低聚木糖的含量测定方法及其应用

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，尤其涉及低聚木糖的含量测定方法及其应用。

背景技术

低聚木糖（XOS）又称寡聚糖，低聚木糖来源广泛，可从甘蔗渣、玉米棒、麦麸、稻壳和棉秆等植物中提取获得，是自然界中含量第二丰富的多糖，仅次于纤维素，一般由2-10个低聚物通过β-（1→4）糖苷键连接而成。低聚木糖是具有益生元活性的可溶性膳食纤维，有利于改善肠功能和免疫功能，其具有多种生物活性，尤其是在益生菌保健食品中，作为益生元，为益生菌供能，具有促进肠道益生菌的生长的作用，同时还可以加速脂肪代谢、改善钙的吸收、预防龋齿、具有抗氧化作用。因其具有良好的化学稳定性和加工特性，已被广泛应用于食品添加剂、营养保健品和饲料产品。

低聚木糖的组成和含量测定方法主要有：气相色谱法、毛细管电泳法、核磁共振法和高效液相色谱法，其中使用最多的是高效液相色谱法。现有的对低聚木糖测定的标准GB/T 35545-2017 和 QB/T 2984-2008，主要适用于以玉米芯为原料，经酶解精制而成的低聚木糖，两个标准为低聚木糖原料的测定标准，其检测设备为高效液相色谱 -示差检测器，需要的标准品为木糖，木二糖至木六糖，葡萄糖及 L-阿拉伯糖。该方法作为食品中添加的低聚木糖的检测手段，检测成本高，同时益生菌类保健食品中常含有大量的蛋白质，大量蛋白质在醇沉过程中包裹低聚木糖，使测量数据偏低。

此外，期刊文献（“高效液相色谱-蒸发光检测法测定保健食品中的低聚木糖”，王辰等，《2014第三届环渤海色谱质谱学术报告会》）建立高效液相色谱-蒸发光检测器测定保健食品中低聚木糖含量的方法。方法：样品经乙醇溶液沉淀大分子多糖及高聚合度木糖，溶液经沸水浴中硫酸水解后，用氢氧化钠溶液调节pH至中性，以乙腈-水(80+20)为流动相，经高效液相色谱仪-蒸发光检测器测定样品中原有木糖的质量含量和样品中低聚木糖经硫酸水解后的木糖的含量，二者之差除以平均转换系数即得到样品中低聚木糖的含量。结果显示被测组分浓度(0.0545-1.09 mg/mL)与峰面积线性关系良好(r=0.9997)，RSD=3.0%(n=6)；加标回收率为90.9%-94.6%和90.8%-95.1%，检测效果仍有待提高。

专利（CN108918729A）公开了一种饮料中低聚木糖的检测方法，其包括步骤：(1)制备标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测，得不同浓度的混合标准溶液的标准谱图；(2)将步骤(1)获得的标准谱图按低聚木糖品种分别制作浓度与色谱峰面积关系曲线图；(3)饮料样品的预处理及高效液相色谱串联质谱检测；(4)样品中的各低聚木糖的含量的确定，将步骤(3)中获得的样品谱图的保留时间确定低聚木糖品种并将其色谱峰面积与步骤(2)中得到的标准曲线比对，用插入法确定低聚木糖含量。但该技术方案需要高效液相色谱串联质谱进行检测，设备条件严苛。

折射率检测等相关方法往往不能满足现代的要求关于灵敏度或选择性的痕量水平分析。由于低聚木糖糖链没有紫外或者荧光基团，在紫外区无吸收，无法用紫外检测器和荧光检测器直接检测。化学衍生技术是规避这个问题至关重要的工具，检测前对糖进行衍生化处理，使糖链带上紫外或者荧光基团，极性发生改变，可以实现用紫外检测器进行检测。柱前衍生化具有如下优点：能选择反应条件、衍生化的副产物能消除其干扰，不需要特定的仪器，成本低，可以选择多种柱前衍生剂。

因此，针对现有技术低聚木糖检测方法存在的缺陷，本发明用 PMP 柱前衍生-高效液相色谱法测定低聚木糖含量，通过PMP 柱前衍生，可以采用紫外检测器对低聚木糖进行检测，通过对流动相和洗脱梯度进行优化，获得了优良的准确性、灵敏度和检出限，对于低聚木糖的含量检测具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了低聚木糖的含量测定方法及其应用。本发明用 PMP 柱前衍生-高效液相色谱法测定低聚木糖含量，通过PMP 柱前衍生，可以采用紫外检测器对低聚木糖进行检测，通过采用流动相A（含1v%冰醋酸和0.2v%三乙胺的0.02mol/L乙酸铵水溶液）和流动相B（体积比为1:2的乙腈/甲醇）进行梯度洗脱，获得了优良的准确性、灵敏度和检出限，对于低聚木糖的含量检测具有重要的意义。

为实现上述目的，第一方面，为实现以上目的，本发明提供了低聚木糖的含量测定方法，采用 PMP 柱前衍生-高效液相色谱法，以C18柱为色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，具体步骤如下：

1）样品前处理：将样品在酸性条件下进行水解，得水解后的样品；以PMP为衍生化试剂对水解后的样品进行衍生化反应，得到衍生化后的样品；

2）以衍生化后的样品配制供试品溶液，将供试品溶液用高效液相色谱进行检测，高效液相色谱的检测器为紫外检测器；

所述流动相A为含1v%冰醋酸和0.2v%三乙胺的0.02mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为体积比为1:2的乙腈/甲醇；

所述梯度洗脱过程设置如下：

。

在一项优选的实施方案中，将样品在酸性条件下进行水解的步骤中，采用硫酸或三氟乙酸对样品进行水解。

在一项优选的实施方案中，将样品在酸性条件下进行水解的步骤中，采用硫酸对样品进行水解，具体工艺如下：

将样品用 0.002-0.008mol/L 硫酸溶液溶解并超声，定容，得样品溶液1，向样品溶液1中加入D-盐酸氨基葡萄糖溶液和3-5mol/L 硫酸溶液，于沸水浴水解60-150min，中和。

在一项优选的实施方案中，样品与 0.002-0.008mol/L 硫酸溶液的质量体积比为2g:6-9mL，样品溶液1中样品浓度为0.1-0.3g/mL；内标溶液为浓度为1-4mg/mL的D-盐酸氨基葡萄糖溶液，内标溶液与样品溶液1的体积比为1:0.8-1.2；3-5mol/L 硫酸溶液与样品溶液1的体积比为1:3-6。

在一项优选的实施方案中，以PMP为衍生化试剂对水解后的样品进行衍生化反应的步骤中，衍生化反应条件为：60-80℃下反应60-150min。

在一项优选的实施方案中，色谱柱参数为：4.6mm×250mm，5μ m。

在一项优选的实施方案中，流速为0.5-1.5mL/min，优选为1.0mL/min；检测波长为245-255nm，优选为250nm；柱温为20-40 ℃，优选为30 ℃；进样量为20μL。

第二方面，本发明提供了前述低聚木糖的含量测定方法在含低聚木糖的食品检测中的应用。

在一项优选的实施方案中，所述含低聚木糖的食品包括固体食品和液体食品，优选为衡欣牌低聚木糖胶原蛋白益生菌粉、新衡欣牌益生菌粉、芷轻®益生菌粉焕畅低聚木糖醇豆浆粉，焕畅小分子蛋白肽，焕畅低聚木糖醇醋饮，龙力牌益常乐口服液，所述益生菌粉包括衡欣牌低聚木糖胶原蛋白益生菌粉、新衡欣牌益生菌粉、芷轻®益生菌粉。

与现有技术比，本发明的技术优势在于：

1、本发明用 PMP 柱前衍生-高效液相色谱法测定低聚木糖含量，通过PMP 柱前衍生，可以采用紫外检测器对低聚木糖进行检测。

2、本发明通过采用流动相A（含1v%冰醋酸和0.2v%三乙胺的0.02mol/L乙酸铵水溶液）和流动相B（体积比为1:2的乙腈/甲醇）进行梯度洗脱，获得了优良的准确性、灵敏度和检出限，其中，检测低聚木糖回收率为96.98%-100.56%、相对标准差在0.27-0.79、相关系数R为0.9995、最低检出限为1mg/100g，对于低聚木糖的含量检测具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1空白溶液（纯化水）色谱图；

图2为实施例1衍生化后的对照品溶液色谱图；

图3为实施例1衍生化后的样品溶液（即供试品溶液）色谱图，其中峰1为D-盐酸氨基葡萄糖，峰2为葡萄糖，峰3为木糖；

图4为实施例1专属性-空白实验色谱图；

图5为实施例1低聚木糖标准曲线；

图6为对比例1的衍生化后的样品溶液（即供试品溶液）色谱图；

图7为对比例2的衍生化后的样品溶液（即供试品溶液）色谱图。

具体实施方式

以下将结合说明书附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

制备样品，采用 PMP 柱前衍生-高效液相色谱法，以C18柱为色谱柱，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱。

具体如下：

1 试剂和材料

1.1试剂：

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、盐酸、硫酸、氢氧化钠，分析纯；乙腈、乙酸铵、三氯甲烷、甲醇：色谱纯。

1.2 试剂配置

4.0mol/L硫酸：吸取12mL硫酸溶液，缓缓注入100mL水中，不断搅拌，冷却后摇匀。

0.005mol/L硫酸溶液：吸取0.15mL硫酸溶液，缓缓注入1000mL水中，不断搅拌，冷却后摇匀。

4.0mol/L 氢氧化钠：称取16g氢氧化钠，加50mL水溶解，待冷却至室温后，加水至100mL。

0.3mol/L 氢氧化钠：称取1.2g氢氧化钠，加50mL水溶解，待冷却至室温后，加水至100mL。

0.5mol/L PMP溶液：称取 (1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇：称取0.87g PMP，加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀。

1.3标准品和样品

D-盐酸氨基葡萄糖，批号140649-201606 ，纯度100%，厂家：中国食品药品鉴检定研究院；

木糖，批号15001，纯度99.7%，厂家：计量院。

样品：衡欣牌小衡欣粉，批号为190304，哈尔滨美华生物技术股份有限公司。

2 仪器设备

液相色谱仪Thermo U3000；电子天平（ML204/02），感量0.0001g。

3 含量测定实验过程

3.1 标准溶液的配制

D-盐酸氨基葡萄糖标准储备液（内标溶液）：精密称取D-盐酸氨基葡萄糖0.0227g于10mL容量瓶中，加水溶解后定容至刻度，摇匀，配制成浓度为2.270mg/mL的内标溶液。

木糖标准储备液：精密称取木糖0.09097于10mL 容量瓶中，加水溶解后定容至刻度，摇匀，配制成木糖浓度为9.070mg/mL木糖标准储备液。

对照品溶液：分别准确吸取木糖标准储备液0.40mL、D-盐酸氨基葡萄糖标准储备液（内标溶液）0.10mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成木糖浓度为0.3134mg/mL，D-盐酸氨基葡萄糖浓度为0.0227mg/mL的对照品溶液。

3.2 样品溶液的制备

精密称取衡欣牌小衡欣粉样品（2g，精确至0.0001g）（批号为190304），加入0.005mol/L硫酸溶液8mL，溶解后，超声30min，冷却后，加水定容至10mL，得样品溶液1。吸取0.50mL样品溶液1，加入0.50mL内标溶液，加120μL 4.0mol/L硫酸溶液，于沸水浴水解100min，取出，冷却，加入240μL 4.0mol/L NaOH溶液中和，用水定容至50mL，备用。

3.3 衍生反应

对照品溶液与样品溶液各吸取400μL，再分别加入0.5mol/L PMP溶液400μL、0.3mol/L的氢氧化钠溶液400μL，混匀，70℃水浴反应100min。取出后冷却至室温，加入0.3mol/L的盐酸溶液400μL，混匀，加入2mL三氯甲烷，振摇，静置分层，弃去三氯甲烷层，反复洗涤4次，水层过0.45μm 滤膜，分别得到衍生化后的对照品溶液和衍生化后的样品溶液（即供试品溶液）。

3.4 液相色谱测定条件

仪器：液相色谱仪Thermo U3000（紫外检测器）；

色谱柱：C18柱，柱参数为：4.6mm×250mm，5μ m，型号Hypersil GOLD，购自美国赛默飞公司。

流动相A：含1v%冰醋酸和0.2v%三乙胺的0.02mol/L乙酸铵水溶液，配置方式如下：称取1.542g乙酸铵，用水溶解后，加入10mL冰醋酸和2mL三乙胺，搅拌均匀，加水至1000mL，过滤、脱气后做流动相使用。

流动相B：将乙腈和甲醇按体积比1:2混合均匀。

洗脱梯度设置如下：

检测器：UV；检测波长：250nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：20μl。

3.5检测

分别取空白溶液（纯化水）、衍生化后的对照品溶液、衍生化后的样品溶液（即供试品溶液）进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，计算样品中低聚木糖的含量，空白溶液（纯化水）色谱图如附图1，衍生化后的对照品溶液色谱图如图2，衍生化后的样品溶液色谱图如图3。

样品含量计算公式

式中：f-校正因子；

A

A

c

c

X-样品中低聚木糖（以木糖计）的含量，g/100g；

A

A

c

f-校正因子；

V-定容体积，mL；

m-样品称样量，g。

4方法学验证

对以上方法进行方法学验证，验证项目包括专属性、线性、精密度、准确度、检测限、耐用性，具体如下：

4.1专属性试验

4.1.1空白溶液：取溶解标准品所用试剂，即纯化水，按照含量测定方法（3.1-3.5）进行测试，其色谱图同附图1。

4.1.2空白实验：不添加样品，其余步骤同测定方法3.1-3.5，进行低聚木糖测试，色谱图见附图4。

结果及结论：从附图1和附图4可以看出，在该测定方法条件下，空白溶液、空白试验在250nm处均无吸收峰，无干扰峰，不影响含量测定，专属性良好。

4.2线性

标准曲线溶液：分别准确吸取木糖标准储备液0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL于10mL 容量瓶中，每个容量瓶中均加入0.10mL D-盐酸氨基葡萄糖标准储备液（内标溶液），加水定容至刻度，配制成木糖浓度分别为0.0907mg/mL、0.1814mg/mL、0.3629mg/mL、0.5443mg/mL、0.7258mg/mL、0.9072mg/mL，D-盐酸氨基葡萄糖浓度均为0.0227mg/mL的标准曲线溶液，按照3.4的色谱测定条件进行检测，木糖标准溶液浓度线性范围0.0907 mg/mL-0.9072 mg/mL，测定结果见表1，低聚木糖标准曲线见图5。

表1 线性试验结果

结果及结论：由以上数据可知，在本检测方法下，在0.0907mg/mL-0.9072mg/mL范围内，木糖浓度与内标（D-盐酸氨基葡萄糖）浓度比值与木糖峰面积与内标（D-盐酸氨基葡萄糖）峰面积比值线性关系良好，线性回归方程：y = 1.3587x-1.1752；相关系数，R=0.9995。

4.3 精密度试验

同一均匀衍生化后的样品溶液（即供试品溶液），取6个平行样品，按照3.4的色谱测定条件进行检测，并计算其含量，重复性试验测定结果见表2。

表2 精密度测定结果

结果及结论：由表2可知，在精密度试验中，6次含量测定结果均值为12.60g/100g，RSD为1.25%，方法重复性良好。

4.4 准确度试验

分别称取九份样品（精确至0.0001g）于10mL容量瓶中，分别加入木糖对照品101mg（相当于加标量100.70mg）、127mg（相当于加标量126.62mg）、152mg（相当于加标量151.54mg），即加入量与样品中待测定成分量之比分别为0.8:1、1:1、1.2:1，每个水平分别做三个平行试样（具体见表3），以下按照（3.2-3.4）步骤操作，准确度结果见表3。

其中，测得量按照3.5中公式进行计算；

样品本底量=样品含量（12.60g/100g）×回收率取样量

表3 准确度试验结果

结果及结论：由以上数据可知，在本检测方法下，回收率在96.98%-100.56%范围内，且RSD均小于1.5%；本方法可以准确测定样品中低聚木糖含量。

4.5 检出限试验

用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度标样按方法注入色谱仪中，以信噪比为3:1时注入仪器的量为检测限，信噪比为3:1时，样品浓度为0.0004mg/mL。当取样量为2g，定容体积为10mL，根据仪器检出限计算方法检出限。

结果及结论：按照含量测定方法配制标准溶液，以信噪比为3:1时，注入液相色谱仪中标准溶液浓度为0.0004mg/mL，即为仪器检出限，当取样量为2g，定容体积为10mL时，方法检出限为1mg/100g。

4.6 耐用性

4.6.1 样品溶液稳定性试验

按照3.2-3.3制备样品溶液，连续进样6次，考察其稳定性，结果见表4：

表4 样品溶液稳定性试验

由以上数据可知，在本检测方法下，同一供试品溶液，连续进样6次，相对标准偏差较小，为0.65%。

4.6.2 改变色谱柱温度，其余按照含量测定方法（3.2-3.4）进行样品含量测定，结果见表5：

表5：耐用性试验-色谱柱温度测定结果

由以上数据可知，在本检测方法下，在改变色谱柱温度后，与精密度含量测定结果相比，样品含量测定结果未发生显著变化，相对误差为0.34%，小于1.5%。

4.6.3 改变色谱流速，其余按照含量测定方法（3.2-3.4）进行样品含量测定，结果见表6。

表6 耐用性试验-改变色谱流速测定结果

由以上数据可知，在本检测方法下，在改变色谱柱温度后，与精密度含量测定结果相比，样品含量测定结果未发生显著变化，相对误差为1.30%，小于1.5%。

结果及结论：在本检测方法下，样品连续测定6次，相对标准偏差小于1.5%；当改变色谱柱温度、色谱流速时，相对误差均小于1.5%，对含量测定结果无显著性影响，该方法耐用性良好。

4.7三批次样品测定结果

取3个不同批次样品，按照3.1-3.4含量测定方法进行测定，结果见表7。

表7 三批样品测定结果

本发明的低聚木糖的含量测定方法的方法学实验结果汇总如表8。

表8 方法学实验结果汇总

采用本发明的低聚木糖的含量测定方法对衡欣牌小衡欣粉中低聚木糖测定过程中，可以看出：在专属性实验中，溶剂空白、空白试验在目标峰位置均无无干扰峰，不影响含量测定，专属性良好；在线性试验中，木糖在0.0907mg/mL-0.9072mg/mL范围内，木糖浓度与内标（D-盐酸氨基葡萄糖）浓度比值与木糖峰面积与内标（D-盐酸氨基葡萄糖）峰面积比值线性关系良好，线性回归方程：y = 1.3587x-1.1752；相关系数，R=0.9995；在精密度试验中，6次含量测定结果均值为12.60g/100g，RSD为1.25%，方法含量测定精密度良好；在准确度试验中，在本检测方法下，木糖回收率在96.98%-100.56%范围内，且RSD均小于1.5%，本方法可以准确测定样品中低聚木糖含量；在检出限试验中，信噪比为3:1时，仪器检出限为0.0004mg/mL，当取样量为2g，定容体积为10mL时，方法检出限为1mg/100g；在耐用性实验中，样品连续测定6次相对标准偏差小于1.5%，当改变色谱柱温度、色谱流速时，相对误差均小于1.5%，对含量测定结果无显著性影响，该方法耐用性良好。可见，本发明的低聚木糖的含量测定方法专属性、准确度、精密度、耐用性和线性均良好，并且具有理想的最低检出限，可以满足保健食品中低聚木糖的检测要求。

对比例1

除洗脱梯度如下表以外，其余低聚木糖的含量测定实验过程同实施例1。

对比例1的供试品溶液的色谱图如附图6，可见其D-盐酸氨基葡萄糖的峰形（峰1）和葡萄糖的峰形均不佳，D-盐酸氨基葡萄糖的峰较宽且拖尾，葡萄糖的峰明显与其他组分未有效分离，因此无法准确测定样品中的低聚木糖含量。

对比例2

除流动相B采用乙腈以外，其余其余低聚木糖的含量测定实验过程同实施例1。

对比例2的供试品溶液的色谱图如附图7，可见更换流动相B后，D-盐酸氨基葡萄糖与样品中杂质峰（峰1和峰2）不能达到基线分离，分离度不佳，无法准确测定样品中的低聚木糖。

最后应当说明的是，上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围。