一种布比卡因碱中起微量基因毒性杂质的高效液相色谱检测方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种布比卡因碱中起微量基因毒性杂质的高效液相色谱检测方法。

背景技术

布比卡因主要用于局部浸润麻醉、外周神经阻滞和椎管内阻滞，它是酰胺类长效局部麻醉药，麻醉时间比利多卡因长2-3倍，弥散度与利多卡因相仿，对循环和呼吸影响比较小，对组织没有刺激性，不产生高铁血红蛋白。

常用量对心血管功能没有影响，用量大时可以导致血压下降、心率减慢，对β受体具有明显的阻断作用，无明显的快速耐受性，母体的药物血药浓度是胎儿血药浓度的4倍。

白色结晶性粉末，无臭、味苦。在乙醇中易溶，在水中溶解，在氯仿中微溶，在乙醚中几乎不溶。其水溶液pH为4.5～6.0。CAS号为：2180-92-9。结构式为：

布比卡因碱的合成是以2-哌啶甲酸为起始原料，与正丁醛反应后催化氢化得到1-丁基哌啶-2-羧酸，之后与2,6-二甲基苯胺缩合反应生成布比卡因，其中2,6-二甲基苯胺，在2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，2,6-二甲基苯胺在2B类致癌物清单中。因此，2，6-二甲基苯胺的存在可能会影响药物的安全性。

2,6-二甲基苯胺的分析方法在欧洲药典11.2中有相关的记载，药典中所用的流动相为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液和乙腈进行梯度洗脱，磷酸盐对色谱柱的影响较大，长时间使用会减少色谱柱的使用寿命。

2,6-二甲基苯胺也是布比卡因碱在高温、强光、强氧化剂下的分解产物，因此，亟需一种2,6-二甲基的分析方法来方便有效检测和控制其含量，提高药物的安全性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种更加方便进行有效检测和控制其含量的布比卡因碱中起微量基因毒性杂质的高效液相色谱检测方法。

为了实现上述发明目的，本发明布比卡因碱中起微量基因毒性杂质的高效液相色谱检测方法采用的如下技术方案：

一种布比卡因碱中起微量基因毒性杂质的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：

(1)样品的配制：

取布比卡因碱样品适量，精密称定，用溶剂稀释，定容，得到布比卡因碱溶液；取杂质2,6-二甲基苯胺适量，精密称定，用溶剂稀释，定容，得到杂质溶液，作为供试品溶液；所述溶剂为甲醇；

(2)检测：

取布比卡因碱溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进样量为5-20μL，流速为0.8-1.5mL/min，读取数据，记录色谱图；流动相A为磷酸水溶液或乙酸水溶液和甲醇的混合溶液，流动相B为甲醇。

优选的，所述高效液相色谱仪的色谱柱采用十八烷基硅胶键合色谱柱。

优选的，所述高效液相色谱仪的色谱柱的柱温为20-40℃。

优选的，所述杂质溶液的浓度为0.00002mg/mL-0.00006mg/mL。

优选的，所述流动相A中磷酸水溶液或乙酸水溶液的比例为60％-95％。

优选的，所述流动相A中甲醇的比例为5％-40％。

优选的，高效液相色谱仪的检测器为紫外吸收检测器，检测波长为200-380nm。

杂质2,6-二甲基苯胺，其结构式为：

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明很好的补充了布比卡因碱中基因毒性杂质在分析技术上的不足；

2、本发明可用于布比卡因碱中微量基因毒性杂质2,6-二甲基苯胺的检测，也可用于利多卡因以及其他以2,6-二甲基苯胺为原料或分解产生2，6-二甲基苯胺的相关检测，本发明灵敏度高，操作方便，流动相简单，对色谱柱的伤害较小；

3、本发明能方便有效的检测出布比卡因碱中2,6-二甲基苯胺的含量，给合成提供后处理的数据支持，从而方便有效的控制2,6-二甲基苯胺的含量，使药物的安全性得以保障；

4、本发明的分离度好，专属性较高，欧洲药典11.2中2,6-二甲基苯胺检出限度为10ppm，本发明的检出限度为1ppm，本发明相较于药典来说，灵敏度高，适用性也广，可用于布比卡因碱以及利多卡因等以2,6-二甲基苯胺为原料或者分解产生2,6-二甲基苯胺的杂质检测。

附图说明

图1为实施例1条件下空白溶液高效液相色谱图；

图2为实施例1条件下一次对照溶液高效液相色谱图；

图3为实施例1条件下二次对照溶液高效液相色谱图；

图4为实施例1条件下三次对照溶液高效液相色谱图；

图5为实施例1条件下四次对照溶液高效液相色谱图；

图6为实施例1条件下五次对照溶液高效液相色谱图；

图7为实施例2条件下样品溶液高效液相色谱图；

图8为对比例1条件下空白溶液高效液相色谱图；

图9为对比例1条件下一次对照溶液高效液相色谱图；

图10为对比例1条件下二次对照溶液高效液相色谱图；

图11为对比例1条件下三次对照溶液高效液相色谱图；

图12为对比例1条件下四次对照溶液高效液相色谱图；

图13为对比例1条件下五次对照溶液高效液相色谱图；

图14为对比例2条件下样品溶液高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1：系统适用性

实验仪器与色谱条件

仪器：安捷伦(Agilent)1260高效液相色谱仪；

流动相A：0.1％磷酸：甲醇＝90:10；

流动相B：甲醇；

溶剂：10％甲醇；

色谱条件：

色谱柱：Hypersil BDS C18，250*4.6mm，5μm；

流速：1.0mL/min；。

进样量：10μL；

波长：210nm；

柱温：25℃；

梯度洗脱程序：

实验步骤：

空白溶液：10％甲醇

对照储备液：精密量取25μL 2,6-二甲基苯胺标准品置于10mL容量瓶中，甲醇定容；

对照溶液：量取1.0mL对照储备液置于100mL容量瓶中，加入10％甲醇定容作为储备液1，量取1.0mL储备液1于50mL容量瓶中，加入10％甲醇定容，作为储备液2，量取1.0mL储备液2置于10mL容量瓶中，加入10％甲醇定容；

取空白溶液、对照溶液，注入高效液相色谱仪进行测试系统适用性，空白溶液进样1次，对照溶液进样5次，读取数据，记录色谱图，得到图1-图6，同时得到以下结果，见表1

表1

结论：实施例1的基线稳定，流动相配制简单。

实施例2：样品检测

实验仪器与色谱条件

仪器：安捷伦(Agilent)1260高效液相色谱仪；

流动相A：0.1％磷酸：甲醇＝90:10；

流动相B：甲醇；

溶剂：10％甲醇；

色谱条件：

色谱柱：Hypersil BDS C18，250*4.6mm，5μm；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

波长：210nm；

柱温：25℃；

梯度洗脱程序：

实验步骤：

样品溶液：取500mg布比卡因碱样品于10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀；

将上述样品溶液注入高效液相色谱仪中，记录图谱，典型图谱见图7。

结论：在样品中未检出2，6-二甲基苯胺，此样品中2,6-二甲基含量小于1ppm。

对比例1：系统适用性

按照《欧洲药典11.2》方法以及色谱条件，具体实验步骤如下：

取杂质2,6-二甲基苯胺，精密称定，用溶剂稀释，定容，得到杂质溶液，作为对照溶液；

将空白溶液、对照溶液，注入高效液相色谱仪进行测试系统适用性，流动相为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液和乙腈进行梯度洗脱，空白溶液进样1次，对照溶液进样5次，读取数据，记录色谱图，典型图谱见图8-图13，同时得到以下结果，见表2；

表2

结论：从图8-12可以看出，虽然空白峰对结果无影响，但是基线波动较大。

对比例2：样品的检测

按照《欧洲药典11.2》方法以及色谱条件，具体实验步骤如下：

样品溶液：取500mg布比卡因碱样品于10mL容量瓶中，加溶剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀；

将上述样品溶液注入高效液相色谱仪中，流动相为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液和乙腈，记录图谱，典型图谱见图14；根据图14得出如下结论：《欧洲药典11.2》中2，6-二甲基苯胺限度为10ppm，在样品中未检出2,6-二甲基苯胺，因此，2，6-二甲基苯胺含量小于10ppm。

综上：实施例1和对比例1相比，实施例1相对于对比例的条件下，基线更稳，流动相配制更为简单；实施例2和对比例2相比，能够检测出中2,6-二甲基含量小于1ppm。