，3％；β-巯基乙醇，0.4％，现用现加)，搅拌混匀，65℃水浴保温20分钟；

3)将离心管置于冰水中，加入2ml 5M KAc(pH 5.5)，混匀，保持10分钟；

4)加入等体积的氯仿，振荡抽提，3000g离心25分钟；

5)将上清液转于新离心管中，然后加入5ml预冷(-20℃)的异丙醇，在4℃放置30分钟；

6)挑出DNA沉淀，放于1.5ml离心管中，用70％乙醇洗两次，然后在超净工作台上风干；

7)将吹干的DNA沉淀溶于300μl TE(pH8.0)。

8)取60μl DNA粗提液，加超纯水稀释至200μl；

9)加入等体积的氯仿抽提，然后10,000g离心10分钟；

10)取上清，用超纯水将体系扩大至500μl，加入RNase(10ng/μl)，37℃保温2.5小时；

11)加入等体积的氯仿抽提，10,000g离心15分钟；

12)将上清液转入新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc；

13)10,000g离心10分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗两次，超净台上吹干；

14)DNA溶于20μl TE(pH8.0)中，-20℃储存备用。

实施例3 SNP分子标记与红肉性状相关性验证

利用本发明设计的特异引物对，正向引物(SNPRF-F)序列为：5′-GAATTAAGGAATTACTGGTGTGC-3′，反向引物(SNPRF-R)序列为：5ˊ-GAAGGAGCCGGTCTCTTG-3ˊ，对实施例2中所得各株系的DNA进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟；然后进行以下循环，94℃变性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，共进行30个循环；最后72℃延伸8分钟。

最终扩增得到长度374bp的DNA片段，利用ABI 3730XL测序仪对其进行测序，父本阿科龙的DNA片段序列如SEQ ID NO.3所示；母本阳光玫瑰的DNA片段序列如SEQ ID NO.4所示。该SNP14181484与红肉性状相关性如图1所示，PCR产物测序检测结果表明SNP14181484与红肉性状完全匹配。

同时，可以根据测序结果确定基因型，如果SNP14181484位点测序结果为T/C套峰，表明该位点为杂合突变；如果为T单峰，表明为纯合突变；如果为C单峰，表明未突变(图2)。纯合突变和杂合突变果肉均为红色；测定杂合突变和纯合突变类型对指导育种具有重要意义，通过测序确定为纯合突变的材料可以作为亲本进行杂交，后代均为红肉。

实施例4

SNP14181484在其他5个葡萄品种上的验证

选取了另外2个红肉酿酒葡萄品种Mitos(中文译名米朵珠，原产德国)和Marquette(中文译名麦魁特，原产美国)，三个非红肉酿酒葡萄品种赤霞珠(CabernetSauvignon，原产法国)、美乐(Merlot，原产法国)和品丽珠(France，原产法国)。

用CATB法分别提取基因组DNA，具体提取步骤见实施例2。

用引物对SNPRF-F和SNPRF-R对上述DNA进行PCR扩增，具体程序见实施例3。

最终扩增得到长度374bp的DNA片段，利用ABI 3730XL测序仪对其进行测序。如图3所示，该SNP14181484存在于红肉品种中，在非红肉品种中不存在。