一种抗急性肺损伤多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种抗急性肺损伤多肽及其应用名称。

背景技术

急性肺损伤(Acute Lung Injury，ALI)是一种因机体受到感染或创伤，或在休克等情况下，因肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤造成急性肺水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭的临床常见危重病，严重时会致人死亡。

目前，临床上治疗急性肺损伤的方法主要有机械通气和药物治疗两种。机械通气主要是辅助病人自主呼吸，以挽救呼吸衰竭患者，但机械通气会滞留气道分泌物，导致肺部感染发炎。药物治疗虽不会导致肺部感染发炎，但药物治疗主要使用的是抗生素与类固醇，此类药物长期服用易产生耐药性和副作用。因此，需提供安全无副作用的用于治疗急性肺损伤的药物。

多肽是一种由多个α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，具有多种生物活性。但现已报道的具有抗急性肺损伤活性的多肽较少，不利于临床药物的开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗急性肺损伤多肽，丰富具有抗急性肺损伤活性的多肽库，以促进临床用于预防和/或治疗急性肺损伤的药物的开发。

本发明的第一个目的是提供一种抗急性肺损伤多肽。

本发明的第二个目的是提供所述抗急性肺损伤多肽或其相关生物材料在制备预防和/或治疗急性肺损伤的药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种用于预防和/或治疗急性肺损伤的药物。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种抗急性肺损伤多肽，所述抗急性肺损伤多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～5任一所示。

本发明上述多肽均具有抗急性肺损伤活性。基于本发明提供的多肽的氨基酸序列，也可通过分子手段实现对所述抗急性肺损伤多肽的表达，虽未直接利用所述多肽，也可实现抗肺损伤效果。因此，本发明请求保护所述抗急性肺损伤多肽或其相关生物材料在制备用于预防和/或治疗急性肺损伤的产品中的应用。

具体地，所述相关生物材料为能够表达本发明所述抗急性肺损伤多肽的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组质粒、重组菌或重组细胞。

具体地，本发明所述抗急性肺损伤多肽能够显著降低急性肺损伤细胞中的丙二醛(MDA)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)和/或过氧化氢酶(CAT)活力，降低活性氧(ROS)水平，从而改善急性肺损伤。

具体地，本发明所述急性肺损伤为脂多糖(LPS)引起的急性肺损伤。

具体地，所述产品为药物。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗急性肺损伤的药物，所述药物中含有本发明所述抗急性肺损伤多肽或其相关生物材料。

具体地，所述相关生物材料为能够表达本发明所述抗急性肺损伤多肽的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组质粒、重组菌或重组细胞。

具体地，所述药物中还含有辅料。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种抗急性肺损伤多肽，所述多肽可以显著降低急性肺损伤细胞中的MDA含量，提高SOD和CAT酶活力，降低ROS水平，从而改善急性肺损伤，且所述多肽在适宜浓度范围内安全无毒性，可将其用于开发预防和/或治疗急性肺损伤的药物。本发明丰富了具有抗急性肺损伤活性的多肽，有利于临床用于预防和/或治疗急性肺损伤的药物的开发，有利于急性肺损伤的治疗。

附图说明

图1为合成的5种多肽的纯度分析结果。

图2为合成的5种多肽的质谱鉴定结果。

图3为合成的5种多肽对A549细胞存活率的影响。

图4为不同浓度LPS对A549细胞存活率的影响。

图5为合成的5种多肽的体外抗急性肺损伤活性。

图6为合成的5种多肽对急性肺损伤细胞模型MDA含量、SOD和CAT酶活力的影响。

图7为合成的5种多肽对急性肺损伤细胞模型活性氧含量的影响。

图中#代表与空白组相比，有显著差异，P<0.05；##代表与空白组相比，有极显著差异，P<0.01；*代表与模型组相比，有显著差异，P<0.05；**代表与模型组相比，有极显著差异，P<0.01。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明实施例中每组数据重复测定3次，结果表示为平均值±标准偏差，使用SPSS20.0进行单因素均值比较(ANOVA)，选用LSD法进行组间显著性分析。

实施例1多肽的合成及鉴定

本发明经大量研究发现了5个可能具有抗急性肺损伤活性的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下表1所示：

表1多肽的氨基酸序列

本发明对表1所示的5个多肽进行了固相合成(纯度≥95％，由南京肽谷生物科技有限公司协助完成)，同时对合成的多肽进行了纯度鉴定和质谱鉴定。

1、多肽的纯度鉴定

通过高效液相法检测多肽的纯度；分析条件：色谱柱：Kromasil C18(4.6×150mm，5μm)；流动相：A为乙腈(含1％三氟乙酸)，B为水(含1％三氟乙酸)；洗脱梯度：0→0.01min，5％ A；0.01→25min，50％ A；25→30min，90％ A；流速：1mL/min；检测波长：214nm；上样量：20μL。

2、多肽的质谱鉴定

对多肽进行ESI-MS质谱鉴定，通过质谱图上的分子量和理论值来确定液相中的主要物质是否为目标产物；仪器条件：流动相A：水(含1％甲酸)；流动相B：乙腈(含1％甲酸)；流速：0.2mL/min；正离子模式；扫描范围：0～2000Da。

合成的5种多肽的纯度分析结果和质谱鉴定结果分别如图1和图2所示。由图1可知，本发明合成的5种多肽中，主峰占主要比例，只有极少杂峰出现。经计算，T1、T2、T3、T4和T5的纯度分别为97.46％、95.57％、98.58％、99％和99.11％。在一级质谱图(图2)中，合成肽T1的分子离子峰m/z为908.92，带一个电荷，与T1分子量理论值一致，且谱图中占比最高的离子峰454.96为肽T1断裂的主要碎片。相似的，合成肽T2、T3、T4和T5分子离子峰分别为1028.38、992.78、1353.34和1063.97，均带一个电荷，与理论分子量一致，同时观测到相应的碎片离子峰分别为514.53、497.01、677.39和532.68。上述结果表明，本发明合成所得5种多肽均为目标多肽，且纯度满足后续实验要求。

实施例2细胞毒性检测

本实施例通过检测合成的表1所示多肽处理后细胞的存活率，对所述多肽对人肺泡上皮细胞的毒性进行了检测。

1、多肽的溶解

在超净工作台中，将合成的5个多肽分别用DMEM培养基溶解成1mg/mL溶液，无菌0.22μm滤膜过滤除菌，于-20℃冰箱保存备用。

2、人肺泡上皮细胞培养

A549细胞(人肺泡上皮细胞)保持了II型肺泡上皮细胞的重要特征，是研究急性肺损伤的常用细胞株。将A549细胞用完全培养基(含90％DMEM培养基、10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗溶液)，于37℃、饱和湿度、含5％ CO

3、细胞毒性检测

将培养的A549细胞以5×10

细胞存活率＝(OD实验组-OD调零组)/(OD空白组-OD调零组)×100％合成的5种多肽对A549细胞存活率的影响如图3所示。由图3可知，在10～100μg/mL浓度范围，合成的5种多肽均表现为无毒作用；其中，T2和T3对细胞增殖起一定促进作用。在500μg/mL下，T1、T2表现为促进增殖作用，而T4和T5干预下细胞存活率有一定程度下降，可能高浓度下肽T4和T5对细胞存在毒害作用。因此，本发明以100μg/mL为多肽干预浓度进行后续实验。

实施例3抗急性肺损伤活性检测

1、急性肺损伤细胞模型的建立

A549细胞以5×10

不同浓度LPS对A549细胞存活率的影响如图4所示。由图4可知，当LPS浓度为10～20μg/mL时，与正常组相比，细胞存活率下降显著(p<0.05)，以存活率60％左右对应的20μg/mL LPS浓度建立急性肺损伤细胞模型。

2、多肽对急性肺损伤细胞模型的干预作用

A549细胞以5×10

合成的5种多肽的体外抗急性肺损伤活性如图5所示。由图5可知，本发明表1所示的5种多肽对急性肺损伤细胞模型细胞的存活率均有明显的提升(p<0.05或p<0.01)，即本发明所述的多肽对LPS诱导的细胞损伤有改善作用，具有抗急性肺损伤活性。

3、多肽对急性肺损伤细胞模型MDA含量、SOD和CAT酶活力的影响

A549细胞以5×10

合成的5种多肽对急性肺损伤细胞模型MDA含量、SOD和CAT酶活力的影响如图6所示。由图6可知，与空白组相比，模型组细胞内的MDA含量显著上升，SOD、CAT酶活力下降(P<0.01)；而与模型组相比，除多肽T2和T4外，其他多肽均能显著降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)，且T3和T5能显著提升SOD、CAT活性，表明本发明所述多肽能一定程度上改善急性肺损伤细胞模型中的过氧化性损伤，降低脂类过氧化物的形成。

4、多肽对急性肺损伤细胞模型活性氧含量的影响

A549细胞按1×10

ROS是细胞正常或异常代谢均可产生的物质，过量的ROS会破坏生物膜和细胞的正常功能，使酶活性降低、脂质氧化加重，促进细胞的死亡。合成的5种多肽对急性肺损伤细胞模型活性氧含量的影响如图7所示。由图7可知，与空白组相比，模型组细胞ROS水平显著升高(p<0.01)，在多肽的作用下，ROS水平显著降低(p<0.01)。结合细胞中MDA含量、SOD和CAT酶活力的结果可知，在LPS诱导下细胞中ROS水平增加，ROS代谢产物MDA含量增多，而抑制ROS产生的SOD和CAT的活性降低，在多肽T3、T5作用下，细胞中ROS水平降低、MDA含量降低、SOD和CAT活性升高，表明T3和T5能有效减缓LPS对肺泡上皮细胞的损伤。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。