一种预防禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，特别涉及一种预防禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗及其制备方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，可感染多种禽类，如鸡、火鸡、鸭和鹅等，并与多种疾病有关，感染途径为肠道或呼吸道。主要包括病毒性关节炎/腱鞘炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病、免疫抑制和吸收不良综合征等。感染引起的病症很大程度上取决于宿主年龄、免疫状态、病毒的敏病型及感染途径。

目前商业化的只有灭活疫苗和全病毒活疫苗，尽管如CN103642758A、CN107384942A、CN111349179A等文献也提出了一些禽呼肠孤病毒基因工程亚单位疫苗的设计思路，但其中大多为单独表达sigma B蛋白或sigma C蛋白以及混合表达sigma B/sigmaC蛋白作为疫苗，虽然sigma B、sigma C等蛋白具有较好的保护效果，但这类疫苗具有较强剂量依赖性，即免疫保护效果与疫苗中的抗原添加量成正比，通常这类疫苗中的抗原浓度不低于200μg/mL，并且免疫保护产生期较长，通常需要免疫后3-4周才能产生保护或者需要两次免疫才能达到免疫保护效果。因而，研发一种免疫效果好，抗原添加量低、免疫保护产生期短疫苗是禽呼肠孤蛋白类疫苗研发成功的关键。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种预防禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗及其制备方法。该疫苗组合物生产成本低、生产效率高且免疫效果好。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述融合蛋白的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的提供含有所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的提供一种用于预防禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗，所述病毒样颗粒疫苗包括上述融合蛋白。

在一种实施方式中，所述融合蛋白经过BEI灭活。

在一种实施方式中，所述融合蛋白的含量为5～10μg/mL。

在一种实施方式中，所述融合蛋白的含量为7.5μg/mL。

在一种实施方式中，所述病毒样颗粒疫苗中还包括佐剂。

在一种实施方式中，所述佐剂为油相佐剂。

在一种实施方式中，所述油相佐剂包括兽用白油、硬脂酸铝和司本80。

本发明还提供了一种制备所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将编码上述融合蛋白的基因连接至pFastBac I载体，得到转移载体ReoBac；

(2)将步骤(1)得到的转移载体ReoBac转化DH10 Bac感受态细胞，通过转座，获得重组杆粒rBacmid-ReoBac；

(3)将步骤(3)获得的重组杆粒rBacmid-ReoBac转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒rReoBac；

(4)将步骤(3)获得的重组杆状病毒rReoBac接种昆虫细胞进行培养，离心收集培养液上清，得到上述融合蛋白。

本发明还提供了上述融合蛋白或上述基因或上述表达载体或上述预防禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗在制备预防和/或治疗禽呼肠孤病毒病或由禽呼肠孤病毒感染的相关疾病的药物中的应用。

有益效果：

本发明的禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗，采用了sigma C-ft重组蛋白，其免疫效果良好，在免疫后14天就可以起到有效保护作用，相比现有的禽呼肠孤病毒疫苗需要免疫后3-4周才能起到保护作用，本发明提供的疫苗可以显著缩短免疫空白期，提高动物生存率；并且免疫剂量小，制备的疫苗中融合蛋白的含量仅为5～10μg/mL，少量融合蛋白就可以起到免疫保护的作用；无需进行二次免疫，一次免疫就可以实现攻毒保护率100％。因此，本发明制备的疫苗能有效预防禽呼肠孤病毒病或由禽呼肠孤病毒感染相关疾病。

本发明的制备方法简单，能大量制备禽呼肠孤病毒的抗原蛋白，耗时短，表达量高，大大降低了生产成本，有利于大规模生产。

附图说明

图1是SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物，泳道1：Sigma C-ft；泳道2：对照。

图2是sigma C-ft重组蛋白电镜结果。

具体实施方式

实施例1：重组杆状病毒的构建

1、转移载体构建：将含有禽呼肠孤病毒结构域基因的融合蛋白sigma C-ft(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)委托无锡赛索菲生物进行基因合成以及转移载体的构建，将融合蛋白sigma C-ft构建至pFastBac I载体的BamH I和Hind III酶切位点，将转移载体命名为ReoBac。

2、重组杆状病毒构建：将合成的转移载体ReoBac转入大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞中，涂布于LB(含氨苄青霉素抗性)固体培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆用M13引物作PCR鉴定。

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC

PCR反应体系为(总体积25μL)：DNA模板0.5μL、M13-F和M13-R个0.5μL、DNA聚合酶12.5μL及无菌水11μL。PCR反应条件为：93℃，5min；94℃30s，55℃45s，72℃5min，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶电泳显示，成功扩增出约3000-5000bp的特异性条带，与预期大小相符。阳性重组杆粒命名为rBacmid-ReoBac。

3、重组杆粒转染sf9细胞：用脂质体转染的方法将重组杆粒rBacmid-ReoBac转染sf9细胞，具体操作方法参照赛默飞世尔科技(中国)有限公司的cellfectin转染试剂说明书进行，获得f1代重组杆状病毒rReoBac。

实施例2：重组蛋白的制备

1、重组杆状病毒扩增：将实施例1制备的f1代重组杆状病毒rReoBac接种昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得f2代重组杆状病毒；

2、表达蛋白鉴定：

(1)将上述f2代重组杆状病毒以MOI＝5～10的接种量接入昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得重组蛋白sigmaC-ft；

(2)SDS-PAGE鉴定：将步骤(1)所述上清液进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，重组蛋白sigmaC-ft样品条带位于42kDa处。电泳结果条带大小均与目标蛋白理论分子量大小一致，证明蛋白表达成功(图1)。

(3)蛋白纯化：将收获的重组蛋白使用嘉兴千纯生物科技有限公司Ni-TED Purose6Fast Flow(货号：A42302)填料进行亲和层析，纯化后蛋白质使用BCA方法进行蛋白定量，含量为1mg/mL。

(3)电镜检测：将纯化后的蛋白样品委托扬州大学测试中心进行电镜检测(图2)，使用仪器为透射电子显微镜(型号：Tecnai 12)。

实施例3：疫苗制备

1、灭活：将实施例2中制备的sigmaC-ft重组蛋白加入到灭活罐中，加入终浓度为0.2％～0.5％灭活剂BEI，于37℃灭活24h。

2、半成品检验

(1)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)蛋白含量测定：按BCA法检测蛋白含量。

(3)灭活检验：将灭活后的蛋白液取昆虫细胞sf9，置于27℃继续培养72小时。观察无病变出现，判定灭活检验合格。

3、疫苗制备：

经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持，冷却后备用。

(2)水相制备：使用生理盐水将步骤1灭活的重组蛋白sigmaC-ft分别稀释成15μg/mL、22.5μg/mL、30μg/mL。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化：取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000rpm乳化5分钟。乳化后，取10mL，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应不超过0.5mL。

实施例4：疫苗成品检验

1、性状

外观：疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格；

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均应不扩散。

稳定性：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出水相应不超过0.5mL。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

2、装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4、安全检验：

禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗，批号分别为rReo-001P(疫苗中蛋白含量5μg/ml)、rReo-002P(疫苗中蛋白含量7.5μg/ml)、rReo-003P(疫苗中蛋白含量10μg/ml)共3批。

取3-4周龄的SPF鸡30只，每只颈部皮下注射疫苗0.5mL，观察14日内试验鸡有无局部或全身明显不良反应。

5、效力检验：

5.1分组及攻毒取3-4周龄SPF鸡120只，随机均分为A-D四组，每组30只。A、B、C组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.1mL，D组为非免疫攻毒对照。免疫后14日、21日和28日分别用强毒株进行攻毒，观察7日内试验鸡发病和死亡情况。

5.2效力检验结果取3-4周龄SPF鸡120只，随机均分为A-D四组，每组30只。A、B、C组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.1mL，D组为非免疫攻毒对照。免疫后14日、21日和28日分别用强毒株(REO YB株，由扬州优邦生物药品有限公司分离、保存)进行攻毒(攻毒剂量为2000EID

表1禽呼肠孤病毒的病毒样颗粒疫苗效力检验结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。