一种类蛇毒肽的制备方法

技术领域

本发明属于肽合成技术领域，具体涉及一种类蛇毒肽的制备方法。

背景技术

类蛇毒肽（CAS号：823202-99-9）最早是由DSM荷兰皇家帝斯曼集团全资子公司PENTAPHARM通过高科技生化科技，模仿有效分子蛋白（Waglerin1）的片段合成得到，其化学结构与毒蛇血清相似，但是相比肉毒杆菌却更安全有效，故可安全应用到化妆品中，具有优秀的光滑肌肤、迅速祛皱性能。

目前常规合成类蛇毒肽（H-β-Ala-Pro-DAB-NH-Bzl）的方法大多采用固相、液相相结合的方法，合成过程比较繁杂、成本高。为了在一定程度上简化工艺，研究者们开发了全液相合成类蛇毒三肽的方法，比如专利申请CN107936108A公开了如下合成路线：将Boc-β-Ala-OH、N-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸内盐和H-Pro-OMe-HCl反应得到Boc-β-Ala-Pro-OMe，Boc-β-Ala-Pro-OMe与LiOH反应得到Boc-β-Ala-Pro-OH；然后采用相同方法以Boc-β-Ala-Pro-OH和H-DAB(Boc)-OMe-HCl合成Boc-β-Ala-Pro DAB(Boc)-OH；再将Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-OH、1-羟基苯丙三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺和苄胺反应得到Boc-β-Ala-Pro-DAB(Boc)-NH-Bzl，最后用三氟乙酸脱去Boc保护基并经HPLC分离纯化，得到纯度98％左右的类蛇毒肽，总产率为38％左右，其合成路线较长，处理步骤繁琐，合成过程中许多试剂的用量较大。专利申请CN107857797A公开了另一种合成类蛇毒肽的方法，该方法总产率为30％左右，反应结束需分离纯化处理后才能得到纯度较高的类蛇毒肽产品，合成步骤长，操作繁琐。

并且，上述研究都未实现类蛇毒肽公斤级制备。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种类蛇毒肽的制备方法，该方法采用新的合成路线，并实现类蛇毒肽公斤级制备。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种类蛇毒肽的制备方法，按如下合成路线制备：

。

所述合成路线中，化合物2的制备步骤包括：

将化合物1（L-谷氨酰胺）溶于水中，再加入乙腈和碳酸钠混匀；向体系中加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯（Fmoc-OSU）并控制体系温度为0-10℃，加完后升温至20-25℃反应2h；反应结束后用HCl调节pH=4-6，过滤，干燥，得到化合物2。

所述合成路线中，化合物3的制备步骤包括：

将化合物2加入到N,N-二甲基甲酰胺中；向体系中加入1-羟基苯并三唑（HOBT）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和2,6-二甲基吡啶，控制体系温度为0-10℃继续加入苄胺，加完后升温至20-25℃反应2h；反应结束后加入水淬灭，过滤，干燥，得到化合物3。

所述合成路线中，化合物4的制备步骤包括：

将化合物3加入到N,N-二甲基甲酰胺中；将体系温度控制在0-10℃，加入水、吡啶和[双(三氟乙酰氧基)碘]苯（PIFA），加完后升温至20-25℃反应2h；反应结束后加入水淬灭，过滤，用二氯甲烷萃取水相后浓缩干燥，得到化合物4。

所述合成路线中，化合物5的制备步骤包括：

将化合物4加入到二氯甲烷中，控制体系温度为0-10℃加入二碳酸二叔丁酯（Boc

所述合成路线中，化合物6的制备步骤包括：

将化合物5加入到二氯甲烷中，控制体系温度为0-10℃加入二乙胺，加完后升温至20-25℃反应2h；反应结束后用HCl调节pH=1-2，加入甲基叔丁基醚（MTBE）萃取两次，收集水相用NaOH调节pH=10-11，再用二氯甲烷萃取两次，浓缩得到化合物6。

所述合成路线中，化合物8的制备步骤包括：

将化合物7（Boc-β-丙氨酸）溶于二氯甲烷中，加入N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）；控制体系温度为0-10℃，滴加N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）的二氯甲烷溶液，加完后升温至20-25℃反应3h；反应结束后过滤，浓缩滤液得到化合物8。

所述合成路线中，化合物9的制备步骤包括：

将L-脯氨酸、水、乙腈和碳酸氢钠混匀，向体系中滴加化合物8的乙腈溶液并控制体系温度为0-10℃，调节体系pH=8后升温至20-25℃反应5h；反应结束后浓缩去除乙腈，水相加入二氯甲烷后降温至0℃，用盐酸调节至pH=2.5，分层后取二氯甲烷层，水相萃取2次后合并二氯甲烷层，水洗、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩干燥得到化合物9。

所述合成路线中，化合物10的制备步骤包括：

将化合物9溶于二氯甲烷中，加入N-羟基丁二酰亚胺混匀，向体系中滴加N,N'-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液并控制体系温度为0-10℃，加完后升温至20-25℃反应3h；反应结束后过滤，浓缩滤液得到化合物10。

所述合成路线中，化合物11的制备步骤包括：

将化合物6、水、乙腈、碳酸氢钠混匀，向体系中滴加化合物10的乙腈溶液并控制体系温度为0-10℃，调节体系pH=8后升温至20-25℃反应5h；反应结束后浓缩去除乙腈，水相加入二氯甲烷，分层后取二氯甲烷层，水相萃取2次后合并二氯甲烷层，水洗、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩干燥得到化合物11。

所述合成路线中，化合物12（类蛇毒肽）的制备步骤包括：

将化合物11溶于甲醇中，控制体系温度为25-35℃滴加HCl乙酸乙酯溶液，加完后20-25℃反应5h；反应结束后加入乙酸乙酯，搅拌，过滤，干燥，得到化合物12。

优选的，化合物2的制备步骤中，化合物1、水、乙腈、碳酸钠、9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯的用量比为10mol:7.5L:7.5L:10mol:10mol。

优选的，化合物3的制备步骤中，化合物2、N,N-二甲基甲酰胺、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2,6-二甲基吡啶和苄胺的用量比为10mol:19L:10mol:10mol:10mol:10mol。

优选的，化合物4的制备步骤中，化合物3、N,N-二甲基甲酰胺、水、吡啶、[双(三氟乙酰氧基)碘]苯的用量比为11mol:25L:5L:22mol:16mol。

优选的，化合物5的制备步骤中，化合物4、二氯甲烷、二碳酸二叔丁酯和N,N-二异丙基乙胺的用量比为11mol:25L:33mol:38mol。

优选的，化合物6的制备步骤中，化合物5、二氯甲烷和二乙胺的用量比为11mol:25L:33mol。

优选的，化合物8的制备步骤中，N,N'-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液浓度为1.5mol/L，化合物7、二氯甲烷、N-羟基丁二酰亚胺和N,N'-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液的用量比为5mol:11L:6mol:4L。

优选的，化合物9的制备步骤中，化合物8的乙腈溶液浓度为0.56mol/L，L-脯氨酸、水、乙腈、碳酸氢钠、化合物8的乙腈溶液的用量比为5mol:12L:2.6L:16mol:9L。

优选的，化合物10的制备步骤中，N,N'-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液浓度为1.5mol/L，化合物9、二氯甲烷、N-羟基丁二酰亚胺和N,N'-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液的用量比为5mol:18L:6mol:4L。

优选的，化合物11的制备步骤中，化合物10的乙腈溶液浓度为0.56mol/L，化合物6、水、乙腈、碳酸氢钠和化合物10的乙腈溶液的用量比为5mol:12L:2.8L:16mol:9L。

优选的，化合物12的制备步骤中，HCl乙酸乙酯溶液的浓度为4M，化合物11、甲醇和HCl乙酸乙酯溶液的用量比为2mol:5L:2.6L。

本发明从商业可得的L-谷氨酰胺出发，经过Fmoc保护胺基、关键步骤EDCI的酰胺缩合和PIFA的Hofmann重排、Boc保护胺基、脱Fmoc，以及支链从商业可得的Boc-β-丙氨酸出发，经过DCC催化和L-脯氨酸酰胺缩合，而后N-羟基丁二酰亚胺活化羧基，两个片段酰胺缩合，最后脱Boc得到最终产品类蛇毒肽。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明采用新的合成路线，反应结束后无需分离纯化即可得到纯度大于98％的终产品类蛇毒肽，工艺简单，操作方便。

（2）本发明实现了类蛇毒肽公斤级制备，合成工艺高效便捷，可大大降低生产成本，更适合实际生产应用，适合大规模工业化生产，值得推广。

（3）本发明最终产物可以结晶方式在溶液里析出，然后过滤干燥即可得到目标产品，比现有制备技术更容易工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例类蛇毒肽的合成路线。

图2为本发明实施例合成的类蛇毒肽的核磁图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例

如图1所示，本实施例提供一种类蛇毒肽的制备方法，按如下步骤进行：

合成化合物2：将化合物1（L-谷氨酰胺，10mol）溶于7.5L水中，加入7.5L乙腈，加入碳酸钠（10mol）；向体系中加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯（Fmoc-OSU，10mol）并控制体系温度为0℃，加完后升温至25℃反应2h；反应结束后用4M HCl调节pH=5，过滤，干燥，得到化合物2粗品进行下一步。

合成化合物3：将化合物2（10mol）加入到19L N,N-二甲基甲酰胺中；向体系中加入1-羟基苯并三唑（HOBT，10mol），加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI，10mol），加入2,6-二甲基吡啶（10mol），控制体系温度为0℃继续加入苄胺（10mol），加完后升温至25℃反应2h；反应结束后加入40L水淬灭，过滤，干燥得到化合物3粗品进行下一步。

合成化合物4：将化合物3（11mol）加入到25L N,N-二甲基甲酰胺中；将体系温度控制在0℃，加入5L水，加入吡啶（22mol），加入[双(三氟乙酰氧基)碘]苯（PIFA，16mol分20批加入），加完后升温至25℃反应2h；反应结束后加入40L水淬灭，过滤，用二氯甲烷萃取水相，浓缩干燥得到化合物4粗品进行下一步。

合成化合物5：将化合物4（11mol）加入到25L二氯甲烷中；控制体系温度为0℃加入二碳酸二叔丁酯（Boc

合成化合物6：将含化合物5的反应液（约含11mol化合物5）加入到25L二氯甲烷中，控制体系温度为0℃加入二乙胺（33mol），加完后升温至25℃反应2h；反应结束后加入水10L，加入4M HCl调节pH=2，加入MTBE 10L萃取两次，收集水相加入2M NaOH调节pH=10，加入10L二氯甲烷萃取两次，浓缩得到化合物6粗品进行下一步。由化合物1直至合成化合物6五步总收率为54%。

合成化合物8：将化合物7（Boc-β-丙氨酸，5mol）溶于11L二氯甲烷中，加入N-羟基丁二酰亚胺（HOSu，6mol）；滴加4L N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC，6mol）的二氯甲烷溶液，控制体系温度为0℃，加完后升温至25℃反应3h；反应结束后过滤，浓缩滤液得到化合物8粗品进行下一步。

合成化合物9：在20L反应釜中加入L-脯氨酸（5mol），加入水12L，加入2.6L乙腈，加入碳酸氢钠（16mol）；向体系中滴加9L化合物8（5mol）的乙腈溶液，控制体系温度为0℃，在反应过程中，用pH试纸检测酸碱性，加入25g碳酸钠调节pH值在8左右，升温至25℃反应5h；反应结束后浓缩去除乙腈，水相加入10L二氯甲烷后降温到0℃，用浓盐酸小心酸化到pH=2.5，分层后取二氯甲烷层，水相萃取2次，每次取3L，合并二氯甲烷层，3L水洗一次，4L饱和食盐水洗一次后，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到化合物9粗品进行下一步。

合成化合物10：将化合物9（5mol）溶于18L二氯甲烷中，加入N-羟基丁二酰亚胺（6mol），滴加4L N,N'-二环己基碳二亚胺（6mol）的二氯甲烷溶液，控制体系温度为0℃，加完后升温至25℃反应3h；反应结束后过滤，浓缩滤液得到化合物10粗品进行下一步。由化合物7直至合成化合物10三步总收率为95%。

合成化合物11：在20L反应釜中加入化合物6（5mol），加入水12L，加入2.8L乙腈，加入碳酸氢钠（16mol），滴加9L化合物10（5mol）的乙腈溶液，控制体系温度为0℃，用pH试纸检测酸碱性，加入25g碳酸钠调节pH值在8左右，加完后升温至25℃反应5h；反应结束后浓缩除去乙腈，水相加入二氯甲烷10L，分层后取二氯甲烷层，水相萃取2次，每次3L，合并二氯甲烷层，3L水洗一次，4L饱和食盐水洗一次，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到化合物11粗品进行下一步。

合成化合物12（类蛇毒肽）：将化合物11（2mol）溶于5L甲醇中，控制体系温度为25℃，滴加4M HCl乙酸乙酯溶液2.6L，加完后25℃反应5h；反应结束后，控制体系温度为25℃，滴加乙酸乙酯21L，搅拌2h，过滤，干燥，得到化合物12，即终产物类蛇毒肽，总产率为9.7%。

终产物核磁图谱如图2所示，表明本发明成功合成了类蛇毒肽。1H NMR (400 MHz,Deuterium Oxide) δ 7.77–6.97 (m, 5H), 4.51–4.41 (m, 4H), 3.62 (t, J = 6.9 Hz,2H), 3.26–2.57 (m, 6H), 2.42–1.53 (m, 6H)。

本发明采用新的合成路线，反应结束后无需分离纯化即可得到纯度大于98％的终产品类蛇毒肽，工艺简单，操作方便。

本发明实现了类蛇毒肽公斤级制备，合成工艺高效便捷，可大大降低生产成本，更适合实际生产应用，适合大规模工业化生产，值得推广。

本发明最终产物可以结晶方式在溶液里析出，然后过滤干燥即可得到目标产品，比现有制备技术更容易工业化生产。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。