一种鉴定西葫芦果皮颜色的连锁分子标记及其专用引物和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及与西葫芦果皮性状相关的APRR2基因。

背景技术

西葫芦(Cucurbita pepo L.)是葫芦科南瓜属的一年生藤蔓草本植物，又名美洲南瓜，根据食用方式可分为6个嫩瓜食用种群和2个老瓜食用种群。西葫芦在世界各国普遍栽培，我国各地广泛种植。西葫芦富含多种营养物质，具有除烦止渴、清热利尿、增强免疫力等功效，其种植简单，栽培周期短，高产耐贮，生长温度需求较低，冬季设施栽培和早春露地栽培可取得较好的经济效益。西葫芦的全球总产量可达2500万吨/年，种植面积近200万公顷，我国西葫芦的种植面积以年增长率3.18％的速度增加。

果皮颜色是葫芦科蔬菜的重要商品性状之一，葫芦科蔬菜具有不同深度黄色和绿色等颜色的果皮。葫芦科植物的果皮颜色主要通过果皮细胞内叶绿素、胡萝卜素、花青素以及类黄酮等物质的积累形成，而APRR2基因可通过影响叶绿体发育以及调控叶绿素含量等方式调控果皮颜色。Liu et al(2016)报道了黄瓜果皮由APRR2基因调控，由于外显子上鸟嘌呤的插入使翻译提前停止，影响了叶绿体发育，叶绿素含量减少，形成白色瓜皮。Oren etal(2019)发现，在甜瓜和西瓜中，APRR2外显子上非同义突变或者InDel变异使得甜瓜由绿色变为白色。在冬瓜中，APRR2外显子上GA碱基的插入，导致了果皮颜色由绿色变成白色。Zhou et al(2022)研究发现，在西葫芦中，Cp4.1LG15g03420的大片段缺失导致其茎颜色由绿变为浅绿。

虽然现有技术对西葫芦果皮颜色的控制基因有所研究，但是目前还缺乏有效且快速的检测用分子标记。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种鉴定西葫芦果皮颜色的连锁分子标记及其专用引物和应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种引物组合，包括第一引物组和/或第二引物组，其中，

所述第一引物组用于扩增SNP位点CpSNP01以确定SNP位点CpSNP01对应的基因型，所述SNP位点CpSNP01位于西葫芦参考基因组MU-CU-16v4.1的5号染色体的第1094111位，该位点的核苷酸碱基为G或C；

所述第二引物组用于扩增SNP位点CpSNP02以确定SNP位点CpSNP02对应的基因型，所述SNP位点CpSNP02位于西葫芦参考基因组MU-CU-16v4.1的5号染色体的第1094162位，该位点的核苷酸碱基为G或A。

在上述引物组合中，作为一种优选方式，所述第一引物组包括:5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的第一正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第二正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物；所述第二引物组包括:5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第一正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第二正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物。

在上述引物组合中，作为一种优选方式，所述第一引物组包括:5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:1中自5'末端起第22至43位所示的第一正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ IDNO:2中自5'末端起第22至43位所示的第二正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物；所述第二引物组包括:5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:4中自5'末端起第22至44位所示的第一正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:5中自5'末端起第22至45位所示的第二正向引物、5'-3'核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物。

进一步地，所述第一引物组中的第一正向引物的5'端和所述第一引物组中的第二正向引物的5'端添加有发出不同颜色的荧光标签序列；

所述第二引物组中的第一正向引物的5'端和所述第二引物组中的第二正向引物的5'端添加有发出不同颜色的荧光标签序列；

更进一步优选地，荧光标签序列选自FAM、TET、VIC、HEX中的一种。

本发明第二方面提供上述引物组合在如下方面(1)或(2)中的应用：

(1)制备鉴定西葫芦果皮颜色的试剂盒；

(2)鉴定西葫芦果皮颜色；

(3)西葫芦果皮颜色育种。

在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述西葫芦果皮颜色为绿色或浅绿色。

在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述鉴定西葫芦果皮颜色的方法如下：

基于SNP位点CpSNP01的判断如下：如果某供试西葫芦PCR产物检测显示蓝色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为C:C纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示红色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:G纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为浅绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示绿色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:C杂合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色；

基于SNP位点CpSNP02的判断如下：如果某供试西葫芦PCR产物检测显示蓝色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:G纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示红色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为A:A纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为浅绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示绿色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:A杂合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色。

本发明第三方面提供一种鉴定西葫芦果皮颜色的方法，所述方法包括：

S1：提取待检测西葫芦品种的基因组DNA，以该基因组DNA为模板、权利要求1-4任一项所述引物组合中的第一引物组或第二引物组为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S2：，采用仪器检测PCR扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色确定待检测西葫芦品种的果皮颜色。

在上述方法中，作为一种优选实施方式，所述PCR为touch down PCR；

优选地，所述PCR反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃，1min，其中每循环降低0.6℃，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。

在上述方法中，作为一种优选实施方式，根据荧光信号的颜色确定待检测西葫芦品种的果皮颜色的方法如下：

针对采用第一引物组进行PCR扩增得到的PCR扩增产物，如果PCR扩增产物显示蓝色荧光信号，则该待检测西葫芦基于SNP位点CpSNP01的基因型为C:C纯合型，对应的该待检测西葫芦的果皮颜色为绿色；如果PCR产物检测显示红色荧光信号，则该待检测西葫芦基于该SNP位点CpSNP01的基因型为G:G纯合型，对应的该待检测西葫芦的果皮颜色为浅绿色；如果PCR产物检测显示绿色荧光信号，则该待检测西葫芦基于该SNP位点CpSNP01的基因型为G:C杂合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色；

针对采用第二引物组进行PCR扩增得到的PCR扩增产物，如果PCR产物检测显示蓝色荧光信号，则该待检测西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:G纯合型，对应的该待检测西葫芦的果皮颜色为绿色；如果PCR产物检测显示红色荧光信号，则该待检测西葫芦基于该SNP位点的基因型为A:A纯合型，对应的该待检测西葫芦的果皮颜色为浅绿色；如果PCR产物检测显示绿色荧光信号，则该待检测西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:A杂合型，对应的该待检测西葫芦的果皮颜色为绿色。

本发明中，所述浅绿色为比标准绿色(RGB色值是0,255,0)色度浅的绿色系；所述绿色为与标准绿色(RGB色值是0,255,0)色度相当或比标准绿色(RGB色值是0,255,0)色度深的绿色系。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

西葫芦的全基因组现已组装完成，这一工作为西葫芦基因的GWAS分析提供参考。本发明对128份西葫芦种质资源进行重测序工作，利用128份西葫芦重测序数据进行GWAS关联分析，发现西葫芦果皮颜色调控的序列区间为APRR2基因，通过这一发现获得了相应的SNP标记位点，进而开发分子标记。通过第三代分子标记技术对西葫芦果皮性状紧密连锁SNP位点的挖掘，对西葫芦果皮颜色的分子标记辅助育种工作的开展具有重要意义。

利用本发明提供的SNP标记位点可以鉴定西葫芦果皮颜色为绿色还是浅绿色，鉴定方法简单、准确率高。本发明提供的SNP标记可以用于鉴定任何种质或品种的葫芦科果皮颜色。

附图说明

图1为128份西葫芦果皮颜色与全基因组SNP关联分析的结果。

图2为128份西葫芦果皮颜色与全基因组SNP关联分析的Quantile-quantitle图结果。

图3为西葫芦果皮颜色表型分类举例。

图4为59份西葫芦样品采用引物组1的SNP分型结果。

图5为59份西葫芦样品采用引物组2的SNP分型结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、用于鉴定西葫芦果皮颜色功能位点SNP引物组合的获得

本发明基于北京市农林科学院蔬菜所种质库128份西葫芦代表资源的重测序工作所得数据。

一、128份西葫芦SNP变异位点获取流程如下：

(1)使用Trimmomatic软件对128份重测序数据进行质控，去除接头和低质量序列(参数‘SLIDINGWINDOW:4:20，LEADING:3，TRAILING:3，MINLEN:40’)。

(2)使用BWA(V0.7.15)软件将Clean read(干净的读长)与OHB3-1 v2.0版本的基因组进行比对，比对成功的reads使用Picard软件(v1.119,http://broadinstitute.github.io/picard/)去除PCR冗余。

(3)使用GATK(V3.8)软件解析变异，获得原始变异组合。

(4)将(3)获得的变异使用GATK SelectVariants获得SNPs位点，并进一步使用GATK VariantFiltration得到高质量的SNPs(SNPs过滤参数:QD>2.0，FS<60.0,MQ>40.0，MQRankSum>-12.5，ReadPosRankSum>-8.0)。

(5)128份资源的果皮颜色统计：取商品期西葫芦果实，与PANTONE国际比色卡进行比色，浅白绿(344C)记为0，黄绿色(374C)记为2，灰绿色(346C)记为4，草绿色(347C)记为6，深翠绿色(356C)记为8，深黑绿色(357C)记为10，具体颜色参见图3。结合128份西葫芦果皮颜色的农艺性状和全基因组SNP，利用Fastlmm软件进行关联分析获得与果皮颜色连锁的SNP(图1)，在此区间内存在APRR2簇，分别为Cp4.1LG05g02060、Cp4.1LG05g02070和Cp4.1LG05g02080。基于上述结果并进行Quantile-quantitle Plot分析(图2)，Quantile-quantitle图显示图尾部明显翘起，观察值与预期线存在偏差，表明西葫芦果皮颜色的性状与SNP基因型之间存在显著相关性。

二、获取鉴定西葫芦果皮颜色功能位点SNP的引物组合

在西葫芦参考基因组MU-CU-16v4.1(cucurbitgenomics.org)的LG05染色体上，有2个SNP位点与西葫芦果皮颜色具有较高的连锁度，分别为1094111(记为CpSNP01，碱基为C或G)和1094162(记为CpSNP02，碱基为G或A)。SNP位点CpSNP01和CpSNP02可以用于鉴定西葫芦果皮为绿色或浅绿色。

基于SNP位点CpSNP01和CpSNP02开发用于鉴定西葫芦果皮颜色的SNP引物组合。

SNP引物组合由2个引物组组成，每个引物组的名称见表1中第二列。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个SNP位点。2个引物组中各个引物的核苷酸序列如表1中第4列所示。

表1用于鉴定西葫芦果皮颜色的SNP引物

注：单下划线为FAM荧光标签序列，荧光颜色为蓝色；双下划线为HEX荧光标签序列，荧光颜色为红色。

实施例2、实施例1开发的SNP引物组合有效性检验

本实施例中的59个供试西葫芦资源基本信息见表2。59个供试西葫芦资源果皮表皮表型颜色参见表2。浅绿色是比标准绿色(RGB色值是0,255,0)色度浅的绿色系；绿色是与标准绿色(RGB色值是0,255,0)色度相当或比标准绿色(RGB色值是0,255,0)色度深的绿色系。比如，浅白绿色、黄绿色和灰绿色比标准绿色(RGB色值是0,255,0)浅，属于浅绿色；而草绿色、深翠绿色、深黑绿色与标准绿色(RGB色值是0,255,0)色度深，属于绿色。

表2 59个供试西葫芦资源基本信息

1、供试西葫芦资源基因组DNA的获得

采用CTAB法分别提取59个供试西葫芦种质资源的叶片(植株嫩叶组织)的基因组DNA，得到供试西葫芦资源的基因组DNA。

供试西葫芦资源的基因组DNA质量和浓度均须满足PCR要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试西葫芦资源的基因组DNA的浓度在10-30ng/μL。

2、分别以59个供试西葫芦资源的基因组DNA为模板，各采用2个引物组分别进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物。

两个引物组的PCR反应体系均为：共计10μl，其中，2×PCR预混液5μl，去离子水3.36μl，引物工作液0.14μl，基因组DNA1.5μl，名称中含有“F1”的引物、名称中含有“F2”的引物和名称中含有“R”的引物的浓度为200pmol/μL，以2:2:5的摩尔比例混合。

两个引物组的反应程序均为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性1min和延伸1min，以该部分程序继续扩增26个循环。

3、完成步骤2后，待各个PCR扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的FAM、HEX光束扫描读取荧光值(FAM荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，HEX荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断59份供试西葫芦资源基于SNP位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试西葫芦基于某SNP位点显示蓝色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基”纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色；如果某供试西葫芦基于某SNP位点显示红色荧光信号，则该供西葫芦基于该SNP位点的基因型为“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基”纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为浅绿色；如果某供试西葫芦资源基于某SNP位点显示绿色荧光信号，则该供试西葫芦资源基于该SNP位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该SNP位点且名称中含有“F1”的引物的3’末端第1个碱基”，另一个碱基“扩增该SNP位点且名称中含有“F2”的引物的3’末端第1个碱基”，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色。

下面按照本发明提供的两个SNP位点分别说明根据基因型如何判断西葫芦的果皮表型或颜色。

基于SNP位点CpSNP01的判断如下：如果某供试西葫芦PCR产物检测显示蓝色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为C:C纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示红色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:G纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为浅绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示绿色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:C杂合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色。

基于SNP位点CpSNP02的判断如下：如果某供试西葫芦PCR产物检测显示蓝色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:G纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示红色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为A:A纯合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为浅绿色；如果某供试西葫芦PCR产物检测显示绿色荧光信号，则该供试西葫芦基于该SNP位点的基因型为G:A杂合型，对应的该供试西葫芦的果皮颜色为绿色。

需要说明的是，若PCR扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。

引物组1的SNP分型结果见图4。

引物组2的SNP分型结果见图5。

数据结果表明，2对引物组在59份供试的西葫芦资源中均可以获得较好的分型效果，且分型高度大体一致。

4、两对引物鉴定59份供试西葫芦资源果皮颜色的效率评价

统计59份供试西葫芦资源基于CpSNP01和CpSNP02的基因型。结果表明，基于CpSNP01基因型的供试西葫芦资源中，基因型和果皮颜色一致的样本54份，其中绿色果皮22份，浅绿色32份；基于CpSNP02基因型的供试西葫芦资源中，基因型和果皮颜色一致的样本54份，绿色果皮22份，浅绿色32份。吻合度计算公式：标记结果/表型结果*100％，CpSNP01基因型与表型的吻合度为91.5％，CpSNP02基因型与表型的吻合度为91.5％，两个标记的基因型共同作用下与表型的吻合度为91.5％。

表3 59份供试西葫芦资源在位点CpSNP01和CpSNP02基因型结果与表型吻合度统计

综上所述，实施例1开发的SNP引物组合可以鉴定西葫芦果皮颜色并与农艺性状鉴定结果基本一致。因此，基于实施例1开发的SNP引物组合可以检测待测西葫芦商品瓜时期的果皮颜色。