一种藤茶细胞培养生产香气物质的方法及香气捕集系统

技术领域

本发明属于植物细胞培养技术领域，具体涉及一种藤茶细胞培养生产香气物质的方法及香气捕集系统。

背景技术

香精香料广泛应用于食品、化妆品和药品等领域，市场需求巨大且增长迅速。目前，香精香料的生产方法主要有天然原料提取法和人工合成法。天然原料提取法历史悠久，产品品质优良、安全性好，消费者认可度高，但其发展受天然原料供应的限制；化学合成法成本低，自动化程度高，但对生产设备的要求较高，且对环境不友好，消费者因安全健康方面的考虑对该法所生产产品的认可度还不是很高。从当前的情况来看，天然原料提取是获取香精香料的主要方式。

植物是香精香料生产的主要原料之一，全世界约有芳香植物3300余种，已开发利用的有200种左右。虽然天然芳香植物的种类多、分布广，但其生长周期较长，依赖于自然条件，且受环境和病虫害的影响较大；同时，由于植物生长自身的特点，很难在短时间内大幅度提高产量。因此，天然原料资源将成为制约香精香料行业发展的重要因素。

而植物细胞培养具有生长周期短、可控性强、受自然环境影响小、目标物易于提取和纯化等诸多优点。但是从当前的情况来看，植物香气物质合成和积累的理论与技术绝大部分是建立在整体植株或植物某一器官(如花、果实、种子、叶、根、茎等)基础之上的，关于植物细胞悬浮培养生产香气物质方面的研究非常少，相关理论和技术都非常缺乏，尤其是缺乏性状优良的“悬浮培养细胞系”，“种源”是植物细胞培养工程化生产香气物质领域急需解决的关键问题。目前植物细胞培养工程化生产香气物质方面的研究和应用还很少，相关的技术和设备非常缺乏，与细胞培养相配套的“香气捕集设备”还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种藤茶细胞培养生产香气物质的方法及香气捕集系统，通过长期的诱导和筛选，获得了独特的产香藤茶愈伤系，在此基础上建立了稳定的细胞悬浮培养合成香气物质技术的体系，同时设计并自制了“藤茶细胞培养偶联香气物质捕集系统”，建立了相应的香气捕集技术体系，可为植物细胞培养生产香料替代天然原料资源提取香料提供依据，节省自然资源。

为实现上述目的，本发明先提供一种藤茶细胞培养生产香气物质的方法，包括以下步骤：

(1)藤茶产香愈伤组织的诱导和选育：取藤茶的幼叶和幼茎进行预处理后得到外植体，然后接种到诱导培养基中进行愈伤诱导培养，将诱导出的愈伤组织在全程光照下进行继代培养，以愈伤的生长速度和产香能力为主要评价指标进行培养和筛选，获得性状优良的产香愈伤系；

(2)产香藤茶细胞悬浮培养体系的建立及优良细胞系的选育：取产香愈伤系接种于悬浮培养液中，振荡悬浮培养，每4-8d继代培养一次，以细胞的生长速度和产香能力为主要评价指标进行继代培养和筛选，获得生长和性状稳定的悬浮培养细胞系；

(3)产香藤茶细胞发酵罐培养体系的建立及香气物质的获得：取悬浮培养细胞系接种到装有培养液的气升式发酵罐中进行培养，连续搅拌培养7-9d后，采用香气物质捕集系统进行香气物质捕集，之后用乙醇溶剂进行洗脱、旋蒸，或采用高温蒸汽脱吸附，得到香精油。

进一步地，上述技术方案步骤(1)中，藤茶幼叶和幼茎的预处理方法为：选取藤茶的幼叶和幼茎，进行修整，然后用流水冲洗20-60min，擦干表面水分；在无菌工作台上，将叶片浸没于75％的酒精中消毒15-60s；酒精消毒之后立即放入无菌水中涮洗2-6次，再将其浸没于0.1％的氯化汞水溶液中灭菌4-10min，取出后在无菌水中淘洗5-6次，叶片剪去边缘并剪成5mm×5mm的片段，茎剪成0.5-4cm的茎段，即得叶片外植体和茎段外植体。

进一步地，上述技术方案步骤(1)中，所述诱导培养基以MS为基础培养基，还添加2.0mg/L 2,4–D和30g/L蔗糖；诱导培养条件为：温度为28±2℃；避光，进行暗培养；空气相对湿度为40％-60％；继代培养过程中，除了光照条件，其它培养条件与诱导培养条件相同。

进一步地，上述技术方案步骤(2)中，所述悬浮培养液以MS为基础培养基，还添加1.0mg/L KT、0.5mg/L 2,4-D、0.3mg/L NAA和30g/L蔗糖，pH为5.8±0.4，培养温度为28±2℃，振荡转速为100-140rpm。

进一步地，上述技术方案步骤(2)中，继代培养的方法为：将待继代的细胞培养物与新鲜培养液按1:1(V/V)的比例混合，之后一分为二，分别进行培养。

进一步地，上述技术方案，步骤(1)和步骤(2)中，产香能力的鉴定方法均为：称取5g产香愈伤组织或悬浮培养细胞，放入到10mL顶空瓶中，再加入1.6g的NaCl和10μL的内标物癸酸乙酯，拧紧瓶盖密封，然后采用“顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用”技术检测香气成分，根据内标法计算所检出香气物质的含量。

进一步地，上述技术方案步骤(3)中，悬浮培养细胞系与培养液的重量(鲜重)体积比W/V为5-25％。

进一步地，上述技术方案步骤(3)中，所述培养液以MS为基础培养基，还添加1.0mg/L KT、0.5mg/L 2,4-D、0.3mg/L NAA和30g/L蔗糖，pH为5.8±0.4，培养温度为28±2℃，通气量为1L/min，搅拌转速为100rpm。

本发明还提供一种用于捕集上述的藤茶细胞发酵罐培养生产香气物质的香气捕集系统，所述香气捕集系统包括5个组成部分，依次串联为空气压缩机、气体流量调控器、空气过滤除菌器、生物发酵罐、香气捕集器；所述生物发酵罐包括气升式和/或搅拌式细胞培养器和温控系统，所述细胞培养器通气口设在底部、中部或上部，为单口、两口、多口或分散的通气口，所述温控系统采用水套式或通气式对生物发酵罐进行控温；所述香气捕集器由多级捕集吸附罐组成，其填料为大孔树脂、活性炭、液体吸附剂中的任一种，使用时，可采用单级吸附、两级吸附或多级吸附。具体地，液体吸附剂可以是正己烷、乙醇等有机溶剂。

本发明还提供一种由上述的方法制备的香气物质的应用，将香气物质加工成微胶囊固体香精或乳化香精，用于果汁、果泥、果酱产品中。

具体地，香精油加工成微胶囊固体香精时，其制备方法为：以阿拉伯胶(25％)、糊精(27％)和玉米糖浆(48％)为壁材，香精油为芯材，其中芯材用量为壁材总重量的40％，进行乳化，乳化后均质，再经喷雾干燥制得微胶囊固体香精。

香精油加工成乳化香精时，按照香精油6％、吐温-80 2.5％、聚甘油酯类4.5％、助乳化剂(乙醇与甘油体积比1︰1)62％、NaCl 0.4％，用去离子水加至100％进行配比。其制备方法为：将上述原料混合后，油相和水相通过高速搅拌制得粗乳液，粗乳液进行高速剪切，再经两次高压均质(第一次压力0.3MPa-0.4MPa，第二次压力1.6MPa-3.0MPa)，获得粒径小于2μm的乳化香精。

本发明具有的有益效果是：

本发明首次提供了“藤茶细胞悬浮培养生产香气物质”的完整技术方案，为解决“资源制约发展”这一难题提供了思路、方法和技术；通过长期的诱导、筛选和培育，获得了性状优良的产香藤茶愈伤系和悬浮培养细胞系，为植物细胞培养生产香气物质提供了优质“种源”；基于藤茶悬浮培养细胞的生长和产香特征，设计了“细胞培养偶联香气捕集”方案，并自制了藤茶细胞培养偶联香气捕集系统，建立了“细胞培养偶联香气捕集”技术体系，为天然原料提取香精香料提供替代方案，节省了自然资源。

本发明方法制备的香气物质种类多，含量高，可进一步加工成微胶囊固体香精或乳化香精，用于果汁、果泥、果酱等产品的调香，可显著提升其香味品质。

附图说明

图1为本发明实施例1中藤茶产香愈伤组织的诱导和选育的工艺流程图；

图2为本发明实施例1中所得性状优良的藤茶产香愈伤系图；

图3为本发明实施例2中产香藤茶细胞悬浮培养体系的建立及优良细胞系的选育的工艺流程图；

图4为本发明实施例2中性状优良的产香藤茶悬浮培养细胞系图；

图5为本发明实施例3中藤茶细胞悬浮培养偶联香气捕集系统示意图。

其中，①空气压缩机；②气体流量调控器；③空气过滤除菌器；④生物发酵罐；⑤香气捕集器。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的原料若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述：

本发明试验所用藤茶的幼叶和幼茎来源于江西农业大学食品科学与工程学院；

所使用的MS基础培养基配方由1900mg/L硝酸钾、332.2mg/L氯化钙、1650mg/L硝酸铵、180.7mg/L硫酸镁、170mg/L磷酸二氢钾、0.025mg/L

实施例1：产香藤茶愈伤组织的诱导和选育

产香藤茶愈伤组织的诱导和选育的工艺流程图如图1所示。

(1)外植体的制备：选取藤茶的幼叶和幼茎，进行适当的修整，然后以流水冲洗20-60min，擦干表面水分；在无菌工作台上，将叶片浸没于75％的酒精中消毒15-60s；酒精消毒之后立即放入无菌水中涮洗2-6次，再将其浸没于0.1％的氯化汞水溶液中灭菌4-10min，立即取出在无菌水中淘洗5-6次；剪去叶片边缘，并将其剪成约5mm×5mm的片状，而茎段则剪成1cm左右，制成相应的叶片外植体和茎段外植体。

(2)愈伤组织的诱导：将制备好的叶片和茎段外植体滤干水分，接种在含2.0mg/L2,4–D和30g/L蔗糖的MS培养基中进行愈伤诱导。培养条件为：温度为28±1℃；光照条件为避光，进行暗培养；空气相对湿度为40％-60％。

(3)愈伤组织的继代培养：将诱导出的各种表型的愈伤组织挑取出来，在全程光照下进行不断的继代培养，继代培养基和其它培养条件与上述愈伤组织的诱导的条件相同。

(4)优良的产香愈伤组织的选育：以愈伤的生长速度(以愈伤组织生物量的增长量(干重和湿重)作为评价指标)和产香能力(主要以感官评价为主，结合GC-MS检测)为主要评价指标，通过不断的继代培养和筛选，获得了性状优良的产香愈伤系，如图2所示。从图2可以看出，愈伤组织淡黄色，组织较软，生长状况良好。

(5)愈伤香气成分的鉴定：称取5g新鲜的产香藤茶愈伤组织，放入体积为10mL的顶空瓶中，再加入1.6g的NaCl和10μL的内标物癸酸乙酯，立即拧紧瓶盖密封。采用“顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HSSPME-GC/Q-TOF)”技术进行了香气成分的检测，从中鉴定出了18种香气成分，其中以己醛、己醇、苯甲醇的含量较高，分别达到了303.58mg/L、102.82mg/L和374.41mg/L。

实施例2：产香藤茶细胞悬浮培养体系的建立及优良细胞系的选育

产香藤茶细胞悬浮培养体系的建立及优良细胞系的选育的具体工艺流程图如图3所示。

(1)产香藤茶细胞悬浮培养体系的建立：取实施例1所得的新鲜的优良产香藤茶愈伤系组织4-12g，接种于40mL培养液中进行振荡悬浮培养。

悬浮培养液的主要成分如下：MS培养基，添加1.0mg/L KT、0.5mg/L 2,4-D、0.3mg/L NAA和30g/L蔗糖。主要培养条件如下：pH值为5.8±0.4，温度为28±2℃，转速100-140rpm(转/分钟)。每4-8d继代培养一次(周期视细胞生长情况而定)，直至获得生长和性状稳定的悬浮培养细胞系。其中，继代培养的方法为：将待继代的细胞培养物与新鲜培养液按1:1(V/V)的比例混合，之后一分为二，分别进行培养。

(2)优良的产香藤茶悬浮培养细胞系的选育：以细胞的生长速度(以细胞生物量的增长量(干重和湿重)作为评价指标)和产香能力(主要以感官评价为主，结合GC-MS检测)为主要评价指标，通过不断的继代培养和筛选，获得了性状优良的产香藤茶悬浮培养细胞系，如图4所示，该细胞系呈淡黄色，细胞颗粒均匀，带有浓郁水果香气。

(3)藤茶悬浮培养细胞香气成分的鉴定：称取5g新鲜的产香藤茶悬浮培养细胞系，放入体积为10mL的顶空瓶中，再加入1.6g的NaCl和10μL的内标物，立即拧紧瓶盖密封。采用“顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HSSPME-GC×GC/Q-TOF)”技术进行了香气成分的检测，从中鉴定出了203种香气成分，包括32种醇类物质、22种醛类物质、9种羧酸类物质、45种酯类物质、13种酮类物质、44种烃类物质、38种其他类物质。从相对浓度来看，醇、醛和酯类物质的总浓度相对较高，如1-戊醇、苯甲醇、异戊醇、1-己醇、反式-2-己烯-1-醇、己醛、2,4-壬二烯醛、苯甲醛、苯乙醛、2-己烯醛、异丁酸乙酯、苯甲酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、丁酸乙酯、(2Z)-丁-2-烯酸乙酯、2-羟基-3-甲基-丁酸乙酯的相对浓度均大于0.2％，其中己醛的相对浓度是所有物质中最高的，达到5.788％；而烷烃类物质以及其他类物质虽然种类丰富，但各物质相对浓度整体偏低。上述检测数据表明，藤茶悬浮培养细胞中醇、醛和酯类物质对香气的贡献比较大。

实施例3：藤茶细胞悬浮培养偶联香气捕集系统的设计

基于藤茶悬浮培养细胞的生长和产香特征，设计了“细胞悬浮培养偶联香气捕集系统”，该系统主要包括以下5个组成部分(如图5所示)依次串联为①空气压缩机；②气体流量调控器；③空气过滤除菌器；④生物发酵罐；⑤香气捕集器。其中，空气压缩机和气体流量调控器组成了通气系统，该通气系统可视实际需要设定气体流量，调控通气量。空气过滤除菌器为空气除菌系统，开启后达到无菌培养要求后，可持续工作20天。生物发酵罐有包括气升式和/或搅拌式细胞培养器和温控系统，为一个整体，其中气升式和/或搅拌式细胞培养器通气口可设在底部、中部或上部，可单口、两口、多口或分散通气；温控系统可采用水套式或通气式对生物发酵罐进行控温，也可通过控制环境温度来控制细胞培养器内的温度。香气捕集器为香气物质捕集系统，由多级捕集吸附罐组成，其填料采用大孔树脂、活性炭、有机溶剂等材料，使用时，可采用单级吸附、两级吸附或多级吸附通过吸附的方式进行动态香气物质捕集。

实施例4：产香藤茶细胞发酵罐培养体系的建立及香其物质的获得

(1)藤茶细胞悬浮培养：取实施例2新鲜、待继代的优良产香藤茶悬浮培养细胞系，按5-25％的比例(细胞鲜重/培养基体积，W/V)进行接种，之后采用气升式发酵罐进行培养，培养过程中进行连续的搅拌。

培养液的主要成分如下：MS培养基，还添加1.0mg/L KT、0.5mg/L 2,4-D、0.3mg/LNAA和30g/L蔗糖。主要培养条件如下：pH值为5.8±0.4，温度为28±2℃，通气量为1L/min，转子转速100rpm。在上述培养条件下，第9天时细胞的鲜重达到了278.50g/L，可进行香气物质捕集。

(2)香气物质捕集：以大孔树脂或活性炭吸附的方式进行香气物质捕集，捕集时可采用一种吸附剂通过单级、两级或多级吸附的方式进行吸附，也可采用两种吸附剂组合进行两级或多级吸附。

在本实施例中，培养罐中细胞培养物体积为800mL，通气量为1L/min，采用HPD-100大孔树脂进行单级吸附，捕集时间为30min，以乙醇进行洗脱，洗脱液浓缩到5mL，以GC-MS进行检测。经检测，从中鉴定出了4-乙基苯甲醛、对乙基苯乙酮、苯乙酮、月桂醇、3-羟基丁酸乙酯、苯甲醛、壬醛、4-异丙基苯甲醇、苯甲醇、异戊醇、1-己醇、己醛、2,4-壬二烯醛、苯乙醛、2-己烯醛、苯甲酸乙酯、异戊酸乙酯、丁酸乙酯等香气物质196种；按照面积归一法，其中4-乙基苯甲醛、对乙基苯乙酮、苯乙酮、月桂醇、3-羟基丁酸乙酯分别达到了2.74％、1.31％、1.04％、0.68％、0.37％。

实施例5：藤茶悬浮培养细胞香气物质的应用

采用自组装的“细胞悬浮培养偶联香气捕集系统”进行香气物质收集，经乙醇洗脱后进进旋转蒸发，将乙醇挥干，制得香精油。香精油进一步加工成微胶囊固体香精或乳化香精，用于果汁、果泥、果酱等产品的调香，可显著提升其香味品质。

其中，微胶囊固体香精的制备方法为：以阿拉伯胶(25％)、糊精(27％)和玉米糖浆(48％)为壁材，以香精油为芯材，芯材的添加量为壁材总重量的40％，然后进行乳化，乳化后均质，再经喷雾干燥制得微胶囊固体香精。

乳化香精的制备方法为：

配方：香精油6％；吐温-80 2.5％；聚甘油酯类4.5％；助乳化剂(乙醇与甘油体积比1︰1)62％；NaCl添加质量分数：0.4％，以去离子水加至100％。

制备方法：将上述原料混合后，油相和水相通过高速搅拌制得粗乳液，粗乳液进行高速剪切，再经两次高压均质，其中第一次压力为0.3MPa-0.4MPa，第二次压力1.6MPa-3.0MPa，获得粒径小于2μm的乳化香精。

综合上述分析，本发明通过诱导和筛选，获得了独特的产香藤茶愈伤系，在此基础上建立了稳定的细胞悬浮培养合成香气物质技术体系，同时设计并自制了“藤茶细胞培养偶联香气捕集系统”，建立了相应的香气捕集技术体系，可为植物细胞培养生产香精香料替代天然原料资源制备香精香料提供依据，节省自然资源；本发明制备的香气物质种类多，含量高，可进一步加工成微胶囊固体香精或乳化香精，用于果汁、果泥、果酱等产品的调香，可显著提升其香味品质。

最后需要强调的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种变化和更改，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。