双特异性抗MerTK和抗PDL1抗体及其使用方法
文献发布时间：2024-04-18 20:00:50
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技术领域
本公开涉及双特异性抗MerTK和抗PDL1抗体及此类抗体的用途(例如治疗用途)。
背景技术
Mer酪氨酸激酶(MerTK)属于受体酪氨酸激酶TAM(
已鉴定了MerTK的几种配体，包括蛋白S(ProS或ProS1)、生长抑制特异性基因6(Gas6)、Tubby、Tubby样蛋白1(TULP-1)和半乳凝素-3。MerTK通过配体结合后的活化来传导来自胞外空间的信号，导致MerTK酪氨酸自动磷酸化(Cummings等人，2013,Clin CancerRes,19:5275-5280；Verma等人，2011,Mol Cancer Ther,10:1763-1773)和后续ERK和AKT相关性信号转导。
MerTK调节各种生理过程，包括细胞存活、迁移和分化。MerTK配体ProS和Gas6有助于若干种致癌过程，诸如细胞存活、侵袭、迁移、化疗耐药和转移，其中它们的表达通常与不良临床结果相关。此外，MerTK与许多癌症有关，并且MerTK或ProS缺乏与抗肿瘤作用相关(Cook等人，2013,J Clin Invest,123:3231-3242；Ubil等人，2018,J Clin Invest,128:2356-2369；Huey等人，2016,Cancers,8:101)。然而，MerTK也在视网膜色素上皮细胞上表达，并在清除眼中脱落的光感受器外节中起关键作用；MerTK中的功能丧失突变导致色素性视网膜炎和其他视网膜营养不良(参见例如Al-khersan等人，Graefes Arch Clin ExpOphthalmol,2017,255:1613-1619；Lorach等人，Nature Scientific Reports,2018,8:11312；Audo等人，Human Mutation,Wiley,2018,39:997-913；LaVail等人，Adv Exp MedBiol,2016,854:487-493)。
MerTK在吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬(胞葬作用)中起重要作用，导致M2样巨噬细胞极化、产生抗炎细胞因子并促进免疫抑制肿瘤微环境。降低吞噬细胞的胞葬作用增加了M1样巨噬细胞极化，从而导致产生促炎性细胞因子和免疫活性环境。调节胞葬作用可以提供抗肿瘤活性的有效手段。
抗MerTK抗体先前已在例如以下文献中描述：国际专利申请公开号WO2020/214995、WO2020/076799、WO2020/106461、WO2020/176497、WO2019/084307、WO2019/005756、WO2016/106221、WO2016/001830、WO2009/062112和WO2006/058202；国际专利申请序列号PCT/US2020/064640(WO 2021/119508)；以及例如Dayoub和Brekken,2020,CellCommunications and Signaling,18:29；Zhou等人，2020,Immunity,52:1-17；Kedage等人，2020,MABS,12:e1685832；Cummings等人，2014,Oncotarget,5:10434-10445。
需要可有效治疗病状诸如癌症的新的治疗性抗MerTK抗体。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，据此以引用的方式整体并入。
发明内容
国际专利申请序列PCT/US2020/064640(WO 2021/119508)公开的是，在小鼠肿瘤模型中施用抗MerTK抗体和抗PDL1抗体的组合，与施用单独抗体相比，显示出肿瘤体积的更大程度的减小，表明组合治疗获得更好的疗效。然而，施用两种不同的抗体为临床医生和患者都带来了负担。本公开通过提供双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体来满足这一需求，所述双特异性抗体在介导抗肿瘤免疫方面具有改善的功效。
应当理解，本文所述的各种实施方案的一个、一些或全部性质可以组合以形成本公开的其他实施方案。本公开的这些和其他方面对于本领域技术人员来说将变得显而易见。本公开的这些和其他方面将通过以下具体实施方式来进一步描述。
在一些方面，本文提供了一种结合至人Mer酪氨酸激酶(MerTk)和程序性死亡配体1(PDL1)的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体含有结合至人MerTK的第一抗原结合结构域和结合至PDL1的第二抗原结合结构域。
在一些方面，第一抗原结合结构域结合至MerTK蛋白的Ig1结构域。
在一些方面，第一抗原结合结构域竞争性抑制如下抗体结合至MerTK，所述抗体包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第一抗原结合结构域结合至与如下抗体相同的MerTK表位，所述抗体包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第一抗原结合结构域含有SEQ ID NO:9的氨基酸31-35的HVR-H1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸50-66的HVR-H2、含有SEQ ID NO:9的氨基酸99-109的HVR-H3、含有SEQ ID NO:10的氨基酸24-34的HVR-L1、含有SEQ ID NO:10的氨基酸50-56的HVR-L2和含有SEQ ID NO:10的氨基酸89-97的HVR-L3。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含16.2抗体的HVR，任选地其中HVR是Kabat定义的HVR、Chothia定义的HVR、AbM定义的HVR或contact定义的HVR。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ IDNO:9的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ IDNO:10的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变重链和/或含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第一抗原结合结构域结合至与如下抗体相同的MerTK表位，所述抗体包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第一抗原结合结构域竞争性抑制如下抗体结合至MerTK，所述抗体包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸31-35的HVR-H1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸50-66的HVR-H2、含有SEQ ID NO:13的氨基酸99-108的HVR-H3、含有SEQ ID NO:14的氨基酸24-34的HVR-L1、含有SEQ ID NO:14的氨基酸50-56的HVR-L2和含有SEQ ID NO:14的氨基酸89-97的HVR-L3。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含13.11抗体的HVR，任选地其中HVR是Kabat定义的HVR、Chothia定义的HVR、AbM定义的HVR或contact定义的HVR。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ IDNO:13的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ IDNO:14的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第二抗原结合结构域结合至与如下抗体相同的PDL1表位，所述抗体包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第二抗原结合结构域竞争性抑制如下抗体结合至PDL1，所述抗体包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，第二抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸31-35的HVR-H1、含有SEQ ID NO:52的氨基酸50-66的HVR-H2、含有SEQ ID NO:52的氨基酸99-107的HVR-H3、含有SEQ ID NO:53的氨基酸24-34的HVR-L1、含有SEQ ID NO:53的氨基酸50-56的HVR-L2和含有SEQ ID NO:53的氨基酸89-97的HVR-L3。
在一些方面，第二抗原结合结构域包含阿替利珠单抗(atezolizumab)抗体的HVR，任选地其中HVR是Kabat定义的HVR、Chothia定义的HVR、AbM定义的HVR或contact定义的HVR。
在一些方面，第二抗原结合结构域包含可变重链，所述可变重链包含与SEQ IDNO:52的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，第二抗原结合结构域包含可变轻链，所述可变轻链包含与SEQ IDNO:53的氨基酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些方面，第二抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的可变轻链。
在一些方面，双特异性抗体属于IgG类、IgM类或IgA类。
在一些方面，双特异性抗体属于IgG类，任选地其中双特异性抗体具有IgG1、IgG2或IgG4同种型。
在一些方面，双特异性抗体是IgG1抗体。
在一些方面，双特异性抗体是IgG4抗体。
在一些方面，双特异性抗体(i)具有包含不同抗原结合结构域的两条臂，(ii)是对两个不同表位具有特异性的单链抗体，(iii)是化学连接的双特异性(Fab’)2片段，(iv)是产生对每种靶抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体的两个单链双抗体的融合体，(v)是产生多价分子的scFv与双抗体的组合，(vi)包含与人Fab-臂的两个末端融合的两个scFv，或(vii)是双抗体。
在一些方面，双特异性抗体是κ-λ体、双亲和力再靶向分子(DART)、杵臼结构(knob-in-hole)抗体、链交换工程化结构域体(SEED体)或DuoBody。
在一些方面，双特异性抗体包含Fc区，所述Fc区包含第一多肽和第二多肽。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换T366Y，并且第二多肽包含氨基酸置换Y407T。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换T366W，并且第二多肽包含氨基酸置换T366S、L368W和Y407V。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换T366W，并且第二多肽包含氨基酸置换T366S、L368A和Y407V。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换T366W和S354C，并且第二多肽包含氨基酸置换T366S、L368A、Y407V和Y349C。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换T350V、L351Y、F405A、Y407V，并且第二多肽包含氨基酸置换T350V、T366L、K392L和T394W。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换K360D、D399M和Y407A，并且第二多肽包含氨基酸置换E345R、Q347R、T366V和K409V。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换K409D和K392D，并且第二多肽包含氨基酸置换D399K和E356K。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换K360E和K409W，并且第二多肽包含氨基酸置换Q347R、D399V和F405T。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换L360E、K409W和Y349C，并且第二多肽包含氨基酸置换Q347R、D399V、F405T和S354C。在一些方面，第一多肽包含氨基酸置换K370E和K409W，并且第二多肽包含氨基酸置换E357N、D399V和F405T。在一些方面，置换是根据EU编号的。
在一些方面，双特异性抗体包含杵突变和臼突变。
在一些方面，根据EU编号，杵突变包含氨基酸置换T366W。
在一些方面，根据EU编号，臼突变包含氨基酸置换T366S、L368A和Y407V。
在一些方面，双特异性抗体包含Fc区，所述Fc区包含促进异二聚化的氨基酸置换、添加或缺失。
在一些方面，根据EU编号，双特异性抗体包含氨基酸置换S228P。
在一些方面，根据EU编号，双特异性抗体包含氨基酸置换L234A、L235A和P331S(LALAPS)。
在一些方面，根据EU编号，双特异性抗体包含氨基酸置换N325S和L328F(NSLF)。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸1-449或SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸1-449或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸1-449或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸1-446或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸1-453或SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸1-449或SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸1-449或SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸1-446或SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸1-446或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸1-448或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:23的氨基酸1-448或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸1-448或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸1-445或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:37的氨基酸1-448或SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸1-448或SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸1-448或SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸1-445或SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸1-445或SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸1-447或SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸1-447或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸1-447或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸1-444或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸1-447或SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸1-447或SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸1-447或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸1-444或SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸1-444或SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链。
在一些方面，双特异性抗体包含轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链恒定区。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链恒定区。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链恒定区。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链恒定区。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链恒定区。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸1-449或SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:27的氨基酸1-447或SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸1-449或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:28的氨基酸1-447或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸1-449或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:29的氨基酸1-447或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸1-446或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:30的氨基酸1-444或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸1-448或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:27的氨基酸1-447或SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:23的氨基酸1-448或SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:28的氨基酸1-447或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸1-448或SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:29的氨基酸1-447或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸1-445或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:30的氨基酸1-444或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸1-453或SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:42的氨基酸1-447或SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸1-449或SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:43的氨基酸1-447或SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸1-449或SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:44的氨基酸1-447或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸1-446或SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:45的氨基酸1-444或SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸1-446或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:46的氨基酸1-444或SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:37的氨基酸1-448或SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:42的氨基酸1-447或SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸1-448或SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:43的氨基酸1-447或SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸1-448或SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:44的氨基酸1-447或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸1-445或SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:45的氨基酸1-444或SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸1-445或SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链、含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链、含有SEQ ID NO:46的氨基酸1-444或SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链以及含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，双特异性抗体能够同时结合MerTK和PDL1。
在一些方面，双特异性抗体降低吞噬细胞的胞葬作用。
在一些方面，双特异性抗体以约4nM至约16nM的IC50值降低胞葬作用。
在一些方面，双特异性抗体以约4nM至约5nM或约15nM至约16nM的IC50值降低胞葬作用。
在一些方面，吞噬细胞是巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞或树突细胞。
在一些方面，吞噬细胞是巨噬细胞。
在一些方面，双特异性抗体抑制肿瘤生长。
在一些方面，双特异性抗体降低ProS与MerTK的结合。
在一些方面，双特异性抗体降低Gas6与MerTK的结合。
在一些方面，双特异性抗体降低ProS与MerTK的结合，并降低Gas6与MerTK的结合。
在一些方面，双特异性抗体以约2nM至约30nM的结合亲和力结合至人MerTK，任选地其中双特异性抗体以约2nM或约30nM的结合亲和力结合至人MerTK。
在一些方面，双特异性抗体也结合至食蟹猴MerTk。
在一些方面，双特异性抗体以约2nM至约30nM的结合亲和力结合至食蟹猴MerTK，任选地其中双特异性抗体以约2nM或约30nM的结合亲和力结合至食蟹猴MerTK。
在一些方面，双特异性抗体也结合至鼠MerTK。
在一些方面，双特异性抗体以约40nM的结合亲和力结合至鼠MerTK。
在一些方面，双特异性抗体不结合至鼠MerTK。
在一些方面，双特异性抗体降低Gas6介导的AKT磷酸化。
在一些方面，双特异性抗体以约9nM至约13nM的IC50值降低Gas6介导的AKT磷酸化，任选地其中双特异性抗体以约9nM或约13nM的IC50值降低Gas6介导的AKT磷酸化。
在一些方面，双特异性抗体是鼠抗体、人类抗体、人源化抗体、单克隆抗体、多价抗体、缀合抗体或嵌合抗体。
在一些方面，本文提供了本文所述的任何双特异性抗体的人源化形式。
在一些方面，双特异性抗体是重组抗体。
在一些方面，双特异性抗体是分离的抗体。
在一些方面，本文提供了一种分离的核酸，其包含编码本文所述的任何双特异性抗体的核酸序列。在一些方面，本文提供了一种载体，其包含核酸。
在一些方面，本文提供了一种分离的宿主细胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的载体。
在一些方面，分离的宿主细胞包含(i)包含编码本文所述的任何双特异性抗体的第一抗原结合结构域的可变重链的核酸序列的核酸；(ii)包含编码双特异性抗体的第一抗原结合结构域的可变轻链的核酸序列的核酸；(iii)包含编码双特异性抗体的第二抗原结合结构域的可变重链的核酸序列的核酸；和(iv)包含编码双特异性抗体的第二抗原结合结构域的可变轻链的核酸序列的核酸；
在一些方面，分离的宿主细胞包含(i)包含编码双特异性抗体的第一抗原结合结构域的重链的核酸序列的核酸；(ii)包含编码双特异性抗体的第一抗原结合结构域的轻链的核酸序列的核酸；(iii)包含编码本文所述的任何双特异性抗体的第二抗原结合结构域的重链的核酸序列的核酸；和(iv)包含编码双特异性抗体的第二抗原结合结构域的轻链的核酸序列的核酸。
在一些方面，本文提供了一种产生结合至人MerTK和PDL1的双特异性抗体的方法，所述方法包括培养本文所述的任何细胞，从而产生双特异性抗体。
在一些方面，所述方法还包括回收由细胞产生的双特异性抗体。
在一些方面，本文提供了一种双特异性抗体，其通过本文所述的方法产生。
在一些方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任何双特异性抗体和药学上可接受的载体。
在一些方面，本文提供了一种治疗个体癌症的方法，所述方法包括向个体施用治疗有效量的本文所述的任何双特异性抗体或本文所述的药物组合物。在一些方面，癌症是结肠癌、卵巢癌、肝癌或子宫内膜癌。
在一些方面，施用不会导致个体的视网膜病变。
在一些方面，本文提供了一种用于检测样品中的MerTK的方法，其包括将所述样品与本文所述的任何双特异性抗体接触。
附图说明
图1A、图1B、和图1C列出的数据显示本公开的某些抗MerTK:抗PDL1双特异性抗体分别与过表达人PDL1的CHO细胞、过表达人MerTK的CHO细胞和M2c分化的人巨噬细胞的结合。
图2列出的数据显示本公开的各种双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低吞噬细胞的胞葬作用。
图3列出的数据显示用本公开的各种双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体处理的细胞中的pAKT/tAKT水平。
图4列出的数据显示在不存在MerTK配体huGas6的情况下，用本公开的各种双特异性抗MerTK:抗PDL1处理的细胞中的pAKT活性的倍数变化。
图5列出的数据显示，与用二价抗PDL1抗体和二价抗MerTK抗体MTK-16.2或抗MerTK抗体MTK-33.11的组合治疗的动物中观察到的肿瘤体积相比，用二价抗PDL1抗体治疗的动物体内肿瘤体积减小。
图6列出的数据显示，施用对照抗体、二价抗PDL1抗体、以及二价抗PDL1抗体与二价抗MerTK抗体MTK-16.2或二价抗MerTK抗体MTK-33.11的组合的个体小鼠中的肿瘤体积变化。
具体实施方式
本公开涉及抗MerTK抗体(例如，单克隆抗体)；制备和使用此类抗体的方法；包含此类抗体的药物组合物；编码此类抗体的核酸；以及包含编码此类抗体的核酸的宿主细胞。
本领域技术人员使用常规方法可以很好地理解和一般地采用本文描述或参考的技术和程序，所述常规方法例如广泛采用的方法，诸如Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编,(2003)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,OxfordUniversity Press,2000)描述的那些。
I.定义
除非另外指明，否则术语“MerTK”或“MerTK多肽”或“MerTK蛋白”在本文中可互换使用，是指来自任何脊椎动物来源的任何天然MerTK，所述脊椎动物来源包括哺乳动物(诸如灵长类动物(例如，人类和食蟹猴(cynos))和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠))。MerTK也被称为c-mer、MER、原癌基因c-Mer、受体酪氨酸激酶MerTK、酪氨酸蛋白激酶MER、STK激酶、RP38和MGC133349。在一些实施方案中，该术语涵盖野生型序列和天然存在的变体序列(例如，剪接变体或等位基因变体)二者。在一些实施方案中，该术语涵盖“全长”、未经加工的MerTK以及由细胞中的加工产生的任何形式的MerTK。在一些实施方案中，MerTK是人MerTK。如本文所用，术语“人MerTK”是指具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。
术语“抗MerTK抗体”、“结合至MerTK的抗体”和“特异性结合MerTK的抗体”是指能够以足够的亲和力结合MerTK的抗体，所述亲和力足以使得所述抗体可用作靶向MerTK的诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗MerTK抗体与不相关的非MerTK多肽的结合程度小于抗体与MerTK的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量。在某些实施方案中，结合至MerTK的抗体具有的解离常数(KD)<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如，10
关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或者“特异性地结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或者对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“具有特异性”意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量。例如，特异性结合可以通过与类似于靶标的对照分子(例如，过量的未标记的靶标)的竞争来测定。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性抑制，则表示特异性结合。如本文所用，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或者“特异性结合至”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或者对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“具有特异性”可以例如通过对靶标的KD为约10
术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与“抗体”互换使用。本文中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且特别涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)(包括由至少两种完整抗体形成的那些)和抗原结合抗体片段，只要它们表现出所期望的生物学活性即可。
“天然的抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫键的数量在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间有所不同。每一重链和轻链还具有规则地间隔开的链内二硫桥。每一重链在一端具有可变结构域(V
关于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,第8版,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
可以根据来自任何脊椎动物物种的轻链的恒定结构域的氨基酸序列，将轻链归类为两种明显不同的类型(称为卡帕(“κ”)和兰姆达(“λ”))中的一种。可以根据免疫球蛋白的重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，将免疫球蛋白归类为不同的类别或同种型。免疫球蛋白有五种类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们具有的重链分别称为阿尔法(“α”)、德尔塔(“δ”)、艾普斯龙(“ε”)、伽马(“γ”)和缪(“μ”)。γα可以根据CH序列和功能的相对较小差异，将和类进一步分为子类(同种型)，例如人类表达以下子类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的，并且通常在例如Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology,第4版(W.B.Saunders Co.,2000)中有所描述。
抗体(诸如本公开的抗MerTK抗体)的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“V
术语“可变”是指下述事实：即在抗体(诸如本公开的抗MerTK抗体)间，可变结构域的某些区段在序列上广泛不同。可变结构域介导抗原结合，并且定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变结构域跨度中并非均匀分布。相反，在轻链和重链可变结构域中，可变性集中在三个称为高变区(HVR)的区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其大多采用β-折叠构型，通过三个HVR连接，这三个HVR形成连接β-折叠结构(在一些情况下形成β-折叠结构的一部分)的环。每条链中的HVR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与另一条链的HVR一起，有助于抗体的抗原-结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of ImmunologicalInterest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能，诸如抗体对抗体依赖性细胞毒性的参与。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体(诸如本公开的单克隆抗MerTK抗体)，即构成该抗体群的各单独抗体，除了可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化等)之外，其他方面是相同的。单克隆抗体具有高度特异性(针对单个抗原位点)。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们通过杂交瘤培养来合成，未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法来产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于以下方法中的一种或多种：用DNA、病毒样颗粒、多肽和/或细胞中的一种或多种对动物(包括但不限于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、仓鼠和/或鸡)进行免疫的方法，杂交瘤方法，B细胞克隆方法，重组DNA方法，以及用于在具有编码人免疫球蛋白序列的部分或全部人免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人或人样抗体的技术。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换使用，是指与抗体片段相比，基本上完整形式的抗体(诸如抗MerTK抗体)。具体而言，完全抗体包括具有包含Fc区的重链和轻链的那些。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或它们的氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应子功能。
术语“单价抗体”或“单臂抗体”是指具有对靶抗原有特异性的单一抗原结合结构域的抗体(即抗体包含不超过一个抗原结合结构域)。在一些实施方案中，单个抗原结合结构域包含单个可变区重链多肽和单个可变区轻链多肽。对于靶为“单价”的抗体包含该靶的不超过一个抗原结合结构域。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该完整抗体结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')
如本文所用，术语“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合位点”和类似术语是指抗体分子中包含赋予抗体分子抗原特异性的氨基酸残基的部分(例如，高变区(HVR))。
抗体(诸如本公开的抗MerTK抗体)的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为“Fab”片段的抗原结合片段和残留的“Fc”片段(反映易于结晶的能力的名称)。Fab片段由整个轻链以及重链的可变区结构域(V
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区的序列确定，所述Fc区也由某些类型细胞上存在的Fc受体(FcR)识别。
抗体(诸如本公开的抗MerTK抗体)的“功能片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合或可变区，或者保留或具有经修饰的FcR结合能力的抗体的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双抗体”是指通过使用V
如本文所用，“嵌合抗体”是指这样的抗体(免疫球蛋白)(诸如本公开的嵌合抗MerTK抗体)：其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的对应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来源于另一个物种或属于另一个抗体类别或子类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所期望的生物学活性即可。本文关注的嵌合抗体包括
非人类(例如，鼠科动物)抗体的“人源化”形式(诸如本公开的抗MerTK抗体的人源化形式)是包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人类FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)对应于非人类抗体的HVR，并且全部或基本上全部FR对应于人类抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人类抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
“人类抗体”是具有对应于人类产生的抗体(诸如本公开的抗MerTK抗体)的氨基酸序列和/或已经使用如本文公开的制备人类抗体的技术中的任一者来制备的抗体。人类抗体的此定义明确排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可以使用本领域已知的多种技术(包括噬菌体展示文库和酵母展示文库)来产生。人类抗体可以通过将抗原施用于转基因动物来制备，以及经由人类B细胞杂交瘤技术来产生，所述转基因动物已被修饰为响应于抗原挑战而产生此类抗体，但是转基因动物的内源性基因座已失能(例如，免疫化的xenomice)。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域(诸如本公开的抗MerTK抗体的可变结构域)的区域，所述区域的序列是高变的和/或形成在结构上定义的环。通常，抗体包含六个HVR；V
许多HVR描述正在使用中并且涵盖在本文中。在一些实施方案中，HVR可以是基于序列可变性的Kabat互补决定区(CDR)且使用最为广泛(Kabat等人，同上)。在一些实施方案中，HVR可以是Chothia CDR。而Chothia是指结构环的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些实施方案中，HVR可以是AbM HVR。AbM HVR代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷方案，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。在一些实施方案中，HVR可以是“contact”HVR。“contact”HVR基于可用的复合物晶体结构的分析。来自这些HVR中每一者的残基如下所示。
HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)，VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(优选的实施方案)(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些扩展的HVR定义中的每一种，可变结构域残基根据Kabat等人，同上进行编号。
“框架”或“FR”残基是除如本文定义的HVR残基之外的那些可变结构域残基。
如本文所用，“接受体人类框架”是包含来源于人类免疫球蛋白框架或人类共有框架的V
“人类共有框架”是在人类免疫球蛋白V
在例如本公开的抗MerTK抗体的指定位置处的“氨基酸修饰”是指特定残基的置换或缺失，或邻近指定残基的至少一个氨基酸残基的插入。“邻近”指定残基的插入意指在该指定残基的一个至两个残基内的插入。插入可以在指定残基的N末端或C末端。本文的优选氨基酸修饰是置换。
“Fv”是包含完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(各自来自H和L链的3个环)，这六个高变环贡献了用于抗原结合的氨基酸残基，并且将抗原结合特异性赋予抗体。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力小于整个结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接至单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含V
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)，并且随抗体同种型而变化的那些生物学活性。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可有所变化，但通常将人IgG重链Fc区界定为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可在例如抗体的产生或纯化期间或通过重组工程改造编码抗体重链的核酸来去除。因此，完整抗体的组成可包含去除全部K447残基的抗体群体、未去除K447残基的抗体群体，以及具有含有和不含有K447残基的抗体混合物的抗体群体。适用于本公开的抗体中的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；和天然序列人类IgG4 Fc区以及它们的天然存在的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一种氨基酸修饰(优选地一个或多个氨基酸置换)而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区在天然序列的Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸置换，例如约一个至约十个氨基酸置换，并且优选地约一个至约五个氨基酸置换。本文的变体Fc区优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少80％的同源性，最优选地与它们具有至少90％的同源性，更优选地至少95％的同源性。
“Fc受体”或“FcR”描述结合至抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII子类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有相似的氨基酸序列，所述氨基酸序列的主要区别在于它们的胞质结构域。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(“ITAM”)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(“ITIM”)。其他FcR(包括未来鉴定的那些FcR)也涵盖在本文的术语“FcR”中。FcR还可以增加抗体的血清半衰期。
如本文所用，就肽、多肽或抗体序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”是指在比对序列和引入空位(如果需要的话)，以实现最大序列同一性百分比之后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守置换的情况下，与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN
当在竞争相同表位或重叠表位的抗体的语境中使用时，术语“竞争”意指抗体之间的竞争，如通过所测试的抗体防止或抑制(例如，减少)参考分子(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，MerTK或其片段)的特异性结合的测定法所确定。许多类型的竞争性结合测定可用于确定抗体是否与另一种抗体竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等人，1983,Methods inEnzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等人，1986,J.Immunol.137:3614-3619)固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人，1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung,等人，1990,Virology 176:546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，这种测定法涉及使用结合至固体表面或携带这些未标记的测试抗体和标记的参考抗体中的任一者的细胞的纯化的抗原。竞争性抑制通过在存在测试抗体的情况下测定结合至固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，测试抗体过量存在。通过竞争测定法鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合至与参考抗体相同的表位的抗体和结合至与参考抗体所结合的表位足够近的邻近表位以发生空间位阻的抗体。通常，当竞争性抗体过量存在时，其将抑制(例如，减少)参考抗体与共同抗原的特异性结合至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97.5％和/或几乎100％。
如本文所用，MerTK多肽和第二多肽之间的“相互作用”涵盖但不限于蛋白质-蛋白质相互作用、物理相互作用、化学相互作用、结合、共价结合和离子结合。如本文所用，当抗体破坏、减少或完全消除两种多肽之间的相互作用时，所述抗体“抑制”两种多肽之间的“相互作用”。当多肽的抗体结合至两种多肽中的一种时，本公开的多肽的抗体“抑制”两种多肽之间的“相互作用”。在一些实施方案中，相互作用可以被抑制至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97.5％和/或几乎100％中的任一者。
术语“表位”包括能够被抗体结合的任何决定簇。表位是被靶向抗原的抗体结合的抗原的区域，并且当抗原是多肽时，包括直接接触抗体的特定氨基酸。最常见的是，表位位于多肽上，但是在一些情况下，可以位于其他种类的分子(诸如核酸)上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原具有特异性的抗体将优先识别多肽和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原上的表位。
“分离的”抗体(诸如本公开的分离的抗MerTK抗体)是已经从抗体的产生环境的组分(例如，天然的或重组的)鉴定、分离和/或回收的抗体。优选地，分离的抗体与抗体的产生环境的所有其他污染组分无关。抗体的产生环境的污染组分，诸如从重组转染细胞产生的那些污染组分，是通常会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至以下程度：(1)通过例如Lowry方法测定的抗体的超过95重量％，在一些实施方案中，抗体的超过99重量％；(2)通过使用旋转杯测序仪达到足以获得至少15个N-末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下使用考马斯蓝或优选银染达到均一性。因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在，所以分离的抗体包括重组T细胞内的原位抗体。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽或抗体。
编码抗体(诸如本公开的抗MerTK抗体)的“分离的”核酸分子是从至少一种污染核酸分子鉴定和分离的核酸分子，所述污染核酸分子通常与分离的核酸分子产生的环境有关。优选地，分离的核酸与产生环境相关的所有组分无关。编码本文的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于所述核酸分子在自然界中存在的形式或背景。所以，分离的核酸分子不同于编码本文的天然存在于细胞中的多肽和抗体的核酸。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够运输所连接的另一种核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，其是指其中可连接额外DNA区段的环状双链DNA。另一类载体为噬菌体载体。另一类载体为病毒载体，其中其他DNA区段可连接至病毒基因组中。某些载体能够在已引入其的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合至所述宿主细胞的基因组中，并且由此随宿主基因组一同复制。此外，某些载体能够引导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或简称“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中可用的表达载体通常呈质粒形式。由于质粒是载体的最常用形式，所以在本说明书中“质粒”与“载体”可互换使用。
如本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物或者可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应整合进聚合物的任何底物。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然、偶然或有意突变，子代不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态或基因组DNA补体方面)。宿主细胞包括在体内经本发明的多核苷酸转染的细胞。
如本文所用，“载剂”包括在所采用的剂量和浓度下对所暴露的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。
如本文所用，术语“治疗”是指被设计为在临床病理的过程中改变被治疗的个体的自然病程的临床干预。期望治疗效应包括降低特定疾病、病症或疾患的进展速率、改善或减轻病理状态，以及缓解或改良预后。例如，如果与特定疾病、病症或病状相关的一种或多种症状得以减轻或消除，则个体得到成功“治疗”。
“有效量”是指至少在必要的剂量下和时间期内有效实现所期望的治疗结果的量。有效量可以在一次或多次施用中提供。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或有害效果的量。对于治疗用途，有益的或期望的结果包括临床结果，诸如减少由疾病引起的一种或多种症状，提高患有所述疾病的人的生活质量，降低治疗所述疾病所需的其他药物的剂量，例如通过靶向来增强另一种药物的效果，延缓疾病的进展，和/或延长生存期。药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现治疗性治疗的量。如在临床语境中所理解，有效量的药物、化合物或药物组合物可以或不可以与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，“有效量”可以在施用一种或多种治疗剂的语境中考虑，并且如果单一药剂与一种或多种其他药剂联合可以实现或已实现所期望的结果，则所述单一药剂可以被认为以有效量给予。
对于治疗目的，“个体”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家畜和农场动物、动物园动物、运动动物或宠物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、貂、大鼠、猫等等。在一些实施方案中，个体是人类。
如本文所用，与另一种化合物或组合物“联合”或“组合”施用包括同时施用和/或在不同时间施用。联合或组合施用还涵盖作为共制剂施用或作为单独的组合物施用，包括以不同的给药频率或间隔施用，并且使用相同的施用途径或不同的施用途径。在一些实施方案中，联合施用是作为相同的治疗方案的一部分施用。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”一个值或参数包括(且描述)关于所述值或参数本身的实施方案。
除非上下文另外明确指明，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物。例如，对“抗体”的提及是指对一种至多种抗体的提及，诸如摩尔量，并且包括本领域技术人员已知的它们的等同物等等。
应当理解，本文所述的本公开的方面和实施方案包括“包括方面和实施方案”、“由方面和实施方案组成”和“基本上由方面和实施方案组成”。
II.双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体
本文提供了双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体。本文提供的抗体可用于例如治疗MerTK相关病症。
在一个方面，本公开提供了结合至本公开的MerTK蛋白或多肽内的表位的分离的(例如，单克隆)抗体。本公开的MerTK蛋白或多肽包括但不限于哺乳动物MerTK蛋白或多肽、人MerTK蛋白或多肽、小鼠(鼠类)MerTK蛋白或多肽和食蟹猴MerTK蛋白或多肽。本公开的MerTK蛋白和多肽包括MerTK的天然存在的变体。在一些实施方案中，本公开的MerTK蛋白和多肽是膜结合的。在一些实施方案中，本公开的MerTK蛋白和多肽是MerTK的可溶性胞外结构域。
在一些实施方案中，MerTK在细胞中表达。在一些实施方案中，MerTK在吞噬细胞中表达，所述吞噬细胞包括但不限于巨噬细胞和树突细胞。在一些实施方案中，MerTK在单核细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、小神经胶质细胞、内皮细胞、巨核细胞和血小板中表达。在一些实施方案中，在卵巢、前列腺、睾丸、肺、视网膜和肾中也发现了高水平的MerTK表达。此外，MerTK在许多癌症中显示异位表达或过表达(Linger等人，2008,Adv Cancer Res,100:35-83)。
III.MerTK结合配偶体
本公开的MerTK蛋白与一种或多种配体或结合配偶体相互作用(例如结合)，所述配体或配偶体包括但不限于蛋白S(ProS或ProS1)、生长抑制特异性基因6(Gas6)、Tubby、Tubby样蛋白1(TULP-1)和半乳糖凝集素-3。本公开的抗MerTK抗体可以影响MerTK与其各种配体和结合配偶体中的一种或多种的相互作用。特别地，亲本小鼠抗MerTK抗体MTK-16和亲本小鼠抗MerTK抗体MTK-33有效阻断Gas6配体和ProS配体与MerTK的结合，如国际专利申请序列号PCT/US2020/064640)(WO 2021/119508)中所公开的。
IV.pAKT
AKT活性是Gas6与MerTK、Axl或Tyro-3受体结合的下游靶标。例如，MerTK配体Gas6与MerTK的结合诱导AKT磷酸化(pAKT)(参见例如Angelillo-Scherrer等人，2008,J ClinInvest,118:583-596；Moody等人，2016,Int J Cancer,139:1340-1349)。双特异性抗MerTK：本公开的抗PDL1抗体以剂量依赖性方式有效降低人巨噬细胞(例如M2c分化的人巨噬细胞)中Gas6介导的磷酸-AKT(pAKT)活性。因此，本公开的抗MerTK:抗PDL1抗体有效降低Gas6介导的MerTK信号传导，如由pAKT水平的降低所证明的。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体在体外抑制或降低Gas6介导的pAKT活性。
双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低细胞中的pAKT活性的相对有效性可以通过测量IC50值来确定。Gas6介导的pAKT活性降低的IC50值可以使用本领域技术人员已知的方法来确定，例如在以下实施例13中描述的方法。
V.胞葬作用
胞葬作用是指濒死细胞或凋亡细胞的吞噬清除。胞葬作用可由专职性吞噬细胞(例如巨噬细胞、树突细胞、小胶质细胞)、非专职性吞噬细胞(例如上皮细胞、成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞)或专门吞噬细胞完成。(Elliott等人，2017,J Immunol,198:1387-1394)。胞葬作用导致在死亡或濒死细胞的膜完整性被破坏且其细胞内容物泄漏到周围组织中之前移除死亡细胞或濒死细胞，从而防止组织暴露于毒性酶、氧化剂和其他细胞内组分。
凋亡细胞在其细胞表面上暴露出多种分子(“吃掉我”信号)，这些分子被吞噬细胞上的受体识别。一种此类“吃掉我”信号传导分子是磷脂酰丝氨酸(PtdSer)，它通常局限于细胞膜的内小叶。在细胞凋亡期间，PtdSer暴露于细胞膜的外小叶。MerTK配体ProS和Gas6在其N-末端结构域附近含有γ-羧基化谷氨酸残基；谷氨酸结构域的γ-羧基化能够结合至磷脂酰丝氨酸。Gas6或ProS结合至凋亡细胞上的PtdSer，同时结合吞噬细胞上的MerTK。此类配体与MerTK的接合活化了胞葬作用。
如以下实施例12所示，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体有效降低吞噬细胞的胞葬作用活性。
因此，在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低了吞噬细胞的胞葬作用。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低了巨噬细胞的胞葬作用。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低了树突细胞的胞葬作用。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低了骨髓来源的巨噬细胞的胞葬作用。可用本领域技术人员已知的标准方法，诸如本文实施例12中所述的方法，测定胞葬作用的降低。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体以约0.13nM至约30nM范围内的IC50降低吞噬细胞(例如人巨噬细胞)的胞葬作用，如通过本文实施例12中描述的方法所评估。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体以约4.4nM至约15.68nM范围内的IC50值降低吞噬细胞的胞葬作用。
阻断胞葬作用驱动M1样巨噬细胞极化，从而导致促炎性细胞因子(例如TNF、IFN、IL-12)的产生增加和细胞毒性细胞诸如CD8+T细胞和自然杀伤细胞的募集，其介导抗肿瘤免疫。通过降低吞噬细胞的胞葬作用，本公开的抗MerTK:抗PDL1抗体因此有效增加M1样巨噬细胞极化，并增加促炎性细胞因子/趋化因子的产生、表达和/或分泌，所述促炎性细胞因子/趋化因子包括TNF、IFN、IL-6、IL-1、IL-12、趋化因子(C-X-C基序)配体1(CXCL-1，KC)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP1，CCL2)、巨噬细胞炎性蛋白-1-α(MIP-1α，CCL3)和/或巨噬细胞炎性蛋白-1-β(MIP-1β，CCL4)。
已描述了胞葬作用和癌症进展之间的联系。例如，使用膜联蛋白V阻断胞葬作用充分减少了肿瘤进展和转移，所述膜联蛋白V阻断PtdSer与吞噬细胞的胞葬作用机制相互作用(Stach等人，2000,Cell Death Diff,7:911；Bondanza等人，2004,J Exp Med,200:1157；Werfel和Cook,2018,Sem Immunopathology,40:545-554)。此外，MerTK与其PtdSer桥接配体Gas6一样，与许多人类癌症的不良预后和存活相关(Graham等人，2014,Nat Rev Cancer,14:769；Linger等人，2010,Expert Opin Ther Targets,14:1073-1090；Wang等人，2013,Oncogene,32:872；Jansen等人，2011,J Proteome Res,11:728-735；Tworkoski等人，2011,Mol Cancer Res,p.molcanres-0512；Graham等人，2006,Clin Cancer Res,12:2662-2669；Keating等人，2006,Oncogene,25:6092)。因此，本公开的抗MerTK抗体降低吞噬细胞的胞葬作用，因此有效减少肿瘤进展和转移。
食蟹猴研究表明，在某些情况下，阻断结合至Gas6和ProS两者二价抗MerTK抗体(例如抗MerTK抗体MTK-16)，与在施用阻断ProS与MerTK的结合但不阻断Gas6与MerTK的结合的二价抗MerTK抗体的食蟹猴中观察到的结果相比，显示出更低的体内毒性(例如体重减轻)。因此，在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体对MerTK是单价的且阻断Gas6和ProS与MerTK的结合，与本公开的阻断ProS与MerTK的结合但不阻断Gas6与MerTK的结合的抗MerTK抗体相比，显示更少的体内毒性。抗MerTK抗体MTK-16和抗MerTK抗体MTK-33(两者都阻断Gas6和ProS与MerTK的结合)结合至MerTK蛋白的Ig1结构域，而抗MerTK抗体MTK-15(阻断ProS与MerTK的结合，但不阻断Gas6与MerTK的结合)结合至MerTK蛋白的Ig2和FN1结构域两者(参见国际专利申请序列号PCT/US2020/064640(WO 2021/119508)。因此，在一些实施方案中，与结合至MerTK的Ig2和FN1结构域的抗MerTK抗体相比，结合至MerTK的Ig1结构域的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体(例如，双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体MTK-16、MTK-16.2、MTK-33和MTK-33.11)表现出更低的全身体内毒性。此外，在一些实施方案中，与结合至MerTK的Ig2和FN1结构域的二价抗MerTK相比，结合至MerTK的Ig1结构域并表现出降低的pAKT活性(部分由于其单价构型)的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体(例如，双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体MTK-16、MTK-16.2、MTK-33和MTK-33.11)可表现出更低的全身体内毒性。
双特异性抗体构型
双特异性抗体的许多不同形式和用途是本领域已知的(在例如Kontermann；DrugDiscov Today,2015年7月；20(7):838-47；MAbs,2012年3月至4月；4(2):182-97中综述)。根据本发明的双特异性抗体不限于任何特定的双特异性形式或其产生方法。因此，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体可以包括多种构型的双特异性抗体，其具有结合至人MerTK的第一抗原结合结构域和结合至PDL1的第二抗原结合结构域。
可用于本公开中的双特异性抗体分子的实例包括(i)单一抗体，其具有包含不同抗原结合结构域的两条臂；(ii)单链抗体，其对两个不同表位具有特异性，例如通过由额外肽接头串联连接的两个scFv；(iii)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有通过短肽连接串联的两个可变结构域(Wu等人，Generation and Characterization of aDual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig.TM.)Molecule,In:AntibodyEngineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)Tandab，其是产生具有针对每种靶抗原的两个结合位点的四价双特异性抗体的两个单链双抗体的融合体；(vi)flexibody，其是产生多价分子的scFv与双抗体的组合；(vii)所谓的“对接锁定(dock and lock)”分子，其基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”，当应用于Fab时，其可以产生由两个相同的Fab片段与不同Fab片段的连接物组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的Scorpion分子，其包含例如两个scFv与人fa B-臂两个末端的融合物；和(ix)双抗体。
在一些方面，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体的二聚化Fc区由Fc区形成，所述Fc区含有促进异二聚化的氨基酸突变、置换、添加或缺失，其中包含不同Fc区的不同多肽可发生二聚化以产生异二聚体构型。在一个方面，本公开的双特异性抗体包含含有第一CH3区的第一Fc序列和含有第二CH3区的第二Fc序列，其中第一CH3区和第二CH3区的序列不同，并且使得所述第一CH3区和第二CH3区之间的异二聚体相互作用比所述第一CH3区和第二CH3区的每个同二聚体相互作用更强。
促进Fc区异二聚化的方法包括Fc区氨基酸序列的氨基酸缺失、添加或置换，例如通过包括一组“杵臼结构”缺失、添加或置换，或者包括实现Fc的静电操纵以有利于不同多肽链之间的吸引相互作用的氨基酸缺失、添加或置换。用于促进互补Fc多肽异二聚化的方法先前已描述于例如Ridgway等人，1996,Protein Eng,9:617-621；Merchant等人，1998,Nature Biotechnol,16:677-681；Moore等人，2011,MAbs,3:546-557；Von Kreudenstein等人，2013,5:646-654；Gunasekaran等人，2010,J Biol Chem,285:19637-19464；Leaver-Fay等人，2016,Structure,24:641-651；Ha等人，2016,Frontiers in Immunology,7:1；Davis等人，2010,Protein Eng Des Sel,23:195-202；WO1996/027011；WO1998/050431；WO2006/028936；WO2009/089004；WO2011/143545；WO2014/067011；WO2012/058768；WO2018/027025；US2014/0363426；US2015/0307628；US2018/0016354；US2015/0239991；US2017/0058054；USPN5731168；USPN7183076；USPN9701759；USPN9605084；USPN9650446；USPN8216805；USPN8765412；和USPN8258268。
例如，在一些实施方案中，Fc异二聚体的互补Fc多肽包括改变Fc二聚体界面电荷极性，使得静电匹配的Fc区域的共表达支持有利的吸引相互作用，从而促进所需Fc异二聚体形成的突变；而不利的排斥电荷相互作用抑制了不想要的Fc同二聚体的形成(Guneskaran等人，2010,J Biol Chem,285:19637-19646)。当在细胞中共表达时，多肽链之间的结合是可能的，但是由于电荷排斥，这些链基本上不会自缔合。
此外，Fc异二聚体的互补Fc多肽包括“杵-臼”构型，以促进两个Fc多肽的异二聚化。“杵臼结构”技术描述于例如美国专利号5,731,168；7,695,936；8,216,805；8,765,412；Ridgway等人，Prot Eng9,617-621(1996)；和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。通常，所述方法包括在第一多肽的界面上引入突起(“杵”)和在第二多肽的界面上引入相应空腔(“臼”)，使得突起可以位于空腔中，从而促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换第一多肽界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换较大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面上产生与突起大小相同或相似的补偿性空腔。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过定点诱变或通过肽合成，形成突起和空腔。在一个特定实施方案中，杵修饰包含Fc结构域两个亚基中的一个中的氨基酸置换T366W，并且臼修饰包含Fc结构域两个亚基中的另一个亚基中的氨基酸置换T366S、L368A和Y407V。在另一个特定实施方案中，包含杵修饰的Fc结构域亚基另外包含氨基酸置换S354C，并且包含臼修饰的Fc结构域亚基另外包含氨基酸置换Y349C。这两个半胱氨酸残基的引入导致Fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。因此，在此类构型中，第一Fc区多肽包含形成“杵”的氨基酸修饰，并且第二Fc区多肽包含形成“臼”的氨基酸修饰，从而形成包含互补Fc多肽的Fc异二聚体。
Fc异二聚体构型的互补Fc多肽的示例性成对氨基酸修饰在下表A(EU编号)中列出。
表A
在“杵-臼”构型的一个具体实施方案中，Fc异二聚体构型的第一Fc多肽包含T366Y氨基酸置换，并且Fc异二聚体构型的第二Fc多肽包含Y407T氨基酸置换(EU编号)。在“杵-臼”构型的另一个具体实施方案中，Fc异二聚体构型的第一Fc多肽包含T366W氨基酸置换，并且Fc异二聚体构型的第二Fc多肽包含T366S、L368A和Y407V氨基酸置换(EU编号)。
A.示例性抗体和某些其他抗体实施方案
本公开提供了双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体，其包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域和结合至PDL1的第二抗原结合结构域。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含含有野生型IgGFc氨基酸序列的抗MerTK抗体重链和含有野生型IgG Fc氨基酸序列的抗PDL1抗体重链。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含含有野生型IgG1 Fc氨基酸序列的抗MerTK抗体重链和含有野生型IgG1 Fc氨基酸序列的抗PDL1抗体重链。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含抗MerTK抗体重链和抗PDL1抗体重链，所述抗MerTK抗体重链包含具有LALAPS氨基酸置换的IgG Fc区，所述抗PDL1抗体重链包含具有LALAPS氨基酸置换的IgG Fc区。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含抗MerTK抗体重链和抗PDL1抗体重链，所述抗MerTK抗体重链包含具有LALAPS氨基酸置换的IgG1 Fc区，所述抗PDL1抗体重链包含具有LALAPS氨基酸置换的IgG1 Fc区。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含抗MerTK抗体重链和抗PDL1抗体重链，所述抗MerTK抗体重链包含具有NSLF氨基酸置换的IgG Fc区，所述抗PDL1抗体重链包含具有NSLF氨基酸置换的IgG Fc区。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含抗MerTK抗体重链和抗PDL1抗体重链，所述抗MerTK抗体重链包含具有NSLF氨基酸置换的IgG1 Fc区，所述抗PDL1抗体重链包含具有NSLF氨基酸置换的IgG1 Fc区。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含含有野生型IgG4 Fc氨基酸序列的抗MerTK抗体重链和含有野生型IgG4 Fc氨基酸序列的抗PDL1抗体重链。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含抗MerTK抗体重链和抗PDL1抗体重链，所述抗MerTK抗体重链包含具有任何上述氨基酸置换并且还包含S228P氨基酸置换的IgG4 Fc氨基酸序列，所述抗PDL1抗体重链包含具有任何上述氨基酸置换并且还包含S228P氨基酸置换的IgG4 Fc氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的抗MerTK:抗PDL1抗体包含在Fc区中包含“杵”氨基酸置换的抗MerTK抗体重链和在Fc区中包含“臼”氨基酸置换的抗PDL1抗体重链。在一些实施方案中，本公开的抗MerTK:抗PDL1抗体包含在Fc区中包含“臼”氨基酸置换的抗MerTK抗体重链和在Fc区中包含“杵”氨基酸置换的抗PDL1抗体重链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸1-449的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸1-449的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸1-449的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸1-446的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸1-444的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸1-453的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸1-449的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸1-449的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸1-446的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸1-444的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:36的氨基酸1-446的重链和含有SEQ IDNO:21的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸1-444的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸1-448的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:23的氨基酸1-448的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸1-448的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸1-445的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸1-444的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:37的氨基酸1-448的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:38的氨基酸1-447的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:43的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸1-448的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:44的氨基酸1-447的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸1-445的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:45的氨基酸1-444的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体包含结合至人MerTK的第一抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸1-445的重链和含有SEQ IDNO:26的氨基酸序列的轻链，和结合至PDL1的第二抗原结合结构域，其包含含有SEQ ID NO:46的氨基酸1-444的重链和含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，根据上述实施方案中的任一者的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体可以单独地或组合地包括如下文第1-7节中所述的任何特征：
(1)抗MerTK抗体结合亲和力
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体具有的解离常数(K
在一些实施方案中，本公开的抗MerTK抗体结合至人MerTK，其中结合至人MerTK的K
(2)抗体片段
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该抗体片段可以是二价的或双特异性的。参见例如EP404097；WO 1993/01161；Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。三抗体和四抗体也在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中有所描述。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人类单结构域抗体(参见例如，美国专利号6248516)。
如本文所述，抗体片段可以通过各种技术来制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠埃希氏菌(E.coli)或噬菌体)产生。
(3)嵌合和人源化抗体
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4816567中有所描述。在一个实例中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人类灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人类恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或子类已从亲本抗体的类别或子类改变。嵌合抗体包括它们的抗原结合片段。
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体是人源化抗体。通常，非人类抗体被人源化以减少对人类的免疫原性，同时保留亲本非人类抗体的特异性和亲和力。在某些实施方案中，人源化抗体在人类中是基本上非免疫原性的。在某些实施方案中，人源化抗体对靶标的亲和力与来自衍生出人源化抗体的另一个物种的抗体基本上相同。参见例如，美国专利号5530101、5693761；5693762；和5585089。在某些实施方案中，鉴定了可以在不减少抗原结合结构域的天然亲和力而减少免疫原性的情况下修饰的抗体可变结构域的氨基酸。参见例如，美国专利号5766886和5869619。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(或它们的部分)来源于非人类抗体，并且FR(或它们的部分)来源于人类抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人类抗体(例如，衍生出HVR残基的抗体)的对应残基置换，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如在Almagro等人Front.Biosci.13:161 9-1633(2008)中有所综述，并且例如在美国专利号5821337、7527791、6982321和7087409中进一步描述。可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区特定亚群的人类抗体共有序列的框架区(参见例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；以及Presta等人，J.Immunol.151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见例如Almagro和Fransson Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和来源于筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)以及Rosok等人J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
(4)人类抗体
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体是人类抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人类抗体。人类抗体一般性描述于van Dijk等人Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过将免疫原施用于转基因动物来制备人类抗体，所述转基因动物已被修饰为响应于抗原挑战而产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体。可以用大片段的人类Ig基因座来工程化改造小鼠抗体产生缺陷的小鼠品系，以期望这种小鼠可以在不存在小鼠抗体的情况下产生人类抗体。人类Ig大片段可以保留较大的可变基因多样性以及抗体产生和表达的适当调控。通过利用小鼠的抗体多样化和选择机制以及人类蛋白质的免疫耐受性缺乏，在这些小鼠品系中复制的人类抗体库可以产生针对任何所关注的抗原(包括人类抗原)的高亲和力完全人类抗体。使用杂交瘤技术，可以生产和选择具有所期望的特异性的抗原特异性人类mAb。某些示例性方法在美国专利号5545807、EP 546073和EP 546073中有所描述。另外参见，例如，描述XENOMOUSE
还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人类抗体。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见例如Kozbor J.Immunol.133:3001(1984)以及Boerner等人J.Immunol.147:86(1991))。经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体还在Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1 03:3557-3562(2006)中有所描述。另外的方法包括例如在美国专利号7189826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)还在Vollmers等人，Histology andHistopathology 20(3):927-937(2005)和Vollmers等人，Methods and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91(2005)中有所描述。还可以通过分离从人类衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变结构域序列来产生人类抗体。然后，可以将此类可变结构域序列与所期望的人类恒定结构域组合。用于从抗体文库选择人类抗体的技术如下文所述。
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，所述抗体是通过体外方法和/或筛选组合文库(以获得具有一个或多个所期望的活性的抗体)来分离的人类抗体。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(以前称为Proliferon)、Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母展示(Adimab)等等。在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并且在噬菌体文库中进行随机重组，然后可以筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol12:433-455(1994)所述。例如，用于产生噬菌体展示文库以及从此类文库筛选具有所期望的结合特征的抗体的许多方法是本领域已知的。还参见Sidhu等人J.Mol.Biol.338(2):299-310,2004；Lee等人J.Mol.Biol.340(5):1073-1093,2004；FellouseProc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人J.Immunol.Methods284(-2):1 19-132(2004)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段来展示抗体片段。免疫来源的文库为免疫原提供了高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆(例如，从人类)初始库以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的单一来源的抗体，而无需进行任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J.12:725-734(1993)所述。最后，初始文库也可以通过以下方式合成制备：使用包含随机序列的PCR引物从干细胞克隆未重排的V基因区段，以编码高度可变的HVR3区并且在体外实现重排，如Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227:381-388,1992所述。描述人类抗体噬菌体文库的专利公开包括例如：美国专利号5750373和美国专利公开号2007/0292936和2009/0002360。从人类抗体文库分离的抗体被视为本文的人类抗体或人类抗体片段。
(5)包含Fc区的恒定区
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体包含Fc。在一些实施方案中，Fc是人类IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗体属于IgG类、IgM类或IgA类。
在本文提供的抗体中的任一者的某些实施方案中，抗体具有IgG2同种型。在一些实施方案中，抗体含有人类IgG2恒定区。在一些实施方案中，人类IgG2恒定区包含Fc区。在一些实施方案中，抗体诱导一种或多种MerTK活性或与Fc受体的结合无关。在一些实施方案中，抗体结合抑制性Fc受体。在某些实施方案中，抑制性Fc受体是抑制性Fc-γ受体IIB(FcγIIB)。
在本文提供的抗体中的任一者的某些实施方案中，抗体具有IgG1同种型。在一些实施方案中，抗体含有小鼠IgG1恒定区。在一些实施方案中，抗体含有人IgG1恒定区。在一些实施方案中，人IgG1恒定区包括Fc区。在一些实施方案中，抗体结合抑制性Fc受体。在某些实施方案中，抑制性Fc受体是抑制性Fc-γ受体IIB(FcγIIB)。
在本文提供的抗体中的任一者的某些实施方案中，抗体具有IgG4同种型。在一些实施方案中，抗体含有人类IgG4恒定区。在一些实施方案中，人IgG4恒定区包括Fc区。在一些实施方案中，抗体结合抑制性Fc受体。在某些实施方案中，抑制性Fc受体是抑制性Fc-γ受体IIB(FcγIIB)。
在本文提供的抗体中的任一者的某些实施方案中，抗体具有杂合IgG2/4同种型。在一些实施方案中，抗体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含根据人类IgG2的EU编号的氨基酸118至260和根据人类IgG4的EU编号的氨基酸261至447(WO 1997/11971；WO 2007/106585)。
在一些实施方案中，与包含Fc区(不包含氨基酸置换)的对应的抗体相比，Fc区增加聚类但不活化补体。在一些实施方案中，抗体诱导抗体特异性结合的靶标的一种或多种活性。在一些实施方案中，抗体结合至MerTK。
修饰本公开的抗MerTK抗体以修饰效应子功能和/或增加抗体的血清半衰期也是所期望的。例如，恒定区上的Fc受体结合位点可以被修饰或突变，以除去或减少对某些Fc受体(诸如FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII)的结合亲和力，从而减少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。在一些实施方案中，通过除去抗体的Fc区(例如，在IgG的CH2结构域中)的N-糖基化来削弱效应子功能。在一些实施方案中，通过修饰诸如人类IgG的233-236、297和/或327-331的区域来削弱效应子功能，如WO 99/58572和Armour等人，Molecular Immunology 40:585-593(2003)；Reddy等人，J.Immunology 164:1925-1933(2000)所述。在其他实施方案中，修饰本公开的抗MerTK抗体，以修饰效应子功能，从而在不活化体液应答的情况下，增加对含ITIM的FcgRIIb(CD32b)的发现选择性，增加邻近细胞上的MerTK抗体的聚类，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬作用也是所期望的。
例如，为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位纳入抗体(尤其是抗体片段)中，如美国专利5739277所述。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgG
(6)抗体变体
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，设想了抗体的氨基酸序列变体。例如，改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质可以是所期望的。
(i)置换、插入和缺失变体
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。
表A：氨基酸置换
抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在维持以下性质的作用显著不同的置换来实现：(a)置换区域中的多肽主链的结构(例如，折叠或螺旋构象)，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。根据常见侧链性质将天然存在的残基分为几组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
例如，非保守置换可以涉及将这些类别之一的成员替换为另一个类别的成员。例如可以将此类置换的残基引入与非人类抗体同源的人类抗体的区域中，或引入分子的非同源区中。
根据某些实施方案，在改变本文所述的多肽或抗体时，可以考虑氨基酸的亲水指数。已基于氨基酸的疏水性和电荷特征为每个氨基酸指定亲水指数。它们分别为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能方面的重要性是本领域中所理解的。Kyte等人J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可以置换具有相似的亲水指数或得分的其他氨基酸，并且仍然保留相似的生物学活性。在根据亲水指数进行改变时，在某些实施方案中，亲水指数在±2以内的氨基酸的置换被包括在内。在某些实施方案中，在±1以内的那些氨基酸被包括在内，并且在某些实施方案中，在±0.5以内的那些氨基酸被包括在内。
在本领域中还应理解，可以根据亲水性有效地进行相似的氨基酸的置换，尤其是在打算将由此产生的生物学功能性蛋白质或肽用于免疫学实施方案的情况下，正如目前的情况那样。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性，由蛋白质的邻近氨基酸的亲水性所支配，与蛋白质的免疫原性和抗原性，即与蛋白质的生物学性质相关联。
已向这些氨基酸残基分配如下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0±1)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在根据相似的亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，亲水性值在±2以内的氨基酸的置换被包括在内，在某些实施方案中，在±1以内的那些氨基酸的置换被包括在内，并且在某些实施方案中，在±0.5以内的那些氨基酸的置换被包括在内。还可以根据亲水性从一级氨基酸序列鉴定出表位。这些区域也被称为“表位核心区”。
在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的。
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至包含一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基和/或羧基末端融合体，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与酶(例如，对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合体。
还可以通常用丝氨酸置换在HVR外部且不涉及维持抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反，可以将一个或多个半胱氨酸键添加至抗体，以改善抗体的稳定性(尤其是在抗体是抗体片段(诸如Fv片段)的情况下)。
(ii)糖基化变体
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，改变抗体以增加或减少抗体的糖基化程度。可以通过改变氨基酸序列以产生或除去一个或多个糖基化位点来方便地实现抗体的糖基化位点的添加或缺失。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一者存在于多肽中产生了潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖(即，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者)与羟氨基酸(最常见地丝氨酸或苏氨酸，但是还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)的附接。
糖基化位点至抗体的添加通过改变氨基酸序列来方便地实现，以使得所述抗体含有上述三肽序列中的一者或多者(对于N-连接糖基化位点)。还可以通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基至原始抗体的序列的添加或者被一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的置换来进行改变(对于O-连接糖基化位点)。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与其连接的碳水化合物。哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角寡糖，所述寡糖通常通过N-连接来连接至Fc区的CH2结构域的Asn297(根据Kabat编号)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本公开的抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。参见例如，美国专利公开号2003/0157108和2004/0093621。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物的实例包括：US2003/0157108；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Led 3 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108)，以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如,Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)和Kanda等人，Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006))。
(iii)经修饰的恒定区
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体Fc是抗体Fc同种型和/或修饰。在一些实施方案中，抗体Fc同种型和/或修饰能够结合至Fcγ受体。
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，经修饰的抗体Fc是IgG1修饰的Fc。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含一个或多个修饰。例如，在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含一个或多个氨基酸置换(例如，相对于相同同种型的野生型Fc区)。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸置换选自N297A(Bolt S等人，(1993)Eur J Immunol 23:403-411)、D265A(Shields等人，(2001)R.J.Biol.Chem.276,6591–6604)、L234A、L235A(Hutchins等人，(1995)Proc Natl Acad Sci USA,92:11980-11984；Alegre等人，(1994)Transplantation 57:1537-1543.31；Xu等人，(2000)Cell Immunol,200:16-26)、G237A(Alegre等人，(1994)Transplantation 57:1537-1543.31；Xu等人，(2000)Cell Immunol,200:16-26)、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E(McEarchem等人，(2007)Blood,109:1185-1192)、P331S(Sazinsky等人，(2008)Proc Natl Acad Sci USA 2008,105:20167-20172)、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T和/或T256E，其中氨基酸位置根据EU编号惯例进行。
在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的N297A突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的D265A和N297A突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的D270A突变。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的L234A和L235A突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的L234A和G237A突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的L234A、L235A和G237A突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的P238D、L328E、E233、G237D、H268D、P271G和A330R突变中的一者或多者(包括全部突变)。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的S267E/L328F突变中的一者或多者。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的P238D、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G和A330R突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的P238D、L328E、G237D、H268D、P271G和A330R突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的P238D、S267E、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G和A330R突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的P238D、S267E、L328E、G237D、H268D、P271G和A330R突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的C226S、C229S、E233P、L234V和L235A突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的L234F、L235E和P331S突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的S267E和L328F突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的N325S和L328F突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的S267E突变。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含用CH1进行的恒定重链1(CH1)和铰链区的置换和用κ轻链进行的IgG2的铰链区(根据EU编号的IgG2的氨基酸118-230)的置换。
在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，与具有Fc区(不包含两个或更多个氨基酸置换)的对应的抗体相比，Fc包含两个或更多个氨基酸置换，所述氨基酸置换增加抗体聚类但不活化补体。因此，在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG1修饰的Fc是包含Fc区的抗体，其中所述抗体包含在位置E430G处的氨基酸置换和在Fc区中的一个或多个氨基酸置换，所述氨基酸置换的残基位置选自：根据EU编号的L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S以及它们的任何组合。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的位置E430G、L243A、L235A和P331S处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的位置E430G和P331S处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的位置E430G和K322A处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的位置E430G、A330S和P331S处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的位置E430G、K322A、A330S和P331S处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的位置E430G、K322A和A330S处的氨基酸置换。在一些实施方案中，IgG1修饰的Fc包含根据EU编号的位置E430G、K322A和P331S处的氨基酸置换。
在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG1修饰的Fc可以另外包含在本文中可以与根据EU编号惯例的A330L突变(Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA,103:4005-4010(2006))，或L234F、L235E和/或P331S突变中的一者或多者(Sazinsky等人，ProcNatl Acad Sci USA,105:20167-20172(2008))组合，以消除补体活化。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG1修饰的Fc可以另外包含根据EU编号的A330L、A330S、L234F、L235E和/或P331S中的一者或多者。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG1修饰的Fc可以另外包含一个或多个突变，以增强在人类血清中的抗体半衰期(例如，根据EU编号惯例的M252Y、S254T和T256E突变中的一者或多者(包括全部突变))。在IgG1修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG1修饰的Fc可以另外包含根据EU编号的E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y和/或S440W中的一者或多者。
本公开的其他方面涉及具有经修饰的恒定区(即，Fc区)的抗体。如果抗体被工程化改造为消除FcgR结合，则根据与FcgR受体的结合以活化被靶向受体的抗体可以丧失激动剂活性(参见例如，Wilson等人,Cancer Cell 19:101-113(2011)；Armour等人，Immunology40:585-593(2003)；和White等人，Cancer Cell 27:138-148(2015))。因此，据认为，当抗体具有来自人类IgG2同种型的Fc结构域(CH1和铰链区)或者能够优先地结合抑制性FcgRIIB r受体或它们的变异体的另一种类型的Fc结构域时，具有正确表位特异性的本公开的抗MerTK抗体可以活化靶抗原，而不良反应最小。
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，经修饰的抗体Fc是IgG2修饰的Fc。在一些实施方案中，IgG2修饰的Fc包含一个或多个修饰。例如，在一些实施方案中，IgG2修饰的Fc包含一个或多个氨基酸置换(例如，相对于相同同种型的野生型Fc区)。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，一个或多个氨基酸置换选自根据EU编号惯例的V234A(Alegre等人，Transplantation57:1537-1543(1994)；Xu等人，Cell Immunol,200:16-26(2000))；G237A(Cole等人，Transplantation,68:563-571(1999))；H268Q、V309L、A330S、P331S(US2007/0148167；Armour等人，Eur J Immunol 29:2613-2624(1999)；Armour等人，The Haematology Journal 1(增刊1):27(2000)；Armour等人，The HaematologyJournal 1(增刊1):27(2000))、C219S和/或C220S(White等人，Cancer Cell 27,138-148(2015))；S267E、L328F(Chu等人，Mol Immunol,45:3926-3933(2008))；以及M252Y、S254T和/或T256E。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置V234A和G237A处的氨基酸置换。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置C219S或C220S处的氨基酸置换。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置A330S和P331S处的氨基酸置换。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置S267E和L328F处的氨基酸置换。
在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号惯例的C127S氨基酸置换(White等人，(2015)Cancer Cell 27,138-148；Lightle等人,Protein Sci.19:753-762(2010)；和WO 2008/079246)。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，抗体具有IgG2同种型，所述IgG2同种型具有κ轻链恒定结构域，所述κ轻链恒定结构域包含根据EU编号惯例的C214S氨基酸置换(White等人,Cancer Cell 27:138-148(2015)；Lightle等人Protein Sci.19:753-762(2010)；和WO 2008/079246)。
在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号惯例的C220S氨基酸置换。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，抗体具有IgG2同种型，所述IgG2同种型具有κ轻链恒定结构域，所述κ轻链恒定结构域包含根据EU编号惯例的C214S氨基酸置换。
在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号惯例的C219S氨基酸置换。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，抗体具有IgG2同种型，所述IgG2同种型具有κ轻链恒定结构域，所述κ轻链恒定结构域包含根据EU编号惯例的C214S氨基酸置换。
在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含IgG2同种型重链恒定结构域1(CH1)和铰链区(White等人,Cancer Cell27:138-148(2015))。在IgG2修饰的Fc中的任一者的某些实施方案中，IgG2同种型CH1和铰链区包含根据EU编号的118-230的氨基酸序列。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，抗体Fc区包含根据EU编号惯例的S267E氨基酸置换、L328F氨基酸置换或它们二者，和/或N297A或N297Q氨基酸置换。
在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc还包含根据EU编号的位置E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y和S440W处的一个或多个氨基酸置换。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc可以另外包含一个或多个突变，以增强在人类血清中的抗体半衰期(例如，根据EU编号惯例的M252Y、S254T和T256E突变中的一者或多者(包括全部突变))。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc可以另外包含A330S和P331S。
在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc是IgG2/4杂合Fc。在一些实施方案中，IgG2/4杂合Fc包含IgG2 aa 118至260和IgG4 aa 261至447。在IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置H268Q、V309L、A330S和P331S处的一个或多个氨基酸置换。
在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含一个或多个选自根据EU编号的A330L、L234F、L235E或P331S；以及它们的任何组合的另外的氨基酸置换。
在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的某些实施方案中，Fc包含选自根据EU编号的C127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S、E345R、E430G、S440Y以及它们的任何组合的残基位置处的一个或多个氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G、L243A、L235A和P331S处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G和P331S处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G和K322A处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G、A330S和P331S处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G、K322A、A330S和P331S处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G、K322A和A330S处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G、K322A和P331S处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置S267E和L328F处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置C127S处的氨基酸置换。在IgG1和/或IgG2修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E345R、E430G和S440Y处的氨基酸置换。
在本文提供的抗体中的任一者的一些实施方案中，经修饰的抗体Fc是IgG4修饰的Fc。在一些实施方案中，IgG4修饰的Fc包含一个或多个修饰。例如，在一些实施方案中，IgG4修饰的Fc包含一个或多个氨基酸置换(例如，相对于相同同种型的野生型Fc区)。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，一个或多个氨基酸置换选自根据EU编号惯例的L235A、G237A、S229P、L236E(Reddy等人,J Immunol 164:1925-1933(2000))、S267E、E318A、L328F、M252Y、S254T和/或T256E。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc可以另外包含根据EU编号惯例的L235A、G237A和E318A。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc可以另外包含根据EU编号惯例的S228P和L235E。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG4修饰的Fc可以另外包含根据EU编号惯例的S267E和L328F。
在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG4修饰的Fc包含可以与根据EU编号惯例的S228P突变(Angal等人，Mol Immunol.30:105-108(1993))和/或与(Peters等人，J Biol Chem.287(29):24525-33(2012))所述的一个或多个突变组合，以增强抗体稳定性。
在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，IgG4修饰的Fc可以另外包含一个或多个突变，以增强在人类血清中的抗体半衰期(例如，根据EU编号惯例的M252Y、S254T和T256E突变中的一者或多者(包括全部突变))。
在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的L235E。在IgG4修饰的Fc中的任一者的某些实施方案中，Fc包含选自根据EU编号的C127S、F234A、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、E345R、E430G、S440Y以及它们的任何组合的残基位置处的一个或多个氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G、L243A、L235A和P331S处的氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G和P331S处的氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430G和K322A处的氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E430处的氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc区包含根据EU编号的位置E430G和K322A处的氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置S267E和L328F处的氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置C127S处的氨基酸置换。在IgG4修饰的Fc中的任一者的一些实施方案中，Fc包含根据EU编号的位置E345R、E430G和S440Y处的氨基酸置换。
其他抗体修饰
在抗体中的任一者的一些实施方案中，抗体是衍生物。术语“衍生物”是指包含除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或置换之外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包含共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或者其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施方案中，经化学修饰的抗原结合蛋白可以具有比未经化学修饰的抗原结合蛋白更长的循环半衰期。在某些实施方案中，经化学修饰的抗原结合蛋白可以具有针对所期望的细胞、组织和/或器官的改善的靶向能力。在一些实施方案中，衍生物抗原结合蛋白被共价修饰为包含一个或多个水溶性聚合物附接物，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。参见例如，美国专利号4640835、4496689、4301144、4670417、4791192和4179337。在某些实施方案中，衍生物抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧己环、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及此类聚合物的混合物。
在某些实施方案中，衍生物被聚乙二醇(PEG)亚基共价修饰。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物在衍生物的一个或多个特定位置处(例如在氨基末端)键合。在某些实施方案中，一种或多种水溶性聚合物无规附接至衍生物的一个或多个侧链。在某些实施方案中，PEG被用于改善抗原结合蛋白的治疗能力。在某些实施方案中，PEG被用于改善人源化抗体的治疗能力。某些此类方法例如在美国专利号6133426中有所讨论，该专利据此以引用的方式并入用于任何目的。
肽类似物通常在制药行业中用作非肽药物，其性质类似于模板肽的那些药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物(peptide mimetic)”或“拟肽(peptidomimetic)”。Fauchere,J.Adv.Drug Res.,15:29(1986)；以及Evans等人J.Med.Chem.,30:1229(1987)，这些文献出于任何目的以引用的方式并入本文。此类化合物通常借助于计算机化分子建模来开发。结构上类似于治疗使用的肽的肽模拟物可以用于产生类似的治疗效果。通常，拟肽在结构上类似于范例多肽(即具有生物化学性质或药理活性的多肽)诸如人类抗体，但具有一个或多个肽键，其通过本领域熟知的方法任选地被选自以下的键置换：-CH
药物缀合涉及将生物学活性细胞毒性(抗癌)有效负载或药物偶联至特异性靶向某种肿瘤标志物(例如，理想地仅存在于肿瘤细胞内或肿瘤细胞上的多肽)的抗体。抗体在体内追踪这些蛋白质并且使它们自身附接至癌细胞的表面。抗体和靶蛋白(抗原)之间的生物化学反应会触发肿瘤细胞中的信号，然后所述信号与细胞毒素一起吸收或内化抗体。在ADC内化后，细胞毒性药物被释放并且杀死癌症。由于这种靶向，理想地，药物与其他化学治疗剂相比，具有更低的副作用并且提供更广泛的治疗窗口。缀合抗体的技术已有所公开，是本领域已知的(参见例如，Jane de Lartigue OncLive 2012年7月5日；ADC Review onantibody-drug conjugates；和Ducry等人Bioconjugate Chemistry 21(1):5-13(2010)。
VI.核酸、载体和宿主细胞
本公开的抗MerTK抗体可以使用重组方法和组合物来产生，例如如美国专利号4816567所述。在一些实施方案中，提供了具有编码本公开的抗MerTK抗体中的任一者的核苷酸序列的分离的核酸。此类核酸可以编码抗MerTK抗体的包含V
在一些实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经被以下转导)：(1)编码包含抗体轻链的氨基酸序列的核酸，其中轻链包含V
在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。本公开的宿主细胞还包括但不限于分离的细胞、体外培养的细胞和离体培养的细胞。
提供了制备本公开的抗MerTK抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在适用于抗体表达的条件下培养包含编码抗MerTK抗体的核酸的本公开的宿主细胞。在一些实施方案中，随后从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于本公开的抗MerTK抗体的重组产生，将编码抗MerTK抗体的核酸分离并且插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。这种核酸可以使用常规程序容易地分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合至编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。
包含编码本公开的抗MerTK抗体中的任一者的核酸序列，或本文所述的细胞表面表达的片段或它们的多肽(包括抗体)的合适载体包括但不限于克隆载体和表达载体。合适的克隆载体可以根据标准技术构建，或者可以从本领域可获得的大量克隆载体中选择。虽然所选的克隆载体可以根据希望使用的宿主细胞而变化，但是有用的克隆载体通常具有自我复制能力，可以具有特定限制性核酸内切酶的单个靶标，和/或可以携带标志物的基因，所述标记物可以用于选择包含载体的克隆。合适的实例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体(诸如pSA3和pAT28)。这些和很多其他克隆载体可以从商业供应商(诸如BioRad、Strategene和Invitrogen)获得。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适的宿主细胞包括细胞原核或真核细胞。例如，本公开的抗MerTK抗体可以在细菌中产生，尤其是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于抗体片段和多肽在细菌中的表达(例如，美国专利号5648237、5789199和5840523)。在表达后，抗体可以从细菌细胞浆以可溶性级分分离，并且可以进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，这些菌株的糖基化通路已被“人源化”，从而产生具有部分或全部人类糖基化模式的抗体(例如，Gemgross Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006))。
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也可以来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞联合使用，尤其是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。植物细胞培养物也可以用作宿主(例如，美国专利号5959177、6040498、6420548、7125978和6417429，它们描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适用于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人类胚肾细胞系(293或293细胞，如例如Graham等人J.Gen Virol.36:59(1977)所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人类宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗(Buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A)；人类肺细胞(W138)；人类肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等人AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)所述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
VII.药物组合物/制剂
本文提供了包含本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体和药学上可接受的载剂的药物组合物和/或药物制剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的载剂优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。用于体内施用的药物组合物和/或药物制剂可以是无菌的。这很容易通过过滤(通过例如无菌过滤膜)来实现。
本文提供的药物组合物和/或药物制剂可用作药剂，例如用于治疗癌症。
VIII.治疗用途
如本文所公开的，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体可用于治疗疾病和病症。在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体。
已在各种肿瘤中观察到MerTK的异位或表达；MerTK的过表达和活化与淋巴样白血病、淋巴瘤、腺瘤、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌和乳腺癌有关；并且MerTK过表达与转移相关。(Schlegel等人，2013,J Clin Invest,123:2257-2267；Tworkoski等人，2013,PigmentCell Melanoma,26:527-541；Yi等人，2017,Oncotarget,8:96656-96667；Linger等人，2013,Blood,122:1599-1609；Lee-Sherick等人，2013,Oncogene,32:5359-5368；Brandao等人，2013,Blood Cancer,3:e101；Xie等人，2015,Oncotarget,6:9206-9219；Shi等人，2018,J Hematology&Oncology,11:43)。因此，用本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体调节MerTK的活性是治疗癌症的有效手段。
在某些方面，本文提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体或包含本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体的药物组合物。在一些实施方案中，提供了用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体，其中双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低吞噬细胞的胞葬作用。
在一些实施方案中，癌症选自肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、白血病、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、甲状腺癌、子宫癌、肝癌、宫颈癌、睾丸癌、鳞状细胞癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、腺瘤和成神经细胞瘤。在一些实施方案中，癌症选自多形性胶质母细胞瘤、膀胱癌和食道癌。在一些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，癌症可以是原发性肿瘤。在一些实施方案中，癌症可以是来自任何上述类型癌症的第二位点的转移性肿瘤。在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体可用于治疗有需要的受试者的癌症，其中所述癌症表达MerTK。
在一些实施方案中，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体可以与一种或多种充当检查点抑制剂的治疗剂结合施用。在一些实施方案中，所述方法还包括向个体施用至少一种特异性结合至抑制性免疫检查点分子的抗体，和/或另一种标准或研究性抗癌疗法。在一些实施方案中，抑制性检查点分子选自PD1、PDL1和PD-L2。在一些实施方案中，至少一种特异性结合至抑制性检查点分子的抗体与本公开的抗MerTK抗体组合施用。
在一些实施方案中，至少一种特异性结合至抑制性检查点分子的抗体选自抗PDL1抗体、抗PD-L2抗体和抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，受试者或个体是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，例如猴子)、兔子和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，受试者或个体是人类。
IX.制品
本文提供了包含本文所述的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体的制品(例如，试剂盒)。制品可以包括一个或多个包含本文所述的抗体的容器。容器可以具有任何合适的包装，包括但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封Mylar或塑料袋)等等。容器可以是单位剂量，散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。
在一些实施方案中，试剂盒可以另外包括第二试剂。在一些实施方案中，第二试剂是药学上可接受的缓冲剂或稀释剂，包括。在一些实施方案中，第二试剂是药物活性剂。
在制品中的任一者的一些实施方案中，制品还包括根据本公开的方法的使用说明。说明通常包括关于预期治疗的剂量、给药时间表和给药途径的信息。在一些实施方案中，这些说明包含根据本公开的任何方法施用本公开的分离的抗体(例如本文所述的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体)以治疗患有疾病、病症或损伤(例如癌症)的个体的描述。在一些实施方案中，说明包括双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体和第二试剂(例如，第二药物活性剂)的使用说明。
参考以下实施例将更充分地理解本公开。然而，其不应被解释为限制本公开的范围。整个本公开的所有引用据此明确地以引用的方式并入。
实施例
实施例1：His-缀合的和鼠Fc-缀合的MerTK多肽的产生
用于产生和表征本公开的抗MerTK抗体的含有聚His或TEVS/凝血酶/鼠IgG2a-Fc标记的融合蛋白的人、食蟹猴和鼠MerTK多肽如下生成。将编码人MerTK(SEQ ID NO:2)、食蟹猴MerTK(SEQ ID NO:3)和鼠MerTK(SEQ ID NO:4)的胞外结构域(ECD)的核酸分别克隆到哺乳动物表达载体中，所述载体含有编码异源信号肽的核酸以及含有聚His Fc标签或TEVS/凝血酶/鼠IgG2a Fc标签。
人MerTK、人MerTK胞外结构域、犬MerTK胞外结构域和鼠MerTK胞外结构域的氨基酸序列如下所示。
人MerTK氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
mgpaplplllglflpalwrraiteareeakpyplfpgpfpgslqtdhtpllslphasgyqpalmfsptqpgrphtgnvaipqvtsveskplpplafkhtvghiilsehkgvkfncsisvpniyqdttiswwkdgkellgahhaitqfypddevtaiiasfsitsvqrsdngsyickmkinneeivsdpiyievqglphftkqpesmnvtrntafnltcqavgppepvnifwvqnssrvneqpekspsvltvpgltemavfsceahndkgltvskgvqinikaipspptevsirnstahsiliswvpgfdgyspfrncsiqvkeadplsngsvmifntsalphlyqikqlqalanysigvscmneigwsavspwilasttegapsvaplnvtvflnessdnvdirwmkpptkqqdgelvgyrishvwqsagiskelleevgqngsrarisvqvhnatctvriaavtrggvgpfsdpvkifipahgwvdyapsstpapgnadpvliifgcfcgfiliglilyislairkrvqetkfgnafteedselvvnyiakksfcrraieltlhslgvseelqnkledvvidrnllilgkilgegefgsvmegnlkqedgtslkvavktmkldnssqreieeflseaacmkdfshpnvirllgvciemssqgipkpmvilpfmkygdlhtyllysrletgpkhiplqtllkfmvdialgmeylsnrnflhrdlaarncmlrddmtvcvadfglskkiysgdyyrqgriakmpvkwiaiesladrvytsksdvwafgvtmweiatrgmtpypgvqnhemydyllhghrlkqpedcldelyeimyscwrtdpldrptfsvlrlqleklleslpdvrnqadviyvntqllesseglaqgstlapldlnidpdsiiasctpraaisvvtaevhdskphegryilnggseewedltsapsaavtaeknsvlpgerlvrngvswshssmlplgsslpdellfaddssegsevlm
人MerTK ECD氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
MGPAPLPLLLGLFLPALWRRAITEAREEAKPYPLFPGPFPGSLQTDHTPLLSLPHASGYQPALMFSPTQPGRPHTGNVAIPQVTSVESKPLPPLAFKHTVGHIILSEHKGVKFNCSISVPNIYQDTTISWWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTAIIASFSITSVQRSDNGSYICKMKINNEEIVSDPIYIEVQGLPHFTKQPESMNVTRNTAFNLTCQAVGPPEPVNIFWVQNSSRVNEQPEKSPSVLTVPGLTEMAVFSCEAHNDKGLTVSKGVQINIKAIPSPPTEVSIRNSTAHSILISWVPGFDGYSPFRNCSIQVKEADPLSNGSVMIFNTSALPHLYQIKQLQALANYSIGVSCMNEIG WSAVSPWILASTTEGAPSVAPLNVTVFLNESSDNVDIRWMKPPTKQQDGELVGYRISHVWQSAGISKELLEEVGQNGSRARISVQVHNATCTVRIAAVTRGGVGPFSDPVKIFIPAHGWVDYAPSSTPAPGNADPVLII
Cyno MerTK ECD氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
MGLAPLPLPLLLGLFLPALWSRAITEAREEAKPYPLFPGPLPGSLQTDHTSLLSLPHTSGYQPALMFSPTQPGRPYTGNVAIPRVTSAGSKLLPPLAFKHTVGHIILSEHKDVKFNCSISVPNIYQDTTISWWKDGKELLGAHHAITQFYPDDEVTAIIASFSITSVQRSDNGSYICKMKINNEEIVSDPIYIEVQGLPHFTKQPESMNVTRNTAFNLTCQAVGPPEPVNIFWVQNSSRVNEQPEKSPSVLTVPGLTEMAVFSCEAHNDKGLTVSKGVQINIKAIPSPPTEVSIHNSTAHSILISWVPGFDGYSPFRNCSVQVKEVDPLSNGSVMIFNTSASPHMYQIKQLQALANYSIGVSCMNEIGWSAVSPWILASTTEGAPSVAPLNVTVFLNESRDNVDIRWMKPLTKRQAGELVGYRISHVWQSAGISKELLEEVGQNNSRAQISVQVHNATCTVRIAAVTKGGVGPFSDPVKIFIPAHGWVDHAPSSTPAPGNADPVLII
鼠MerTK ECD氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
MVLAPLLLGLLLLPALWSGGTAEKWEETELDQLFSGPLPGRLPVNHRPFSAPHSSRDQLPPPQTGRSHPAHTAAPQVTSTASKLLPPVAFNHTIGHIVLSEHKNVKFNCSINIPNTYQETAGISWWKDGKELLGAHHSITQFYPDEEGVSIIALFSIASVQRSDNGSYFCKMKVNNREIVSDPIYVEVQGLPYFIKQPESVNVTRNTAFNLTCQAVGPPEPVNIFWVQNSSRVNEKPERSPSVLTVPGLTETAVFSCEAHNDKGLTVSKGVHINIKVIPSPPTEVHILNSTAHSILVSWVPGFDGYSPLQNCSIQVKEADRLSNGSVMVFNTSASPHLYEIQQLQALANYSIAVSCRNEIGWSAVSPWILASTTEGAPSVAPLNITVFLNESNNILDIRWTKPPIKRQDGE LVGYRISHVWESAGTYKELSEEVSQNGSWAQIPVQIHNATCTVRIAAITKGGIGPFSEPVNIIIPEHSKVDYAPSSTPAPGNTDSM
将人、食蟹猴和鼠MerTK核酸融合构建体瞬时转染到HEK293细胞中。遵循制造商的说明，使用Mabselect树脂(GE Healthcare，目录号17519902)从细胞上清液中纯化重组融合多肽。此外，也将可商购获得的DDDDK标记的人MerTK融合多肽(Sino Biological，Wayne，PA，目录号10298-HCCH)或人IgG1 Fc标记的鼠MerTK融合蛋白(R&D systems，Minneapolis，MA，目录号591-MR-100)用于如下所述的抗MerTK抗体表征。
实施例2：人和鼠MerTK过表达CHO细胞系的产生
如下制备人MerTK和鼠MerTK过表达CHO细胞系。将人MerTK开放阅读框(ORF)克隆慢病毒颗粒(目录号RC215289L4V)和小鼠MerTK ORF克隆慢病毒颗粒(目录号MR225392L4V)(Origene，Rockville，MD)(均为mGFP标记的)分别用于制备人MerTK过表达CHO-K1和鼠MerTK过表达CHO-K1稳定细胞系。
将CHO细胞在含有10％ FBS(Gibco)的F12-K培养基(ATCC，目录号ATCC 30-2004)中培养，直到>80％汇合。然后用胰蛋白酶缓冲液(0.25％ EDTA/胰蛋白酶，Gibco，目录号25200056)解离细胞，并在用人或鼠MerTK慢病毒构建体转导前24小时，以70-80％汇合度涂铺在6孔板中。第二天，将细胞与慢病毒颗粒在4℃下温育2小时，然后将板在37℃下在5％CO
为了对这些细胞系进行FACS分析，将如上所述产生的人MerTK过表达CHO细胞(CHO-huMerTK OE细胞)和小鼠MerTK过表达CHO细胞(CHO-muMerTK OE细胞)以每孔1-2x10
将所得人MerTK和鼠MerTK过表达(OE)CHO细胞系用于随后的研究，以如下所述表征抗MerTK抗体。
实施例3：抗MerTK杂交瘤抗体的产生
为了产生抗MerTK杂交瘤，进行以下实验。通过皮下或腹膜内注射纯化的人、食蟹猴和小鼠MerTK胞外结构域多肽(如以上实施例1中所述获得)(含有或不含有佐剂)免疫BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)或MerTK基因敲除(KO)小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)，每周两次。在4周内总共进行8次注射。最后一次注射后三天，从小鼠收获脾脏和淋巴结用于杂交瘤细胞系产生。
分离来自免疫小鼠的脾和淋巴结的淋巴细胞，然后通过电融合(Hybrimmune，BTX，Holliston，MA)与P3X63Ag8.653(CRL-1580，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)或SP2/mIL-6(CRL-2016，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)小鼠骨髓瘤细胞融合，并在37℃、5％ CO
实施例4：通过FACS筛选抗MerTK抗体杂交瘤上清液
筛选如上所述获得的杂交瘤培养物上清液在各种细胞类型上结合MerTK的能力，所述细胞类型包括稳定过表达人MerTK的CHO细胞(CHO-huMerTK OE细胞)或稳定过表达小鼠MerTK的CHO细胞(CHO-muMerTK OE细胞)(如上所述产生)，以及CHO亲代细胞；U937细胞(ATCC CRL-1593.2)、SK-MEL-5细胞(ATCC HTB-70)(其内源性表达人MerTK)、J774A.1细胞(ATCC TIB-67)(其内源性表达小鼠MerTK)以及A375细胞(ATCC CRL-1619)。在这些实验中将不表达MerTK或表达很少的THP-1细胞(ATCC TIB-202)用作不表达MerTK的阴性对照细胞。
为了筛选杂交瘤细胞培养物上清液，利用多重FACS实验设计来确定抗MerTK抗体与这些多细胞系的结合。简言之，用不同浓度和组合的CellTrace细胞增殖染料CFSE和紫罗兰(ThermoFisher，分别为目录号C34554和目录号34557)对细胞进行染色，以产生独特条形码的细胞群。将每种条形码细胞类型的70,000个细胞等分到96孔U形底板中，并与50μl杂交瘤细胞培养物上清液或5μg/ml可商购获得的纯化小鼠抗人MerTK单克隆抗体(BioLegend，目录号367602；用作阳性抗MerTK抗体)一起在冰上温育30分钟。在该初级抗MerTK杂交瘤上清液与各种MerTK表达细胞类型温育后，通过离心去除上清液，用175μl冰冷的FACS缓冲液(PBS+1％ FBS+2mM EDTA)洗涤细胞两次，然后将细胞与抗小鼠IgG Fc-别藻蓝蛋白(APC)(Jackson Labs，目录号115-136-071)(稀释1:1000)一起在冰上进一步温育20分钟。在该二抗温育后，将细胞用冰冷的FACS缓冲液再次洗涤两次，并且重悬于最终体积为30μl含有0.25μl/孔的碘化丙啶(BD Biosciences，目录号556463)的FACS缓冲液中。使用FACS Canto系统(BD Biosciences)分析细胞上的结合强度，绘制分选门以排除死的(即碘化丙啶阳性)细胞。对于每个测试的抗MerTK杂交瘤上清液，确定每个条形码细胞群上APC平均荧光强度(MFI)的比率。
从该特异性杂交瘤上清液筛选中，鉴定出抗MerTK杂交瘤克隆，其与在亲代或阴性对照细胞类型上观察到的结合相比，在与稳定过表达或内源性表达人或小鼠MerTK的细胞的结合(如通过MFI测定)方面表现出大于2倍的差异。使用该筛选鉴定的抗MerTK抗体如下所述进一步表征。
实施例5：通过重组MerTK蛋白结合测定筛选抗MerTK抗体杂交瘤上清液
针对与聚His标记的人、食蟹猴和小鼠MerTK(如上文在实施例1中所述制备)结合的能力筛选如上所述获得的杂交瘤培养物上清液，所述结合与和不相关的His标记的对照蛋白的结合相比。简言之，在4℃下，将96孔聚苯乙烯板用1μg/ml在包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6，Sigma，目录号C3041)中的人、食蟹猴或小鼠聚His-标记的MerTK多肽包被过夜。然后用ELISA稀释剂(PBS+0.5％ BSA+0.05％ Tween20)封闭包被的板一小时，并用300μl PBST(PBS+0.05％ Tween20，Thermo 28352)洗涤三次。将杂交瘤细胞培养物上清液或两种可商购获得的纯化小鼠抗人MerTK单克隆抗体(BioLegend目录号367602；R&D目录号MAB8912)添加到每个孔中(50μl/孔)。温育30分钟(室温，振荡)后，将板用300μl PBST洗涤三次。将抗小鼠IgG Fc-HRP(Jackson Immunoresearch，目录号115-035-071)二抗在ELISA稀释剂中以1:5000稀释，以50μl/孔添加到每个孔中，并在室温下在振荡下温育30分钟。在最后一组洗涤(3x300μl，PBST)后，将50μl/孔的TMB底物(BioFx，目录号TMBW-1000-01)添加到孔中。然后在5-10分钟后用50μl/孔的终止溶液(BioFx，目录号BSTP-1000-01)淬灭反应。使用GEN5 2.04软件，用BioTek Synergy酶标仪检测猝灭反应孔在650nm下的吸光度。从该杂交瘤上清液筛选中，鉴定出抗MerTK杂交瘤克隆，其在与重组MerTK的结合方面表现出相对于背景的超过10倍差异。使用该筛选鉴定的抗MerTK抗体如下所述进一步表征。
实施例6：抗MerTK抗体的分子克隆
如下亚克隆来自上述杂交瘤的抗MerTK抗体。收获5×10
实施例7：小鼠抗MERTK抗体的人源化和亲和力成熟
如下产生本公开的某些亲代小鼠抗MerTK抗体的人源化变体。
一种将非人类抗体人源化的方法是将CDR从非人(例如鼠)抗体移植到人类抗体受体框架上。这种CDR移植可能导致人源化抗体对其靶的亲和力减弱或完全丧失，这是由于其框架受到干扰。因此，人框架中的某些氨基酸残基可能需要被来自鼠抗体框架的相应位置的氨基酸残基置换(称为回复突变)，以便恢复人源化导致减弱或丧失的亲和力。因此，必须确定在所选人类抗体种系受体框架的背景下有待置换的氨基酸残基，以使人源化抗体基本上保留功能和互补位。此外，为了良好的可制造性和下游开发，需要保持或改善热稳定性和溶解性。
简言之，将有待人源化的小鼠抗MerTK单克隆抗体的VH和VL氨基酸序列与取自IMGT(http://www.imgt.org/)的人VL、VH、LJ和HJ功能种系氨基酸序列相比较。这些分析排除了假基因和开放阅读框。每一种小鼠单克隆抗体(查询)，选择一个或两个最相似的VH种系氨基酸序列和一个最相似的VL种系氨基酸序列，并将其与最相似的VJ和HJ基因组合，从而产生一个或两个人源化氨基酸序列。根据AbM定义来定义有待移植到人框架上的CDR。
使用BioMOE模块或MOE(分子操作环境，Chemical Computing Group，Montreal，Canada)的抗体建模模块，将查询和人源化氨基酸序列用于创建Fv同源性模型。在整个抗体同源性建模过程中，将AMBER10:EHT力场分析用于能量最小化。基于所获得的Fv同源性模型，计算、分析并通过MOE提供的评分标准分选分子描述符，诸如VL和VH之间的相互作用能、基于坐标的等电点(3D pI)、疏水斑块和带电表面积。将这些分子描述符用于为下游实验程序(包括蛋白质表达、纯化、结合亲和力研究和功能测定)区分人源化单克隆抗体的优先次序。
MOE的BioMOE模块提供了一种工具，即突变位点属性，以对潜在的回复突变残基进行可视化和分类。在此上下文中，回复突变被定义为氨基酸置换，其被回复到原始的查询氨基酸序列，从而置换人源化氨基酸序列。使用该工具，将原始查询(参考)分别与3D Fv同源模型的一级氨基酸序列和3D结构的所选人源化变体进行比较。
参考(即亲本)抗体和人源化变体之间的变化基于氨基酸类型差异、与CDR残基的相互作用潜力、VL/VH配对的影响潜力以及CDR内和附近疏水和带电表面积的潜在变化进行分类。
对CDR或VL/VH界面附近具有显着电荷差异或含有强H-键相互作用的突变进行单独评估，并将显着破坏的突变还原为原始的查询残基。
进行人源化抗MerTK抗体MTK-33和MTK-16的亲和力成熟。简言之，对重链或轻链中的某些氨基酸残基进行选择性诱变，并通过额外的几轮筛选选择改善结合的突变体。该过程同时提高了特异性、物种交叉反应性和可发展性概况。本文描述的亲和力成熟的抗MerTK抗体的表征包括在Carterra LSA上的SPR亲和力测量和对人巨噬细胞的胞葬作用阻断测定。经过多轮亲和力成熟后，获得了具有所需亲和力的抗MerTK抗体。
本公开的抗MerTK抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸序列在下表1中提供。在表1中，亲代小鼠抗MerTK抗体包括MTK-15、MTK-16和MTK-33；MTK-16和MTK-33的人源化和亲和力成熟变体分别是MTK-16.2和MTK-33.11。在表1中，每个抗体链中的高变区(HVR)加下划线。
表1
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实施例8：用于双特异性抗体构建体的本公开的抗MerTK抗体和包含各种Fc区的抗PDL1抗体
将重链抗体可变序列引入到各种IgG Fc区中：野生型人IgG1；包含LALAPS修饰的人IgG1(L234A、L235A、P331S；EU编号)；包含NSLF的人IgG 1(N325S、L328F；EU编号)；和野生型人IgG4。将轻链抗体可变序列引入到人IgG轻链恒定区中。所得抗MerTk抗体序列在下表2中提供：
表2
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上表2还包括抗PDL1抗体的氨基酸序列，所述抗体包含来自抗PDL1抗体阿替利珠单抗的重链可变区和轻链可变区，所述阿替利珠单抗分别包含人IgG1 Fc野生型、人IgG1Fc LALAPS、人IgG1 Fc NSLF、人IgG4和人IgG轻链。
实施例9：抗MerTK抗体的产生
将抗MerTK杂交瘤克隆在无血清杂交瘤培养基中培养，并且在Hamilton STAR平台(Hamilton Company，Reno，NV)上使用蛋白A吸头(Phynexus Inc，San Jose，CA)纯化上清液中的抗MerTK抗体。还通过将从杂交瘤获得的可变基因区直接克隆到重组表达质粒中来产生抗MerTK抗体，所述重组表达质粒用于产生含有人Fc结构域(含有上述LALAPS氨基酸置换的人IgG1)的嵌合抗体。使用Tuna293
实施例10：双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体序列
表3示出了本公开的各种抗MerTK:抗PDL1双特异性抗体的氨基酸序列，其包含重链抗MerTK抗体序列的Fc区中的“杵”氨基酸修饰并且包含重链抗PDL1氨基酸序列的Fc区中的“臼”氨基酸修饰，与Fc区异二聚化相关。在表3中，“杵”构型的IgG1和IgG4 Fc区修饰包含氨基酸置换T366W(EU编号)，而“臼”构型包含氨基酸置换T366S、L368A和Y407V。某些IgG4构型还包括Fc区铰链修饰，其包含防止Fab臂交换的氨基酸置换S228P(EU编号)(参见Silva等人，(2015),J Biol Chem,290:5462-5469)。具体而言，huIgG4的野生型铰链区包含氨基酸序列ESKYGPPCP
表3
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/>
/>
/>
表4
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实施例11：双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体与CHO-人MerTK OE细胞、CHO-人PDL1 OE细胞和M2c分化的人巨噬细胞的结合活性
为了确定本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体是否结合至不同的细胞类型，进行了以下实验。这些研究中使用的细胞包括过表达人MerTK的CHO细胞(CHO-人MerTK OE细胞)、过表达人PDL1的CHO细胞(CHO-人PDL1 OE细胞)和M2c分化的人巨噬细胞。
使人巨噬细胞在人M-CSF存在下从人单核细胞分化7天，从而产生M2c分化的人巨噬细胞。7天后，收获分化的人巨噬细胞(通过刮擦)，将其重悬于PBS中，并涂铺在96孔板中备用。将过表达人MerTK的CHO细胞(CHO-huMerTK OE)、过表达人PDL1的CHO细胞(CHO-huPDL1 OE)和M2c分化的人巨噬细胞在冰上用Dylight650缀合的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体或二价抗MerTK抗体染色30分钟。在这些研究中使用一系列抗体浓度来获得结合曲线。这些研究中测试的所有抗体都是具有包含LALAPS突变的Fc区的IgG1。将细胞固定，然后在BD FACS Canto II血细胞计数器上采集。使用FlowJo软件计算平均荧光强度(MFI)，并使用Prism软件计算Kd值。这些结果中的Kd值类似于EC50值，但由Prism软件根据由FACS分析生成的数据计算。较低的Kd值反映了抗体与细胞的较高结合。
图1A示出了双特异性抗MerTK MTK-16.2:抗PDL1抗体、双特异性抗MerTK MTK-33.11:抗PDL1抗体、二价抗MerTK抗体MTK-16.2(全IgG)、二价抗MerTK抗体MTK33.11(全IgG)、单价抗PDL1抗体和IgG1-Fc LALAPS对照抗体在CHO-huPDL1 OE细胞上的结合曲线。
图1B示出了双特异性抗MerTK MTK-16.2:抗PDL1抗体、双特异性抗MerTK MTK-33.11:抗PDL1抗体、二价抗MerTK抗体MTK-16.2、二价抗MerTK抗体MTK33.11和单价(单臂)抗PDL1抗体在CHO-huMerTK OE细胞上的结合曲线。
如图1A所示，双特异性抗MerTK MTK-16.2:抗PDL1抗体和双特异性抗MerTK MTK-33.11:抗PDL1抗体显示出类似的与过表达人PDL1的CHO细胞的结合。此外，这两种双特异性抗体显示出类似的与表达作为单价(单臂)抗PDL1抗体构型的人PDL1的CHO细胞的结合。这些数据表明，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体保持其结合细胞中表达的人PDL1的能力。
如图1B所示，双特异性抗MerTK-MTK-33.11:抗PDL1抗体与过表达人MerTK的CHO细胞结合的程度类似于用二价(全IgG)抗MerTK抗体MTK-33.11观察到的程度。此外，双特异性抗MerTK-MTK-16.2:抗PDL1抗体与过表达人MerTK的CHO细胞结合的程度类似于用二价(全IgG)抗MerTK抗体MTK-16.2观察到的程度。正如预期的那样，单价(单臂)抗PDL1抗体没有显示出与过表达人MerTK的CHO细胞的结合。
图1C示出了本公开的双特异性抗体在M2c分化的人巨噬细胞上的结合。
下表5总结了从FACS分析中获得的Kd值(nM)。如图1A和1B以及表5所示，单价抗MerTK抗体MTK-16.2和二价抗MerTK抗体MTK-16.2均显示出以约40-43nM范围内的相似亲和力与CHO-huMerTK OE细胞结合。单价抗MerTK抗体MTK-16.2和二价抗MerTK抗体MTK-16.2显示出类似的与M2c分化的人巨噬细胞的结合，亲和力分别为约78nM和52nM，如该测定所测量的。这些结果表明，抗MerTK抗体MTK-16.2以相似的亲和力结合MerTK，而不管该抗体具有一个或两个结合臂。
与单价抗MerTK抗体MTK-33.11相比，二价抗MerTK抗体MTK-33.11对CHO-huMerTKOE细胞和M2c分化的人巨噬细胞均表现出较高的结合亲和力，与其单价形式相比，对CHO-huMerTK OE细胞表现出约10倍的亲和力并对M2c分化的人巨噬细胞表现出约5倍的亲和力。正如预期，对照抗体单价抗PDL1没有显示出结合至CHO-huMerTK OE细胞，但确实结合至M2c分化的人巨噬细胞。
表5
/>
单价抗PDL1抗体和双特异性抗体以相似Kd值与CHO-huPDL1OE细胞结合。有趣的是，在M2c分化的人巨噬细胞上，双特异性抗MerTK抗体MTK-16.2:抗PDL1显示出比单价抗MerTK抗体MTK-16.2或二价抗MerTK抗体MTK-16.2更强的结合活性，这表明双特异性抗MerTK抗体MTK-16.2:抗PDL1可通过MerTK和PDL1协同结合至人巨噬细胞。结果进一步表明，双特异性抗MerTK抗体MTK-33.11:抗PDL1更依赖于结合的二价性，因为其对MerTK具有相对强的亲和力，而双特异性抗MerTK抗体MTK-16.2:抗PDL1的结合可能依赖于PDL1的结合，因为其对MerTK的亲和力较弱。
实施例12：用双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低胞葬作用
如下评估本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低吞噬细胞(例如人巨噬细胞)的胞葬作用的能力。使人巨噬细胞在人M-CSF存在下从人单核细胞分化7天，以获得如上所述的M2c分化的人巨噬细胞。7天后，收获M2c分化的人巨噬细胞(通过刮擦)，将其重悬于PBS中，并涂铺在96孔板中。对于胞葬作用IC50测定，使细胞饥饿1小时，然后在37°℃下向每个孔中添加抗MerTK抗体，持续30分钟。
将Jurkat细胞在37℃下用1μM星形孢菌素(SigmaAldrich)处理3小时(以诱导凋亡)，并在室温下用pHrodo(ThermoFisher)标记30分钟。用PBS洗涤后，将pHrodo标记的Jurkat细胞以1:4比率(1个巨噬细胞:4个Jurkat细胞)添加到每个含有人巨噬细胞的孔中，持续1小时。用PBS洗涤板，然后用APC缀合的抗人CD14在冰上在黑暗中染色30分钟。将细胞固定，然后在BD FACS Canto II血细胞计数器上采集。使用FlowJo软件分析数据。
在这些实验中，通过将pHrodo CD14双阳性细胞设置为分析门，然后将该精确门应用于所有样品，来鉴定胞葬作用阳性的巨噬细胞。使用仅用培养基培养的巨噬细胞建立基线胞葬作用水平，并将其设定为100％胞葬作用活性。相对胞葬作用水平被计算为在仅用培养基处理的细胞中观察到的胞葬作用与在用抗MerTK抗体处理的细胞中观察到的胞葬作用的百分比。这些研究的结果示出在图2和下表6中。
表6
如表6所示，本公开的单价抗MerTK抗体能够阻断M2c分化的人巨噬细胞的胞葬作用，对于单价抗MerTK抗体MTK-33.11和MTK-16.2，IC50分别为约4.4nM和37.9nM。这些数据还显示，单价抗MerTK抗体MTK-16.2和MTK-33.11与其二价抗体对应物相比，显示出相对更弱的降低胞葬作用的活性；二价抗MTK-33.11抗体显示出0.341nM的IC50值，而单价抗MerTK抗体MTK-33.11具有约4.4nM的IC50值；此外，二价抗MTK-16.2抗体具有0.436nM的IC50值，而单价抗MerTK抗体MTK-16.2具有37.86nM的IC50值。单价抗PDL1抗体未显示出对胞葬作用的抑制活性(参见图2)。
这些数据表明，本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体有效降低吞噬细胞的胞葬作用。
实施例13：双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体的pAKT活性
如下检查本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体在MerTK配体Gas6不存在或存在下增加或减少pAKT信号传导的能力。将M2c分化的人巨噬细胞(如上所述产生)用各种抗MerTK抗体(10μg/ml)在37℃下处理30分钟，随后添加200nM重组人Gas6或PBS。在另外30分钟温育后，裂解细胞，并使用均质时间分辨荧光(HTRF)测定法分析细胞中与总AKT相比的pAKT水平。将pAKT信号归一化为总AKT信号，以定量最终的pAKT活性测定。这些研究的结果示出在图3和表7中。图4示出了在huGas6不存在下pAKT活性的倍数变化。
表7
/>
如图3和表7所示，单价抗MerTK抗体MTK-16.2和MTK-33.11在MerTK配体Gas6不存在下显示出比它们的二价对应物更低的pAKT/tAKT倍数变化。该数据表明，与用本公开的二价抗MerTK抗体观察到的结果相比，在MerTK配体Gas6不存在下，本公开的单价抗MerTK抗体在增加人巨噬细胞中的pAKT水平(例如，不依赖配体的pAKT活性)方面不太有效。抗MerTK抗体MTK-15用作阳性对照抗体，可有效增加pAKT活性。由于可能需要具有与抗MerTK抗体施用相关的较低pAKT活性，这些数据表明，与在治疗环境中使用二价抗MerTK抗体和二价抗PDL1抗体的组合相比，使用双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体可提供更安全的毒性特征。
如上所述，Gas6是MerTK的配体，并在与MerTK相互作用时增加pAKT活化。本研究还比较了在MerTK配体Gas6存在下，本公开的单价和二价抗MerTK抗体对pAKT的作用。以下图8示出了本公开的单价和二价抗MerTK抗体的huGas6介导的pAKT降低活性的IC50值。如表8所示，单价抗MerTK抗体MTK-16.2和MTK-33.11在Gas6存在下在影响pAKT活性时显示出比其二价对应物更高的IC50值。单价抗MerTK抗体MTK-16.2和MTK-33.11降低了huGas6介导的(例如，配体依赖性)pAKT活性，其IC50值在约15.35nM至17.85nM的范围内，如在该测定中所测量的；而本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体降低了配体依赖性pAKT活性，其IC50值在约12.26nM至9.027nM的范围内。这些数据表明，与单价和双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体相比，本公开的二价抗MerTK抗体在降低Gas6介导的pAKT活性方面更有效。
表8
实施例14：双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体的结合动力学
使用Carterra LSA仪器评估本公开的双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体与人、食蟹猴和鼠MerTK的结合动力学。简言之，通过在10mM乙酸盐pH 4.25(Carterra)中稀释至10μg/ml来制备抗MerTK抗体。使用单通道流动池通过7分钟注射100mM MES pH 5.5、100mM磺基-NHS、400mM EDC(全部在MES pH 5.5中重构；在运行测定之前，将100μl每种组分混合在小瓶中)的1:1:1混合物来活化HC30传感器芯片(Carterra)。在切换到多通道阵列流动池后，将抗体注射到96点阵列中的活化芯片上15分钟。像以前一样，在芯片的第二模块上重复注射抗体。然后通过使用单通道流动池注射1M乙醇胺pH8.5(Carterra)持续7分钟来封闭芯片上剩余的未缀合活性基团。
在用含有0.5mg/ml BSA(Sigma)的运行缓冲液(HBS-TE，Carterra)引发后，测试固定的抗MerTK抗体结合至几种形式的重组MerTK胞外结构域(包括如上所述的人、食蟹猴和小鼠直向同源物)的能力。通过使用单通道流动池在整个抗体阵列上注射每种分析物来生成亲和力的估值。在运行缓冲液中制备MerTK分析物的六个3倍系列稀释液(人MerTK1.2mM-4.9nM；食蟹猴和小鼠MerTK 3-1.2nM)，并从最低浓度到最高浓度连续注射300秒。在再生前在每次注射2x 30秒的10mM甘氨酸pH2.5后，追踪解离300秒。在每个系列(每个系列一个种类)之间运行三个缓冲液空白。在注射所有浓度的所有三种MerTK后，进行一组重复注射，使得所有三种MerTK的每个浓度都以间隔很大的重复注射。使用NextGenKIT高通量动力学分析软件(Carterra)处理和分析数据。所有样品的重复进样几乎完美重叠，表明表面在运行期间没有降解。
然后由本公开的抗MerTK抗体的拟合的缔合和解离速率常数(k-on和k-off)计算平衡解离常数(K
表9
如表9所示，未观察到测试的单价或二价抗MerTK抗体的亲和力差异，表明单价和二价抗MerTK抗体保持单价结合特征。
实施例15：二价抗MerTK抗体治疗在MC38小鼠肿瘤模型中的效果
如下检查本公开的二价抗MerTK抗体在体内延迟MC38肿瘤生长的能力。将MC38细胞皮下植入在huMerTK敲入(KI)小鼠上。当肿瘤尺寸达到体积约80-100mm
图5显示，与在单独用二价抗PDL1抗体治疗的小鼠中观察到的结果相比，二价抗PDL1抗体与二价抗MerTK MTK-33.11抗体或二价抗MerTK抗体MTK-16.2的组合降低了小鼠中的肿瘤生长率(如通过肿瘤体积随时间的变化来测量)。图6示出了每组(对照抗体、二价抗PDL1抗体、二价抗PLD1抗体+二价抗MerTK抗体MTK-33.11和二价抗PLD1抗体+二价抗MerTK抗体MTK-16.2)中个体小鼠的肿瘤生长。这些结果表明，与单独使用二价抗PLD1抗体所观察到的结果相比，本公开的二价抗MerTK抗体与二价抗PDL1抗体的组合在抑制肿瘤生长方面更有效。
实施例16：某些双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体构型
下表10和表11提供了本公开的某些二价抗MerTK:抗PDL1抗体构型。
表10
表11
下表12和表13提供了某些双特异性抗MerTK:抗PDL1抗体构型，其包含抗MerTK重链臂的Fc区内的重链“杵”氨基酸置换，并且包含抗PDL1重链臂的Fc区内的重链“臼”氨基酸置换。
表12
表13
/>
序列表
<110>艾利妥(ALECTOR LLC)
<120>双特异性抗MerTK和抗PDL1抗体及其使用方法
<130>4503.020PC01
<150>US 63/211,437
<151>2021-06-16
<160>55
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>999
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>人MerTK
<400>1
Met Gly Pro Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Pro Ala
1 5 1015
Leu Trp Arg Arg Ala Ile Thr Glu Ala Arg Glu Glu Ala Lys Pro Tyr
202530
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Phe Pro Gly Ser Leu Gln Thr Asp His Thr
354045
Pro Leu Leu Ser Leu Pro His Ala Ser Gly Tyr Gln Pro Ala Leu Met
505560
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65707580
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Thr Ile Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys Glu Leu Leu Gly Ala His His
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Ala Ile Thr Gln Phe Tyr Pro Asp Asp Glu Val Thr Ala Ile Ile Ala
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Ser Phe Ser Ile Thr Ser Val Gln Arg Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ile
165 170 175
Cys Lys Met Lys Ile Asn Asn Glu Glu Ile Val Ser Asp Pro Ile Tyr
180 185 190
Ile Glu Val Gln Gly Leu Pro His Phe Thr Lys Gln Pro Glu Ser Met
195 200 205
Asn Val Thr Arg Asn Thr Ala Phe Asn Leu Thr Cys Gln Ala Val Gly
210 215 220
Pro Pro Glu Pro Val Asn Ile Phe Trp Val Gln Asn Ser Ser Arg Val
225 230 235 240
Asn Glu Gln Pro Glu Lys Ser Pro Ser Val Leu Thr Val Pro Gly Leu
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Thr Glu Met Ala Val Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Asp Lys Gly Leu
260 265 270
Thr Val Ser Lys Gly Val Gln Ile Asn Ile Lys Ala Ile Pro Ser Pro
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Ile Ser Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Gly Gln Asn Asn Ser Arg Ala
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485 490 495
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<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400>4
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202530
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65707580
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100 105 110
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Gly Lys Glu Leu Leu Gly Ala His His Ser Ile Thr Gln Phe Tyr Pro
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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275 280 285
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Arg Leu Ser Asn Gly Ser Val Met Val Phe Asn Thr Ser Ala Ser Pro
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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Ile Ser His Val Trp Glu Ser Ala Gly Thr Tyr Lys Glu Leu Ser Glu
420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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Met
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202530
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1 5 1015
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202530
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202530
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202530
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202530
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202530
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202530
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65707580
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202530
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202530
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354045
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
505560
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<220>
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1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Ser Val Arg Asn Thr
202530
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<213>人工序列(Artificial Sequence)
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<400>15
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202530
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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202530
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
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195 200 205
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<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400>17
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400>18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Lys Gly Val Thr Ala Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210>19
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-16.2 NSLF重链
<400>19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
354045
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
505560
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Lys Gly Val Thr Ala Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
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260 265 270
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
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<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-16.2 IgG4重链
<400>20
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1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
354045
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
505560
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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<400>21
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202530
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
354045
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505560
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65707580
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859095
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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202530
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202530
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202530
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
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275 280 285
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
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340 345 350
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
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<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-33.11 IgG4重链
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
202530
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210>26
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-33.11 轻链
<400>26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Ser Val Arg Asn Thr
202530
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
354045
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe
859095
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>27
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>抗PDL1野生型IgG1重链
<400>27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
202530
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
354045
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
505560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210>28
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>抗PDL1 LALAPS重链
<400>28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
202530
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
354045
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
505560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400>29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
202530
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
354045
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
505560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>抗PDL1 IgG4重链
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
202530
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
354045
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
505560
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65707580
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859095
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
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225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
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275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
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420 425 430
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202530
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354045
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505560
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65707580
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859095
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100 105 110
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115 120 125
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210
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<220>
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202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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505560
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65707580
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Lys Gly Val Thr Ala Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
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202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
354045
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505560
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65707580
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859095
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
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<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-16.2 NSLF杆重链
<400>34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
354045
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
505560
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Lys Gly Val Thr Ala Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210>35
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<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-16.2 IgG4杆
<400>35
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
354045
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
505560
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Lys Gly Val Thr Ala Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
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Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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275 280 285
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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<211>447
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-16.2 IgG4杆 S228P重链
<400>36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His
202530
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
354045
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
505560
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Lys Gly Val Thr Ala Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210>37
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>MTK-33.11 IgG1杆重链
<400>37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 1015
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
202530
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
354045
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Asn Tyr Ile Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
505560
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65707580
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Glu Ala Gly Thr Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
202530
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
354045
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
505560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
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355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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420 425 430
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<211>227
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<220>
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1 5 1015
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
202530
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
354045
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
505560
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65707580
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
859095
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
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<211>227
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202530
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354045
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505560
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65707580
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
859095
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
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<211>227
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1 5 1015
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
202530
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65707580
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Ala Phe Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
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145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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1 5 1015
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202530
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505560
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65707580
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180 185 190
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195 200 205
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210>52
<211>118
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变- PDL1
<400>52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 1015
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
202530
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
354045
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
505560
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65707580
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
859095
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>53
<211>107
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>轻链可变- PDL1
<400>53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 1015
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
202530
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
354045
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
505560
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65707580
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
859095
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>54
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> huIgG4的野生型铰链区
<400>54
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210>55
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>IgG4铰链区的S228P氨基酸置换
<400>55
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
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