抗病基因NtTBWRG1在烟草青枯病防治中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及到一种抗病基因NtTBWRG1在烟草青枯病防治中的应用。

背景技术

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的细菌性病害，是典型的维管束病害，根、茎、叶都可发病。烟草青枯病在我国的分布较为广泛，并且近几年该病的危害范围在我国逐渐由南向北扩展蔓延，严重时导致全田烟株枯死，给烟叶生产造成巨大的经济损失。目前对烟草青枯病尚无十分有效的防治方法，发掘抗病基因是解决青枯病危害的根本途径。

目前，在番茄、茄子、马铃薯、辣椒等多个茄科作物以及模式植物拟南芥中已获得了青枯病抗性相关基因。然而，烟草作为我国最重要的经济作物之一，其青枯病抗性基因的发掘和研究工作相对滞后。近年来，通过烟草青枯病发病前后的转录组分析，发现了一些受到青枯菌侵染诱导表达的基因，其在烟草中过表达后可一定程度上增强转基因烟草的青枯病抗性。例如，过表达转录因子NtWRKY50和NtPR-Q可诱导植物激素SA和JA合成相关基因表达上调，增强植株对病害的抗性；过表达NtPR1a可以激活相关防御基因的表达，增强转基因植株的青枯病抗性；过表达NtRNF217可以降低转基因烟草中青枯菌的繁殖等。然而，这些基因大多为转录因子，且其诱发的青枯病抗病效果有限。因此，需要从烟草中发掘更多、作用更强的抗病基因，为培育抗青枯病烟草品种提供新的基因资源和策略，具有重要的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种抗病基因NtTBWRG1在烟草青枯病防治中的应用，该抗病基因可有效用于烟草青枯病抗性品种的培育中，实现了显著增强烟草的青枯病抗性的目的，转基因植株的青枯病病情指数为20～30，达到抗病级别，具有重要的应用价值和很好的开发前景。

为了达到上述目的，本发明提供了一种抗病基因NtTBWRG1在由青枯雷尔氏菌引起的烟草青枯病防治中的应用，所述基因的编码序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种过表达NtTBWRG1基因在显著增强烟草的青枯病抗性中的应用，所述基因的编码序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了一种具有青枯病抗性的转基因烟草植株的构建方法，包括以下步骤：

构建抗病基因NtTBWRG1的表达载体35S:NtTBWRG1；

利用农杆菌菌株LBA4404介导的叶盘转化法将35S:NtTBWRG1表达载体转入烟草感病品种翠碧一号CB-1中，通过潮霉素筛选标记筛选，获得具有青枯病抗性的转基因烟草植株。

作为优选，转基因烟草植株中NtTBWRG1的表达量比非转基因对照CB-1提高了1.25～7.22倍。

作为优选，转基因烟草植株的青枯病病情指数为20～30。

本发明提供了一种抗病基因NtTBWRG1在制备促进烟草植株生长制剂中的应用，所述基因的编码序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选，所述促进烟草植株生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

在当前烟草青枯病育种中缺少高效特异的抗病基因的背景下，本发明为烟草青枯病抗病基因功能研究和生物育种提供了有效的抗病基因，并可以将其用于培育烟草青枯病抗性品种中，实现了显著增强烟草的青枯病抗性的目的，转基因植株的青枯病病情指数为20～30，达到抗病级别。因此，该抗病基因在烟草生物育种中具有重要的应用价值和很好的开发前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的所得PCR产物的条带示意图；

图2为本发明实施例提供的载体pCAMBIA1300构建过程示意图；

图3为本发明实施例提供的转基因植株的获得；

图4为本发明实施例提供的转基因植物中NtTBWRG1基因的表达量检测；

图5为本发明实施例提供的苗期抗病性示意图；

图6为本发明实施例提供的苗期病情指数示意图；

图7为本发明实施例提供的成株期抗病性示意图；

图8为本发明实施例提供的成株病情指数示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1抗病基因NtTBWRG1 PCR产物的获得

提取烟草品种翠碧一号(CB-1)根系RNA，利用反转录试剂盒

以cDNA为模板，使用基因扩增引物，利用高保真酶TransStart FastPfu Fly DNA，扩增基因编码序列。其中：PCR反应体系为：cDNA 2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，5×Flybuffer 10μL，dNTP mix 10μL，Pfu Fly 2μL，ddH

NtTBWRG1-F：GGTACCaATGGCTGAAGCAGCAGTTTCC

NtTBWRG1-R：GGTACCTCAATCAGTATTGACATTCGT

扩增程序为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃3min，35个PCR循环，72℃10min。

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，利用全式金公司生产的DNA片段回收试剂盒(

实施例2载体pCAMBIA1300构建

将回收的目的条带通过酶切连接的方法连接到双元载体pCAMBIA1300载体上。首先纯化产物及载体利用KpnI限制性内切酶进行酶切处理。酶切反应体系为：DNA 20μL，5×buffer 10μL，KpnI 5μL，ddH

将获得的酶切后的基因DNA片段与线性化载体片段进行连接(使用Thermo FisherScientific公司的T4 DNA连接酶，连接体系参照公司说明书)。将连接反应体系轻轻混匀，16℃反应过夜，随后采用热击转化的方法，将构建好的载体5μL加入到50μL感受态细胞中进行转化。转化条件为：冰置30min，42℃热击30s，冰置5min后加入500μL液体LB培养基并于37℃活化菌体1h，最后均匀涂布于含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基上，置37℃培养8-10h。待长出单菌落后，采用PCR及测序的方法鉴定阳性克隆，确认大肠杆菌中含有构建正确的35S:NtTBWRG1表达载体，构建过程如图2所示。

实施例3转基因植株的获得

农杆菌LBA4404具有侵染植物和转移基因的能力，故需要将构建的35S:NtTBWRG1表达载体转入农杆菌。将测序正确的载体采用冻融的方法转化农杆菌感受态LBA4404。将5μL载体加入到50μL感受态细胞中，混匀后冰置5min。液氮中处理5min，再冰置5min后加入500μL液体LB培养基，28℃培养2h后均匀涂布于含有50mg/L卡那霉素和利福平的固体LB培养基上，放置28℃培养2-3d。待长出单菌落后，采用PCR及测序的方法鉴定阳性克隆，以确定35S:NtTBWRG1表达载体转入了农杆菌LBA4404。

利用农杆菌菌株LBA4404介导的叶盘转化法将35S:NtTBWRG1表达载体转入烟草感病品种翠碧一号(CB-1)，通过潮霉素筛选标记筛选获得转基因阳性植株。进一步提取转基因植物的DNA为模板，利用35S特异启动子引物进行PCR扩增，最后鉴定到14株阳性植株。其中：PCR反应体系为：DNA 1μL，正向引物1μL，反向引物1μL，5×buffer 10μL，dNTP mix 10μL，全式金

35S-F：GAATTTCGACCTGCAGGT；

35S-R：GATAGTGGGATTGTGCGT。

扩增程序为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃30s，35个PCR循环，72℃10min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶经EB染色后利用紫外光检测电泳条带，如图3所示，转基因阳性植株中扩增出大小为582bp的DNA条带，非转基因空对照(CB-1)无扩增条带。

实施例4转基因植物中NtTBWRG1基因的表达量检测

提取转基因植株根系总RNA，利用反转录试剂盒

以cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对NtTBWRG1基因的表达量进行检测，设置3个生物学重复。利用全式金

如图4所示的qPCR结果可知，转基因植株#1-#14中NtTBWRG1的表达量较非转基因对照提高了1.25～7.22倍。

实施例5苗期抗病性

以感病品种CB-1为对照，选择NtTBWRG1的表达量相对较高的#3和#9转基因植株进行青枯病抗病性的苗期接种鉴定，实验设置3次生物学重复，每个重复25株。在25℃的人工气候室中，将烟苗培养至四叶一心期，利用灌根接种的方法接种青枯病菌。

接种条件为：将菌株GMI1000(NCBI登录号为AF295251)在TTC固体培养基上划线活化，30度培养箱中培养2～3天，挑取菌落于LB液体培养基中进行扩大培养，于30℃、200rpm培养至OD

如图5所示的结果表明，接种后14天，非转基因对照品种CB-1大部分植株已经发病死亡，而转基因植株#3和#9的绝大部分植株仍然正常生长发育，表现出对青枯病较高的抗性。

实施例6苗期病情指数

对接种后14天的植株的发病情况进行统计，结果如表1所示。统计标准为：

0级：烟苗无发病症状；

1级：1-2片叶片半萎蔫，或茎基部退绿条斑占株高1/3以下；

3级：2-3片叶片萎蔫，或茎基部退绿条斑占株高1/3～1/2；

5级：健叶1-2片，或茎基部退绿条斑占株高1/2～2/3；

7级：叶片全部萎蔫，或茎基部退绿条斑占株高2/3以上；

9级：整株枯死。

表1苗期植株发病情况

病情指数计算公式为：

结果如图6所示，对于苗期病情指数而言，对照品种CB-1为83，而转基因植株#3为25，#9为11。这也表明NtTBWRG1基因的表达量越高，转基因植株的青枯病抗性越强。

实施例7成株期抗病性

以感病品种CB-1为对照，选择NtTBWRG1的表达量相对较高的#3和#9转基因植株进行成株期的青枯病抗病性鉴定。实验设置3次生物学重复，每个重复25株。在试验田中，烟苗自然生长到高温高湿的7月份，于7月1日，利用灌根接种的方法接种青枯病菌。

接种条件为：将菌株GMI1000(NCBI登录号为AF295251)在TTC固体培养基上划线活化，30度培养箱中培养2～3天，挑取菌落于LB液体培养基中进行扩大培养，于30度、200rpm培养至OD

结合图7所示结果可见，田间接种后60天，非转基因对照品种CB-1大部分植株已经干枯死亡，而转基因植株#3和#9的绝大部分植株仍然正常生长发育，叶片持绿，表现出对青枯病较好的抗性。

实施例8成株病情指数

对接种后60天的植株发病情况进行统计，结果如表2所示。统计标准为：

0级：整株无发病症状；

1级：茎基部偶有褪绿斑；

3级：茎基部有褪绿斑或有条斑一侧有少数叶片萎蔫；

5级：茎部有黑色条斑，但未达到植株顶端，或病测半数以上叶片萎蔫；

7级：茎部黑色条斑达到植株顶端，或病测2/3以上叶片凋萎；

9级：整株基本枯死。

表2成株期植株发病情况

病情指数计算公式为：

结合图8所示结果可知，对于成株期病情指数而言，对照品种为90，而转基因植株#3为32，#9为19。这也表明NtTBWRG1基因过表达显著增强了烟草的青枯病抗性。