一种筛选紧密结合过渡态金属离子的方法

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种筛选方法的建立以及通过该方法筛选得到的紧密结合锌离子的DNA和紧密结合镉离子的DNA。

背景技术

金属离子在各类生化反应中都有着重要作用，因此，金属传感是非常重要的研究领域。核酸分子，特别是DNA，具有稳定性好、成本低廉以及带有负电荷等特性。这些特性让DNA成为金属传感的最佳生物材料。通过SELEX技术即指数富集的配体系统计划技术，从随机单链核酸序列库筛选出特异性与靶标物高度亲和的核酸分子，这类核酸分子通常称为适配体。但金属离子由于固相固定困难，所以很难筛选对应的适配体。目前，已经有研究人员通过直接筛选或者变构筛选的方法，获得了特异性结合某些过渡态金属离子(例如锌离子、铅离子和镉离子等)的适配体。但这些适配体的特异性不佳，并且亲和力不强，几乎无法进行后续的应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一筛选紧密结合过渡态金属离子的适配体DNA的方法，所述方法包括筛选ssDNA片段、洗脱ssDNA和PCR扩增获得步骤。

在某些实施方式中，所述筛选包括将ssDNA文库与含过渡态金属离子的缓冲液孵育，通过dPAGE回收发生条带迁移的ssDNA片段。

在某些实施方式中，所述洗脱包括对dPAGE中发生条带迁移的区域进行胶回收，洗脱，沉降获得特定ssDNA。

在某些实施方式中，所述PCR扩增包括以回收得到的ssDNA作为模板，利用PCR反应进行扩增。

在某些实施方式中，所述过渡态金属离子选自二价锌离子或二价镉离子。

在某些实施方式中，所述PCR反应扩增紧密结合锌离子的DNA的引物如SEQ ID NO：1-2所示，所述PCR反应扩增紧密结合镉离子DNA的引物序列如SEQ ID NO：3-4所示。

本发明第二方面提供了根据本发明第一方面所述的方法获得的紧密结合过渡态金属离子的适配体DNA。

在某些实施方式中，所述适配体DNA包含如SEQ ID NO：5-10所示的核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：5-10具有至少80％，85％，90％，95％，99％同一性且能够紧密结合二价锌离子或二价镉离子的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了紧密结合二价锌离子的适配体DNA，所述DNA包含如SEQ IDNO：5-8所示的核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：5-8具有至少80％，85％，90％，95％，99％同一性且能够紧密结合二价锌离子的核苷酸序列。

本发明第四方面提供了紧密结合二价镉离子的适配体DNA，所述DNA包含如SEQ IDNO：9-10所示的核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：9-10具有至少80％，85％，90％，95％，99％同一性且能够紧密结合二价镉离子的核苷酸序列。

本发明第五方面提供了第二、三、四方面所述的适配体DNA联合二价锌在制备诱导细胞凋亡试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明开发了基于迁移速率的SELEX策略，无需任何固定相，即不需要将靶标过渡态金属离子固定，也无需将所用筛选的DNA文库进行固定，可以直接分离和鉴定紧密结合过渡态金属离子的DNA。这种方法大大降低了筛选难度(不需要进行固定相合成)和筛选成本(只需要电泳设备)。据推测，与过渡态金属离子紧密结合能够诱导dPAGE(8M尿素)中DNA的迁移率变化，从而直接从ssDNA序列库中分离过度态金属离子结合的DNA。通过体外平行筛选，得到了紧密结合锌离子的两类DNA(Zn(II)-MZ1a和Zn(II)-MZ2a)和紧密结合镉离子的一类DNA(Cd(II)-TX1a)。筛选得到的DNA，例如Zn(II)-MZ1a，可以在体外锌离子浓度较低的情况下，携带大量锌离子，而Zn(II)-MZ1a与sgc8c形成双DNA系统后，可以携带大量锌离子进入特定细胞，从而诱导特定细胞的凋亡。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

图1显示基于迁移速率的SELEX策略进行紧密结合过渡态金属离子DNA筛选的策略示意图。

图2显示Zn(II)-MZ1a、Zn(II)-MZ2a以及Cd(II)-TX1a结合率测试。

图3显示Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a离子特异性及拮抗EDTA测试。图3A，离子特异性测试；图3B,拮抗EDTA测试。

图4显示Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a pH依赖性及靶标离子浓度依赖性测试。图4A，pH依赖性测试；图4B，靶标离子浓度依赖性测试。

图5显示Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a镁离子依赖性和温度依赖性测试。图5A，镁离子依赖性测试；图5B，温度依赖性测试。

图6显示透射电镜表征离子特异性吸附测试。

图7显示双DNA系统增强锌离子对细胞毒性测试。图7A，为双DNA系统的预测二级结构以及用琼脂胶电泳表征的结果；图7B，为双DNA系统对靶标CCRF-CEM细胞毒性测试的流式图，IC

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1筛选方法的建立

体外筛选流程，如图1所示。本发明建立的筛选方法采用指数富集的配体系统进化技术，在体外分为筛选、洗脱和PCR扩增等步骤。

将ssDNA(由生工生物工程(上海)有限公司合成)在25μL的缓冲液1(见表1)中70℃变性5min，室温放置5min后加入等体积的缓冲液2(下表1)，37℃下孵育1h，通过12.5％dPAGE回收发生条带迁移的ssDNA片段(之后的筛选体系为25μL+25μL)。在第一轮筛选(G0)时，将样品条带电泳至胶的中间区域。条带上方区域命名为A区域，此区域回收的迁移条带在之后的筛选中独立作为pool-A，并且只回收迁移至A区域的条带。条带下方区域命名为B区域，此区域回收的迁移条带在之后的筛选中独立作为pool-B，并且只回收迁移至B区域的条带。

表1缓冲液配方

将特定区域内的胶割下碾碎，在洗脱溶液中，4℃过夜洗脱，之后做乙醇沉降回收ssDNA。

将回收得到的ssDNA作为模板，利用PCR反应进行扩增，反应体系如下表2。

表2PCR反应体系

锌离子引物序列如SEQ ID NO：1-2所示：

Primer 1：5’-GACATCACTGCGACTCA，SEQ ID NO：1

Primer 2：5’-ACTCGATTAGCGACTCrC，SEQ ID NO：2

镉离子引物序列如SEQ ID NO：3-4所示：

Primer 1：5’-ACGTCGTATCGAGATAGC，SEQ ID NO：3

Primer 2：5’-CGTAGTCAGTGACCGAArT，SEQ ID NO：4

PCR反应条件：

95℃预变性3min，之后每个循环95℃变性20s，54℃退火20s，72℃延伸6s，扩增30个循环；最后72℃终延伸1min。

PCR后的产物通过12.5％dPAGE分离纯化出正义ssDNA，在dPAGE胶上只出现两个条带，较长的条带即为需要回收的正义ssDNA。

注：反向引物3’修饰核糖核苷酸C(rC)或者核糖核苷酸T(rT)，可以通过NaOH处理PCR产物，使得修饰RNA的链在rC或者rT处断裂，形成两条长度不同的单链DNA链。随后通过12.5％dPAGE分离纯化出正义ssDNA(无RNA修饰的DNA链)。

重复筛选过程，每次筛选后，独立回收上述的A区域和B区域，直到所回收区域出现明显条带信号后，停止筛选。例如pool-A的A区域出现了条带(不出现在A区域的条带不予回收)，pool-B的B区域出现了条带(不出现在B区域的其他条带不予回收)。将A区域或B区域出现的条带回收，进行PCR扩增后，送去上海华津生物科技有限公司进行测序。

选择测序结果中，重复度高的序列，由生工生物工程(上海)有限公司合成，使用12.5％dPAGE纯化目标序列，再与筛选溶液孵育，最后在12.5％dPAGE上表征，观察结合的迁移条带。另外，更短的适配体可以降低合成成本，所以对原始序列进行截短，以获得最优序列。本发明筛选获得Zn(II)-MZ、Zn(II)-MZ2、Cd(II)-TX1，在上述序列的基础上进行截短优化，进一步获得Zn(II)-MZ1a、Zn(II)-MZ2a和Cd(II)-TX1a，具体序列如下表3所示。

表3本发明筛选和优化获得的二价锌和二价镉适配体DNA

实施例2结合率测试

将Zn(II)-MZ1a、Zn(II)-MZ2a和Cd(II)-TX1a在最优筛选缓冲液条件下(Zn(II)-MZ1a、Zn(II)-MZ2a在50mM HEPES pH 7.0、100mM LiCl、5mM MgCl

实施例3离子特异性测试和拮抗EDTA测试

选取与锌离子结合率较高的Zn(II)-MZ1a以及与镉离子结合率较高的Cd(II)-TX1a进行后续分析。将Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a分别与其他2mM的二价阳离子进行孵育，比较结合条带迁移的离子特异性。结果如图3A所示，可见，Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a离子特异性良好，都只与靶标金属离子结合，不与其他过渡态金属离子结合。

将与离子完成结合后的Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a样品，分别与一系列不同浓度(0mM、5mM、10mM、20mM和50mM)的EDTA缓冲液37℃孵育10分钟，用dPAGE胶比较EDTA孵育后，对结合率的影响。结果如图3B所示，Zn(II)-MZ1a与锌离子结合后，EDTA浓度对其结合率影响不大，即使是50mM的EDTA，Zn(II)-MZ1a与锌离子依然维持大于60％的结合率；Cd(II)-TX1a与镉离子结合后，EDTA浓度对其结合率影响不大，即使是50mM的EDTA，Cd(II)-TX1a与镉离子依然维持大于50％的结合率。

实施例4pH依赖性和靶标离子浓度依赖性测试

配制对应靶标离子的一系列pH梯度的筛选缓冲液1和2，如图4A所示，锌离子筛选缓冲液pH梯度为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1以及7.2；镉离子筛选缓冲液pH梯度为7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3以及8.4。分别与对应的Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a在37℃孵育1小时。其图4A代表两类紧密结合的DNA在dPAGE胶上条带迁移量随pH的变化而变化。

改变对应靶标离子的终浓度，图4B代表其离子浓度对结合率的影响。结果表明，Zn(II)-MZ1a在低浓度(0.1mM、0.3mM和0.5mM)的锌离子条件下，结合率下降，小于40％，在1mM、1.5mM以及2mM锌离子条件下，仍有大于60％的结合率；Cd(II)-TX1a在低浓度(0.3mM和0.5mM)的镉离子条件下，结合率下降，小于40％，在1mM、1.5mM以及2mM镉离子条件下，仍有大于50％的结合率。

实施例5镁离子浓度依赖性和温度依赖性测试

改变筛选缓冲液中镁离子浓度(0mM、2mM、5mM、10mM以及20mM的MgCl

将Zn(II)-MZ1a和Cd(II)-TX1a在各自最优缓冲液条件下(同实例2)，于不同温度(16℃、22℃、30℃、37℃、45℃和50℃)孵育1小时。其结果如图5B所示，结果表明，Zn(II)-MZ1a在16℃～37℃结合率不受影响，在45℃和55℃时，结合率下降，但仍有40％左右结合率；Cd(II)-TX1a在37℃为最佳结合温度，较低和较高的温度，都会引起结合率的下降。

实施例6扫描透射电镜分析离子吸附能力

将Zn(II)-MZ1a或Cd(II)-TX1a序列作为环状模板，利用滚环扩增技术(RCA)，制备纳米花样品。将表4中的磷酸化修饰的DNA模版(Circ Zn(II)-MZ1atemp和Circ Cd(II)-TX1a temp)，使用CircLigase(购自西格玛公司)于60℃孵育4小时，进行环化连接。之后使用12.5％dPAGE纯化环化序列。将得到的环化DNA模版与对应的引物序列混合(SEQ ID NO：11Circ Zn(II)-MZ1a temp对应SEQ ID NO：12Circ Zn(II)-MZ1a primer，SEQ ID NO：13Circ Cd(II)-TX1a temp对应SEQ ID NO：14Circ Cd(II)-TX1a primer)，加入phi29(购自西格玛公司)进行滚环扩增，30℃孵育8小时后，得到纳米花样品。将纳米花样品与含有锌离子和镉离子的样品孵育，使用扫描透射电镜观察纳米花对离子的吸附情况。结果如图6所示，使用SEQ ID NO：11Circ Zn(II)-MZ1a temp制备的纳米花，只吸附锌离子，使用SEQ IDNO：14Circ Cd(II)-TX1a temp制备的纳米花，只吸附镉离子。

纳米花制备使用的模板和引物的序列如下表4所示；

表4纳米花制备使用的模板和引物

实施例7双DNA系统增加锌离子对细胞毒性

考虑到Zn(II)-MZ1a携带锌离子能力较强，且低浓度的锌离子对细胞毒性较小，于是设计了针对CCRF-CEM细胞的双DNA系统。已知sgc8c靶向结合CCRF-CEM细胞，发明人设计了表5中Sgc8c(SZ)和Zn(II)-MZ1a(SZ)这两条序列，sgc8c在原先序列的基础上，于5端延伸出20个碱基，成为Sgc8c(SZ)，Zn(II)-MZ1a在原先序列的基础上，于3端延伸出21个碱基，成为Zn(II)-MZ1a(SZ)。Sgc8c(SZ)和Zn(II)-MZ1a(SZ)末端的20个碱基完全互补配对，可以通过碱基互补配对形成双DNA系统，Zn(II)-MZ1a(SZ)3段最后一个碱基T为多余碱基，可以根据需要选择在T上添加修饰，如荧光修饰，也可不添加任何修饰，设计如图7A所示，琼脂胶电泳结果表征了双DNA系统形成良好。将双DNA系统预先在含有锌离子的缓冲液中组装好，加入含有不同锌离子浓度的细胞培养基RPMI-1640(购自Hyclone)内，观察细胞的凋亡情况(流式分析使用了Annexin V-FITC kit购自碧云天，IC50测定使用了CCK-8assay购自碧云天)，如图7B所示。结果显示，双DNA系统，可以增加锌离子对细胞的毒性,在加入双适配体前，IC

表5Sgc8c(SZ)和Zn(II)-MZ1a(SZ)序列

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。