双向双驱序贯式血小板HLA抗体检测的微流控芯片及应用

技术领域

本发明属于体外诊断及免疫检测技术领域，特别涉及一种双向双驱序贯式血小板HLA抗体检测的微流控芯片及应用。

背景技术

目前成分输血越来越广泛地应用于临床，输注血小板作为重要的临床输血治疗手段，尤其是对治疗血小板缺乏引起的出血倾向、血小板功能性障碍具有重要价值。血小板抗体检测常用于医疗诊断中，部分患者体内产生血小板抗体致使血小板输注无效导致输血效率低下，血液资源浪费，甚至致使严重并发症的发生，如输血后紫癜、免疫性血小板减少性紫癜、重度出血等，因此输血前进行血小板抗体检测对于改善输血效果尤为重要。此外，在妊娠期妇女的常规检查中，检测血小板抗体有助于避免新生儿同种免疫血小板减少症发生。

血小板表达HLA-I类抗原，由HLA复合体编码表达。由于HLA复合体具有极丰富的多态性，在无亲缘关系的个体间几乎不存在完全相同的个体。因此，人群中不同个体HLA具有不同的抗原特异性。为此，任何个体在接触异种HLA抗原的细胞的情况下，均会导致HLA抗体的产生，如有孕产史的妇女，异体输血史等情况。血小板只表达HLA-I类抗原，孕产史的妇女，或输血史的个体，均有可能产生针对HLA-I类抗原的抗体，后文简述为血小板HLA抗体。当患者输注血小板时，需要检测患者体内是否存在针对供者血小板HLA的抗体，或选择和患者血清相匹配的供者血小板，故习惯称之为血小板配型试验。

目前，超过80%的血小板输注无效因为血小板HLA抗体引起，使用的检测方法多为固相凝集法，该方法需血清量大，实际操作需一小时以上，其中包括反复多次的清洗步骤，结果判读模式较为主观且易受影响，准确度不高。且该方法需专业人员操作，无法在医院即时完成血液配型检测，需送往血站统一进行血液配型，患者无法实现快速输血。血小板抗体检测金标准为单克隆抗体特异性血小板抗原固定试验（Monoclonal Immobilization ofPlatelet Antigen，MAIPA），该实验有较好的准确性，但操作步骤繁琐，用时极长，且对操作人员要求很高，只限于在实验室开展而无法普及到临床。

发明内容

本发明针对现有血小板HLA抗体在常规检测的不足，提供一种双向双驱序贯式血小板HLA抗体检测的微流控芯片及应用，利用该芯片可以比较完美整合常规血小板HLA抗体检测的复杂流程，大幅减少血小板抗体检测所需时间，使临床输血的前期受者体内血小板抗体检测工作更为快速和便捷。

为实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的，一种双向双驱序贯式血小板HLA抗体检测的微流控芯片，包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道左端与盖片上开设的第二加样孔连通，右端与第二废液区连通，所述第二废液区设置有可移动的滤纸片，所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道，所述微通道从左到右依次设置有标记区、检测区、质控区，所述盖片上还开设有第一加样孔，所述第一加样孔设置在所述质控区与第二废液区之间的微通道上方，并与微通道相连通，所述标记区与检测区之间设置有第一废液区，所述第一废液区设置在所述微通道宽度方向的两端，并通过设置在微通道上的单向液流通道与所述微通道相连通，所述标记区设置有标记抗人IgG抗体，所述检测区包被有血小板捕获抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述盖片下表面沿其长度方向设置有凹槽，所述盖片通过所述凹槽与所述基片上表面围合形成微通道。

在本发明的一个实施方案中，所述单向液流通道设置在所述盖片下表面，且两端连通所述微通道，所述单向流通道左端与微通道连通处的宽度小于微通道其他位置的宽度，且所述单向液流通道从左到右逐渐变窄，所述第一废液区与单向流通道最宽处的前后两端相连通。

在本发明的一个实施方案中，所述第一废液区设置在所述盖片下表面，所述第一废液区设置有吸水材料。

在本发明的一个实施方案中，所述标记区、检测区、质控区、第二废液区均设置在所述基片上表面。

在本发明的一个实施方案中，所述基片上表面对应所述第一加样孔、第二加样孔的位置处均设置有缓冲液干粉。

另一方面，本发明还提供了一种利用上述任一一个技术方案中的微流控芯片对血小板HLA抗体进行检测的应用，包括至少以下步骤：

1）在第一加样孔滴加待检血小板，液体流动方向是由右向左移动，血小板优先以侧向流方式与检测区的血小板捕获抗体结合，剩余样本或样本中其它物质被收集在第一废液区；

2）在第一加样孔滴加待检血清，液体流动方向是由右向左移动，血清优先以侧向流方式与检测区结合的血小板相结合，剩余样本或样本中其它物质被收集在第一废液区；

3）在第二加样孔注入蒸馏水，同时将位于第二废液区的滤纸片左移，与微通道内液体接触，液体由左向右移动，溶解标记区的标记抗人IgG抗体，标记抗体继续移动至检测区、质控区，与检测区、质控区结合，而过剩的标记抗体随液流被收集在第二废液区；

4、按常规微流控读取检测区和质控区的信号值。

通过上述技术方案得到的双向双驱序贯式血小板HLA抗体检测的微流控芯片及应用，其有益效果是：

1.简化血小板抗体检测流程、缩短检测时间

微流控芯片的微小尺寸和精密制造能够实现准确的流体操纵和反应控制，可以达到微米级别的精度，比传统实验方法更为准确，且更适合POCT分析模式。使用微流控芯片整合复杂的实验步骤，只需少量血清样本即可检测且无需专业人员操作，相较现有方法可极大缩短实验时间，提高工作效率，为临床诊断提供便携，且结果以信号值的方式呈现，相较固相凝集法则更为精准，不被实验操作人员主观判断影响。

2.规避非特异性IgG干扰

常规微流控检测模式中待检血清优先与藻红蛋白标记的鼠抗人IgG混合，形成复合物后再流经检测区，而待检血清中存在大量非特异性IgG抗体，标记二抗与非特异性抗体结合，对待检抗体的检测结果形成干扰。本技术发明采用“双向”液流的模式，使血小板与待检血清从右至左依次序贯流经检测区，逐步被捕获，非特异性IgG抗体被废液池吸收后，标记二抗再从左至右流经检测区，以此规避非特异性IgG的干扰，提高检测敏感度。

附图说明

图1是本发明所述微流控芯片的结构示意图；

图2是本发明所述基片上表面的结构示意图；

图3是本发明所述盖片下表面的结构示意图；

图4是本发明所述第二废液区的滤纸片驱动液体流向的示意图；

图5是本发明其中一个技术方案的血小板HLA抗体阳性血清检测微流控芯片的结构示意图；

图6是本发明在图5的芯片上滴加待检血小板的原理图;

图7是本发明在图5的芯片上滴加待测血清后的原理图；

图8是本发明在图5的芯片上滴加蒸馏水后原理图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明总体来说涉及免疫检测技术领域，涉及血小板HLA抗体检测，本技术发明的核心基于微流控技术，设计一种“双向+双驱”的免疫微流控芯片，该芯片比较完美整合常规血小板HLA抗体检测的复杂流程，大幅减少血小板抗体检测所需时间，使临床输血的前期受者体内血小板抗体检测工作更为快速和便捷。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的解释说明，可以理解的是，本发明并不限于描述的具体实施方式。

如图1所示，本发明提出一种双向双驱序贯式血小板HLA抗体检测的微流控芯片，包括基片及压合于基片上的盖片，基片和盖片围合形成微通道，所述微通道左端与盖片上开设的第二加样孔B连通，右端与第二废液区W2连通，所述第二废液区W2设置有可移动的滤纸片，所述滤纸片移动时接触或远离所述微通道，通过移动滤纸片控制微通道内液体向第二废液区W2的流动，所述微通道从左到右依次设置有标记区L、检测区T、质控区C，所述盖片上还开设有第一加样孔S，所述第一加样孔S设置在所述质控区C与第二废液区W2之间的微通道上方，并与微通道相连通，所述标记区L与检测区T之间设置有第一废液区W1，所述第一废液区W1设置在所述微通道宽度方向的两端，并通过设置在微通道上的单向液流通道D与所述微通道相连通，当液体从单向液流通道D右侧的微通道向左侧流动时，通过单向液流通道D后进入第一废液区W1，当液体从单向液流通道D右侧的微通道向左侧流动时，则不会进入单向液流通道D，所述标记区L设置有标记抗人IgG抗体，所述检测区T包被有血小板捕获抗体。

所述质控区C按常规设置，例如包被有与标记抗人IgG抗体发生特异性结合的抗抗体，用于确定检测过程是否有效。

如图3所示，所述盖片下表面沿其长度方向设置有凹槽，所述盖片通过所述凹槽与所述基片上表面围合形成微通道。

所述单向液流通道D设置在所述盖片下表面，且两端连通所述微通道，所述单向流通道D左端与微通道连通处的宽度小于微通道其他位置的宽度，且所述单向液流通道D从左到右逐渐变窄，所述第一废液区W1与单向流通道D最宽处的前后两端相连通。

所述第一废液区W1设置在所述盖片下表面，所述第一废液区W1设置有吸水材料。

当液体从单向液流通道D左侧的微通道向右侧流动时，由于微通道开口变小，虹吸作用下，液体加速流入单向液流通道D，并继续进入单向液流通道D右侧的微通道，不会进入第一废液区；当液体从单向液流通道D右侧的微通道向左侧流动时，由于单向液流通道D逐渐变宽，液体进入单向液流通道D流速减慢，并向单向液流通道D宽度方向扩散，此时会被与单向液流通道D两端相连的第一废液区W1的吸水材料吸附，流入第一废液区W1。

如图2所示，所述标记区L、检测区T、质控区C、第二废液区W2均设置在所述基片上表面。

所述基片上表面对应所述第一加样孔B、第二加样孔S的位置处均设置有缓冲液干粉。

所述标记抗人IgG抗体为藻红蛋白标记的抗体。

实施例

以血小板HLA抗体阳性血清检测为例，说明双向双驱微流控芯片的检测原理：

微流控芯片的结构如图5所示，

标记区：包被藻红蛋白标记鼠抗人IgG抗体。

检测区：检测区包被GPⅡb/Ⅲa抗体（血小板捕获抗体）。

质控区：兔抗鼠抗体（可与藻红蛋白标记鼠抗人IgG抗体分子结合）。

如图4、图6所示，检测时，先将第二废液区的滤纸片置于右侧，不与通道相连，将待测血小板加入第一加样孔，在微通道驱动力作用下从右向左流动，与检测区的GPⅡb/Ⅲa抗体结合，未结合物质在滤纸片驱动下流入第一废液区并收集。

如图7所示，将含阳性抗体的待检血清加入第一加样孔，同样向左流动，血小板抗体与检测区结合的血小板相连，未结合物质流入第一废液区并收集。

如图4、8所示，将第二废液区的滤纸片向左推动，与微流控通道相结合，此时于第二加样孔滴加蒸馏水，迅速溶解缓冲液干粉，液体在微通道驱动力作用下向右移动，溶解藻红蛋白包被的鼠抗人IgG抗体，继续向右流经检测区与质控区，剩余标记抗体流动至第二废液区。

此时使用检测仪器检测检测区与质控区的信号强度并输出检测结果（检测仪器为常规技术，例如荧光检测仪，与标记抗体携带的信号一致即可）。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。