基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明所属生物检测领域，特别是涉及一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法。

背景技术

蛇源隐孢子虫属于顶复门隐孢子虫属， 虽然在其他爬行动物中也能检出，但是其主要感染蛇，寄生于蛇胃组织的上皮细胞。隐孢子虫属在感染宿主后的病症表现具有自限性，病况因宿主不同差异很大。蛇源隐孢子虫在感染蛇后8～28周可在粪便中发现卵囊，通常不表现明显的临床症状，一旦出现躯体中部肿胀、呕吐、厌食和体重减轻等，预后不良，死亡率较高。

近年来，由于观赏性蛇和药用蛇的需求不断加大，并伴随着抽屉式饲养箱的广泛应用，使得人工饲养蛇类的养殖密度和养殖规模均大幅增加。在缺乏相应检疫措施的情况下，蛇隐孢子虫病的发病率也在不断升高。同时，由于蛇源隐孢子虫症状急促，感染后很快发病死亡，给蛇类养殖业造成很大损失，因此，做好蛇隐孢子虫日常监测对于促进蛇类养殖业的健康发展具有重要的现实意义。

研究表明，在蛇样本中，除了蛇源隐孢子虫，还能同时检测到其他隐孢子虫属，如鼠隐孢子虫、泰式隐孢子虫和小隐孢子虫等，这类隐孢子虫可能是在蛇捕获的猎物中感染，通常对蛇不具有致病性，因此，研发一款快速的、特异性好的检测蛇源隐孢子虫的试剂成了防治蛇隐孢子虫感染的关键。

现有技术中，对于隐孢子虫病的诊断方法主要有钡剂造影、胃活检、抗酸染色、免疫荧光染色、血清抗体效价测定和PCR检测等，然而，现有的检测方法耗时长、结果准确性差，更重要的缺陷是不能区分蛇源隐孢子虫种和其他隐孢子虫种。

因此，本领域亟需一种耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高的蛇源隐孢子虫检测试剂及检测方法，为诊断蛇源隐孢子虫提供可靠的实验依据。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-AACTGTTCAAGGTGATATGACAC-3’，如SEQ ID NO:1所示；

反向引物：5’-ATTCCTTTGTCTCACCTAAGTAGAT-3’，如SEQ ID NO:2所示；

探针：5’-CCATTCAAGGTTTGTCGTGGCCCAA-3’，如SEQ ID NO:3所示，所述探针中，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

具体地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中任意一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。

本发明的第二方面，提供一种前述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的探针组合在制备检测蛇源隐孢子虫试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照，所述PCR反应液包括检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合，所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-AACTGTTCAAGGTGATATGACAC-3’，如SEQ ID NO:1所示；

反向引物：5’-ATTCCTTTGTCTCACCTAAGTAGAT-3’，如SEQ ID NO:2所示；

探针：5’-CCATTCAAGGTTTGTCGTGGCCCAA-3’，如SEQ ID NO:3所示，所述探针中，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

具体地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中任意一种，所述BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。

具体地，所述PCR反应液还包括MgCl

具体地，所述酶混合液包括DNA聚合酶和热启动修饰抗体。

具体地，所述正向引物和反向引物的浓度均为0.1-1.0μM，所述探针的浓度为0.3μM。

具体地，所述MgCl

具体地，所述DNA聚合酶的浓度为5-10U/μL，所述热启动修饰抗体的浓度为1-5U/μL。

具体地，所述阳性对照为蛇源隐孢子虫阳性样本，所述阴性对照为超纯水。

本发明的第四方面，提供一种非诊断目的的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的方法，包括步骤：

1）提取待测样本总DNA；

2）制备反应体系，所述反应体系包括前述的引物探针组合、酶混合液、MgCl

3）以提取的待测样本总DNA为模板，同时添加阴性对照、阳性对照为质控模板，进行实时荧光定量PCR反应；

4）反应结束，根据Ct值判定检测结果。

具体地，所述实时荧光定量PCR反应的程序为：

Step1：95℃，5min；

Step2：95℃，10s，57℃，25s；

Step2执行40个循环。

有益效果：

本申请设计出用于实时荧光定量PCR的正逆向引物以及探针，能够快速且准确地检测出待测样本中蛇源隐孢子虫基因，特别适用于检测生物制药原料和产品，灵敏度高、特异性好。

本发明提供的引物探针组合、试剂盒及其检测方法，能够有效区分其他孢子虫与蛇源隐孢子虫，特异性好、实用性高，能够良好应用于蛇类隐孢子虫病的及时检测与防治，对于蛇类养殖产业的健康发展具有重要意义。

附图说明

图1为实施例2中，检测阳性样本的上机结果图。

图2为实施例3中，质粒线性扩增的上机结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例示出一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合，包括正向引物、反向引物和探针，核苷酸序列如下：

正向引物：5’-AACTGTTCAAGGTGATATGACAC-3’，如SEQ ID NO:1所示；

反向引物：5’-ATTCCTTTGTCTCACCTAAGTAGAT-3’，如SEQ ID NO:2所示；

探针：5’-CCATTCAAGGTTTGTCGTGGCCCAA-3’，如SEQ ID NO:3所示。

探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，探针的3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。

本实施例还示出一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照。

其中，PCR反应液包括如上所述的检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合物、0.25μM的正向引物、0.25μM的反向引物、0.3μM的探针、2mM的MgCl

实施例2

本实施例示出使用前述的试剂盒检测蛇源隐孢子虫的方法，步骤如下：

(1)将上述试剂盒中的PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照试剂充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

(2)核算当次实验所需要的反应数(n)，并根据如下表1所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

n＝阴性对照数(1T)+阳性对照数(1T)+误差预留量(1T)+样本数

表1

(3)在无菌离心管中加入上述计算好的PCR反应体系，充分混匀后瞬时离心。按照20μL/孔分装量将试剂分装至PCR管的孔上。

(4)使用商品化核酸提取试剂盒，进行DNA提取，作为待测样本备用。

(5)在步骤(3)制备好的芯片反应样本管中分别加入处理好的待测标本、阳性对照、阴性对照各5 .0μL，使反应终体积为25μL/孔，盖好PCR反应盖，转移到SLAN 96S型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，反应程序为：95℃，5min；95℃，10s，57℃，25s，40个循环；检测荧光选择FAM。

(6)读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。

阳性对照Ct值小于38，阴性对照Ct无数值；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的S型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。

采用本发明提供的方法检测蛇源隐孢子虫时，判断标准如下：

1、检测样本Ct≤38 .0者判为阳性。

2、38 .0＜Ct≤40的检测样本建议重做，重做结果中Ct值<40者为阳性，否则为阴性。

检测结果如图1所示，可以看出，本申请提供的引物探针组合、检测试剂盒及其检测方法能够高效准确地检测出待测样本中的蛇源隐孢子虫，具有所需时间短、检测特异性强，重复性好、灵敏度高的特点。

实施例3：

本实施例提供了一种使用实施例2中试剂盒检测蛇源隐孢子虫的方法来检测试剂的线性扩增，包括以下步骤：

(1)蛇源隐孢子虫阳性质粒的获取：委托上海生工合成。

(2)反应体系配制同实施例2。

(3)阳性质粒梯度稀释：选取2×10

(4)检测结果如附图2(横坐标表示循环数，纵坐标表示相对荧光强度)所示，结果显示质粒的各个浓度与Ct值间呈线性关系，质粒浓度相差10倍，Ct值相差3.3，与理论值相符。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。