一种基于多肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗领域，具体涉及一种基于多肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用。

背景技术

生物免疫治疗是一种新兴的，具有显著疗效的肿瘤治疗方法，是继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗手段，它在不破坏机体免疫系统功能的前提下，通过特异性识别肿瘤细胞，进而消灭组织中的肿瘤细胞而实现治疗肿瘤的目的。免疫细胞疗法是生物免疫治疗中的一种重要类型，其中，又以过继免疫细胞治疗发展最为迅猛。嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-Tcell,CAR-T)疗法是一种常见的过继免疫细胞疗法，该方法直接将可识别肿瘤抗原的基因片段(包括纳米抗体、单链抗体、细胞因子和配体等)与T细胞活化所需信号分子(包括CD3ζ链、CD28和4-1BB等共刺激分子)基因结合，构建成嵌合抗原受体(CAR)，通过基因转导的方式导入并修饰T细胞，赋予T细胞识别肿瘤抗原并迅速活化杀伤肿瘤细胞的能力，能有效规避MHC的限制性。目前，CAR-T疗法在血液恶性肿瘤治疗方面取得了巨大成功，实体瘤治疗方面，存在CAR-T归巢难，肿瘤微环境抵抗和缺少肿瘤特异性或相关性抗原等问题，亟待解决。

内质网应激是细胞应对内质网蛋白积累产生的一种应答形式，可诱发未折叠蛋白反应(UPR)，即细胞通过减少蛋白质合成，促进蛋白质降解，增加内质网分子伴侣表达等方式缓解内质网压力，内质网应激持续时间过长或过强，超过细胞自身未折叠蛋白反应的调节能力，将会引起细胞代谢紊乱和凋亡等。肿瘤微环境中，由于缺氧、葡萄糖饥饿和酸中毒等不利因素的存在常引起内质网应激反应，肿瘤细胞通过激活未折叠蛋白反应来适应这些不利条件，避免死亡。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)又称Bip蛋白，由HSPA5基因编码，是内质网未折叠蛋白反应的关键分子。在内质网应激下，GRP78可大量表达并促进蛋白质正确折叠，缓解内质网压力，具有极强的抗细胞凋亡能力。大量文献证明，GRP78在肺癌、肝癌、结直肠癌等多种实体瘤细胞中表达上调，并部分转移到细胞膜表面参与PI3K/AKT和JAK2/STAT3等信号通路的激活调控。GRP78细胞膜转移的特性在正常细胞中很少见，提示csGRP78可作为CAT-T治疗实体瘤的抗原，理论上具有很好的特异性和安全性。

因此，靶向csGRP78构建有效工作的CAR-T对实体瘤或其它csGRP78表达异常相关性疾病的治疗具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种以基于环肽PEP42构建的嵌合抗原受体免疫细胞及其制备和应用方法。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够特异性地结合Pep42受体，并且所述的胞外结合域具有环肽结构。

在另一优选例中，所述的环肽结构是基于小分子环肽Pep42的环肽结构，并且特异性地结合Pep42受体。

在另一优选例中，所述的CAR的胞外结合域除了含有针对Pep42受体的具有环肽结构的第一胞外结构域之外，还包括针对额外靶点的第二胞外结构域。

在另一优选例中，所述的额外靶点为肿瘤特异性靶点。

在另一优选例中，所述的环肽结构位于胞外结合域的末端(即N端)或中间。

在另一优选例中，所述环肽结构的长度为12-15个氨基酸；较佳地13-15个氨基酸。

在另一优选例中，所述的环肽结构(或Pep42肽段)具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或其氨基酸序列与SEQ ID NO:1的相同性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥93％，或与SEQ ID NO:1相比具有1、2或3个氨基酸的差异。

在另一优选例中，所述的Pep42受体选自下组：细胞膜表面Grp78(csGrp78)。

在另一优选例中，其特征在于，所述的胞外结合域包括Pep42肽段，所述的Pep42肽段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的胞外结合域具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的Pep42肽段与葡萄糖调节蛋白78(GRP78)受体具有特异性结合。

在另一优选例中，所述的GRP78是位于细胞膜表面(或膜结合)的GRP78蛋白(csGRP78)。

在另一优选例中，所述的GRP78蛋白来源于人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括：啮齿动物(如大鼠、小鼠)、灵长动物(如猴)；优选为灵长动物。

在另一优选例中，所述的GRP78蛋白是人源的或猴源的。

在另一优选例中，所述的GRP78蛋白是人源的。

在另一优选例中，所述的Pep42具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：

L-EB-H-TM-C-CD3ζ-RP(I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L是无或信号肽序列；

EB是胞外结合域；

H是无或铰链区；

TM是跨膜结构域；

C是无或共刺激信号分子；

CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

RP是无或报告蛋白。

在另一优选例中，所述的报告蛋白RP中还包括位于其N端的自剪切识别位点，优选地为T2A序列。

在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为荧光蛋白。

在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为mKate2红色荧光蛋白。

在另一优选例中，所述的mKate2红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的L是选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的L是CD8来源的信号肽。

在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的H是选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H是CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述H的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的TM是为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，所述的TM是CD8来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述的C是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2，或其组合。

在另一优选例中，所述的C是4-1BB来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的源于CD3ζ的胞浆信号传导序列的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，其特征在于，所述的载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体选自下组：pTomo慢病毒载体、plenti、pLVTH、pLJM1、pHCMV、pLBS.CAG、pHR、pLV等。

在另一优选例中，所述的载体是pTomo慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件WPRE、长末端重复序列LTR等。

在另一优选例中，所述载体包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的CAR。

在本发明的第五方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述的免疫细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的CAR。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞选自下组：T细胞、NK细胞、NKT细胞，或巨噬细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)或嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是CAR-T细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明第一方面所述的CAR、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10

在本发明的第八方面，提供了一种如本发明第一方面所述的CAR、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗肿瘤药物或制剂。

在另一优选例中，所述的药物或制剂还用于预防和/或治疗其他Pep42受体异常表达相关的疾病。

在另一优选例中，所述的Pep42受体包括但不限于csGRP78等。

在另一优选例中，所述的其他Pep42受体异常表达相关的疾病包括但不限于肿瘤、衰老、肥胖、心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、感染性疾病等。

在另一优选例中，所述的其他Pep42受体异常表达相关的疾病包括：csGRP78异常表达相关的疾病。

在另一优选例中，所述的Pep42受体异常表达是指所述Pep42受体过度表达。

在另一优选例中，所述Pep42受体过度是指所述Pep42受体表达量为正常生理状况下表达量的≥1.5倍，较佳地≥2倍，更佳地≥2.5倍。

在另一优选例中，所述的csGRP78异常表达相关的疾病包括：肿瘤、衰老、心血管疾病、肥胖等。

在另一优选例中，所述的疾病是csGRP78高表达(即csGRP78阳性)的恶性肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括血液肿瘤和实体瘤。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)等，或其组合。

在另一优选例中，所述的实体瘤选自下组：乳腺癌、胃癌、肝胆癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食道癌、胶质细胞瘤、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等，或其组合。

在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为Pep42受体异常表达相关的疾病。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。

在另一优选例中，所述的方法可与其他治疗方法联合使用。

在另一优选例中，所述的其他治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗等方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了Pep42-CAR载体构建示意图。

其中，A为Pep42核苷酸及氨基酸序列信息；B为对照组质粒CD19-CAR及Pep42-CAR结构示意图，其中信号肽、铰链区、跨膜区均来源于人CD8分子，4-1BB来自于人CD137,CD3ζ来源于人CD3,mKate2为荧光标记，用于检测CAR表达。

图2显示了CAR感染效率检测结果。

其中，A为CD19-CAR及Pep42-CAR感染T细胞72小时后细胞荧光表达结果，NTD为未处理，BF为明场，mKate2为CAR荧光表达；B为流式检测荧光表达结果。

图3显示了CAR增殖效率检测结果。

图4显示了不同肿瘤细胞系csGRP78表达检测的结果。

图5显示了体外检测Pep42-CAR-T对不同肿瘤细胞系的杀伤检测结果。

其中，SMMC7721、HepG2和MHCC97H为肝癌细胞系；BXPC3和ASPC1为胰腺癌细胞系。Luc全称Luciferase，荧光素酶。

图6显示了IFNγ释放检测结果。

图7显示了Pep42-CAR-T对过表达GRP78 T细胞的杀伤及IFNγ释放检测结果。

图8显示了Pep42-CAR-T对csGRP78低表达的细胞系杀伤检测结果，其中，PANC1为胰腺癌细胞，HEK293T为人胚胎肾上皮细胞系。

图9显示了Pep42-CAR-T在猕猴体内的安全性评价结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种具有特定环肽结构的胞外结合域的嵌合抗原受体(CAR)。具体地，本发明提供了基于小分子环肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用。实验结果表明，本发明的CAR-T细胞出乎意料地可在细胞表面高效形成并维持具有环肽结构的CAR，并且高效而特异性地靶向csGRP78受体，从而对靶细胞具有显著的杀伤效果，对肿瘤细胞表现出广谱的抗肿瘤效应。在此基础上完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以使开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”或“由…构成”。

“转导”、“转染”、“转化”或本文用到的术语指的是将外源多核苷酸传递导至宿主细胞，转录和翻译产生多肽产物的过程，包括利用质粒分子将外源多核苷酸引入宿主细胞(例如大肠杆菌)。

“基因表达”或“表达”指的是基因转录，翻译和翻译后修饰产生基因的RNA或蛋白产物的过程。

“多核苷酸”指的是任意长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核苷酸(DNA)，核糖核苷酸(RNA)，其杂合序列和类似物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，比如甲基化或加帽的核苷酸或核苷酸类似物。本文使用的术语多核苷酸指可互换的单链和双链分子。除非另有说明，本文描述的任意实施例里的多核苷酸包括双链的形式和已知的或可预测的构成双链形式的两条互补的单链。

本领域技术人员将容易理解本文所述的所有参数，尺寸，材料和构造的含义。实际参数，尺寸，材料和/或配置取决于使用本发明说明的特定应用。本领域技术人员能够理解，实施例或权利要求仅是通过示例的方式给出的，并且在等效物或权利要求的范围内，本发明的实施例可涵盖的范围不限于具体描述和要求的范围。

本文的定义和使用的所有定义应被理解为超过词典定义或通过引用并入的文档中的定义。

本发明的所有参考文献，专利和专利申请都相对于其所引用的主题通过引用并入，在某些情况下可能包含整个文档。

应当理解，对于本文所述的包括一个以上步骤的任何方法，步骤的顺序不一定限于这些实施例中描述的顺序。

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

GRP78与内质网应激反应

实体瘤具有独特的肿瘤微环境，由于脉管系统差，通常处于缺氧及葡萄糖饥饿状态，经糖酵解途径产生大量乳酸。实体瘤细胞为应对肿瘤微环境中的压力刺激而引起内质网应激，并诱发未折叠蛋白自我保护反应，减少错误折叠蛋白的分泌及积累，维持内质网稳态，为肿瘤细胞创造生存机会。GRP78作为未折叠蛋白反应的关键调控蛋白，在肿瘤细胞中表达水平显著上调。正常情况下，GRP78与IRE1、PERK和ATF6蛋白的内质网腔结构域结合，抑制其功能，当内质网应激时，GRP78与三个蛋白分离，并与未折叠或错误折叠蛋白结合，一方面将错误折叠蛋白运输回胞质，经26S泛素酶降解，另一方面利用ATP水解的能量加速蛋白质的折叠，使正确折叠后的蛋白质运送到高尔基体，从而促进新生蛋白质的正确折叠和防止错误折叠、未折叠蛋白质的积聚。解离后的IRE1、PERK和ATF6则分别通过各自不同的信号通路引起下游的未折叠蛋白质反应。

肿瘤细胞中表达上调的GRP78能部分逃逸至肿瘤细胞膜表面，参与肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和耐药等过程。进一步研究发现，csGRP78表达丰度与肿瘤细胞的恶性程度相关。尽管目前对GRP78膜转移的机制还不完全清楚，且不同细胞可能存在不同的转移机制，但这并不影响其在实体瘤CAR-T治疗中的应用价值。另外，csGRP78在血液肿瘤细胞，如Sup-B15和NS-1中也能检测到的表达。因此，本发明的靶向csGRP78的CAR-T对实体瘤、血液瘤或其它csGRP78表达异常相关性疾病的治疗均具有重要价值。

Pep42环肽

环肽Pep42可特异性结合csGRP78受体。2006年，Kim等通过使用噬菌体环肽库技术筛选到csGRP78特异性小分子环肽配体Pep42。Pep42环肽由13个氨基酸组成，序列为CTVALPGGYVRVC。Pep42通过两端两个半胱氨酸之间形成二硫键成环，突变实验进一步证实，Pep42环状结构是其特异性识别csGRP78的分子基础。环肽是存在于植物、动物及人体内一类重要的活性肽，半衰期长，具有明确的固定构象，能够与受体很好的结合。人体内，线性肽成环多发生在两个半胱氨酸之间，且成环效率高，这为环肽类药物的应用提供了重要条件。目前，基于人工设计和体外进化的基因编码技术获得了大量的环肽配体，Pep42即为其中之一。

Pep42与csGRP78特异性结合后能内化进细胞内，本身无细胞毒性，这为靶向csGRP78治疗肿瘤的药物设计提供了有力工具，并已证明能有效递送化疗药物，减小化疗药物对正常细胞的毒性作用。

Pep42是GRP78的配体。本发明的基于Pep42构建的CAR是基于受体/配体的CAR分子，较基于单链抗体scFv序列设计的CAR具有亲和力适中、在动物中的安全性评价结果有较大临床参考价值等优势。

本发明嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)由胞外抗原识别区域、跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。

CAR的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CAR在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CAR相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CAR基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CAR。

CAR的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。

胞外结构域包括靶-特异性结合元件。所述的胞外结构域可以是基于抗原-抗体的特异性结合的抗体的ScFv，也可以是基于配体-受体的特异性结合的天然序列或其衍生物。在本发明中，所述嵌合抗原受体的胞外结合域Pep42可特异性结合csGRP78蛋白。

细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括4-1BB共刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

在本发明的一个实施方式中，所述的CAR是可以特异性靶向csGRP78的CAR。

嵌合抗原受体免疫细胞(CAR-免疫细胞)

在本发明中，提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，其包含本发明的具有特异性靶向Pep42受体(优选地为csGRP78)的嵌合抗原受体。

本发明的嵌合抗原受体免疫细胞可以是CAR-T细胞，也可以是CAR-NK细胞，CAR-巨噬细胞。优选地，本发明的嵌合抗原受体免疫细胞是CAR-T细胞。

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第五方面所述的CAR-T细胞。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤标志物，针对某一种肿瘤标志物的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质标志物，又可利用糖脂类非蛋白质标志物，扩大了肿瘤标志物的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第五方面所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可用于Pep42受体(优选地为csGRP78)高表达的肿瘤。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有以下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了包含本发明的核酸分子的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。在本发明的一个实施方式中，报告基因是编码mKate2红色荧光蛋白的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面的宿主细胞或本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物(优选地为csGRP78)，协同激活T细胞，引起免疫细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗csGRP78的CAR-T细胞引起csGRP78阳性细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体提供了包括Pep42肽段、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝胆癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食道癌、成胶质细胞瘤、肺癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“有效量”、“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对具体肿瘤患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10

本发明的主要优点包括：

1)靶点特异：以csGRP78为例，csGRP78在正常细胞的细胞膜上基本不表达，但在内质网应激情况下(如肿瘤)会转位至细胞膜上，从而本CAR可特异性杀死csGRP78高表达的恶性细胞，而对正常细胞基本无杀伤作用。

2)本发明利用配体与受体相结合作用方式，而非传统意义上的scFv。靶点csGRP78保守性高，在动物特别是灵长类动物中的安全性试验更能反应其在人体的安全性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

表A本发明涉及的氨基酸序列总结

/>

实施例1：制备Pep42-CAR载体及CD19-CAR对照载体

pTomo-CAR空载质粒构建：从NCBI网站数据库搜索到人的CD8α铰链区、人的CD8跨膜区、人的4-1BB胞内区以及人CD3ζ胞内区基因序列信息，与mKate2组合成融合基因，通过华大基因合成目的片段，并通过AgeI(Thermo)和SalI(Thermo)双酶切插入pTomo慢病毒表达载体中，构建成空载质粒。在胞外结合域与跨膜结构域之间有NheI酶切位点，用于随后克隆目的片段。

目的片段(胞外包含抗原识别域部分)设计、合成与克隆：将Pep42序列转译成DNA序列，然后在5’端添加CD8信号肽，3’端添加CD8α铰链，组合成融合基因，并分别在两端添加Agel和Nhel酶切位点。DNA序列信息如下：5’ACCGGTGCGCTGCCACCATGGCCCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCCCTTGCTCTGCTTCTTCATGCAGCAAGGCCG

CD19-CAR对照质粒构建与Pep42-CAR质粒构建相同，仅将抗原识别区用anti-CD19scFv(Fmc63)替换。

所有质粒均用QIAGEN公司的无内毒素大抽试剂盒抽提，纯化后质粒用碧云天lipo8000转染试剂转染HEK293T细胞进行慢病毒包装。

实施例2：病毒包装

在15cm皿中进行包装且所用HEK293T细胞小于20代，待HEK293T细胞汇合度在80％-90％左右进行转染，准备2ml Opti-MEM

实施例3：CAR-T细胞制备

用Ficoll分离液从人外周血中分离单核细胞，由RosetteSep Human T CellEnrichment Cocktail(Stemcell technologies)试剂盒分离纯化获得CD3+T细胞，分装冻存于液氮。制备CAR-T细胞前复苏T细胞，用CD3/CD28磁珠(Life technology)进行活化，再加入200U/ml的IL2(PeproTech)，刺激培养48小时后进行病毒感染。慢病毒在lentiboost存在时按照MOI＝20感染T细胞制备CAR-T细胞。感染一天后更换培养基。

实施例4：流式细胞仪检测感染CAR-T细胞的阳性率

分别离心收集病毒感染72小时后的CAR-T细胞和NTD细胞(对照组)，PBS洗涤一次后弃上清，用含有2％FBS的PBS重悬细胞，流式检测阳性率。

转染效率的结果如图2所示。结果表明，CAR-T细胞表达的CAR-T2A-mKate2融合蛋白经切割后，形成的mKate2蛋白在胞内表现出红色荧光。流式细胞术进行红色荧光检测，表明CD19-CAR-T的阳性表达率为78.9％左右，Pep42-CAR-T的阳性表达率为81％左右,两者阳性率水平相当。

实施例5：CAR-T细胞增殖检测

慢病毒感染1*10

细胞增殖曲线如图3所示，相较于NTD组和CD19-CAR-T组，Pep42-CAR-T组细胞增殖并无显著抑制现象。

实施例6：检测各靶细胞csGRP78的表达

对于贴壁细胞，先在24孔板中放入直径为14mm的细胞爬片，再以2*10

csGRP78免疫细胞荧光检测结果如图4所示，SMMC7721、HepG2和MHCC97H三株肝癌细胞，Bxpc-3胰腺癌细胞，KG-1a急性髓系细胞白血病细胞和HL-60人急性早幼粒白血病细胞均有较高csGRP78表达水平。

实施例7：携带luciferase的靶细胞构建

从pGL3-luciferase质粒中PCR扩增出luciferase片段，然后通过XbaI和BamHI连接进入pTomo载体构建pTomo-lucferase质粒。分别从pTomo及PLkO.1质粒中分别扩增IRES及puromycin片段。通过三片段连接成功构建pTomo-luciferase-IRES-Puro质粒。慢病毒包装及滴度测定如前所述，按照MOI＝10分别感染人胚肾HEK293T细胞、人肝癌细胞系HepG2、MHCC97H和SMMC7721，胰腺癌细胞系BxPc3和PANC1，48小时后用puromycin(1ug/ml)筛选1周分别得到HEK293T-luciferas、HepG2-luciferase、MHCC97H-luciferase、SMMC7721-luciferase、BxPc3-luciferase和PANC1-luciferase细胞。

实施例8：CAR-T细胞对肿瘤细胞杀伤

贴壁细胞：将带luciferase标记的靶细胞消化计数后调整细胞密度为2×10

悬浮细胞：收集靶细胞，基础培养基重悬，调整细胞密度到1×10

细胞毒性杀伤细胞％＝(1-含效应细胞时靶细胞荧光值/无效应细胞时靶细胞荧光值)×100％

Pep42-CAR-T对靶细胞的杀伤情况如图5所示，相较于NTD组和CD19-CAR-T组，Pep42-CAR-T对csGRP78阳性的SMMC7721、HepG2和MHCC97H三株肝癌细胞、Bxpc3胰腺癌细胞、KG-1a急性髓系细胞白血病细胞和HL-60人急性早幼粒白血病细胞均有很强的杀伤效果。图中*(p＜0.05)或**(p＜0.01)代表各个效靶比下Pep42-CAR-T组相较于CD19-CAR-T组统计学显著性差异。

实施例9：IFNγ细胞因子释放

从-80℃解冻实施例8中收集的细胞上清后，IFNγ按照IFN gamma Human ELISAKit(life technology)检测。

用Standard Dilution Buffer溶解标准品，并进行梯度稀释成1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml、0pg/ml的标准品。

每孔中加入50ul Incubation buffer、50ul检测样本、50ulIFNγbiotinconjugated solution，混匀后室温静置90分钟。

然后依次按照以下步骤进行操作：

(1)用1*Wash Buffer洗孔4次，每次停留1分钟。

(2)每孔加入100ul 1*Streptavidin-HRP solution，室温静置45分钟。

(3)用1*Wash Buffer洗孔4次，每次停留1分钟。

(4)加入100ul Stabilized chromogen，室温静置30分钟.

(5)每孔加入100ul Stop solution后混匀。

(6)450nm处检测吸光值。

IFNγ释放的检测情况如图6所示，相较于NTD组和CD19-CAR-T组，Pep42-CAR-T组细胞共培养上清中IFNγ释放量显著上调。图中**(p＜0.01)代表Pep42-CAR-T组相较于NTD组或CD19-CAR-T组统计学均具有极显著差异。

实施例10：过表达csGRP78后对Pep42-CAR-T杀伤作用影响

NCBI获取人GRP78编码序列(CCDS6863.1)，合成引物，分别在上游引物和下游引物加入XbaI和BamhI酶切位点，体外PCR扩增获得GRP78编码区,双酶切连接至pTomo空载质粒中，构建成pTomo-CMV-GRP78-IRES2-EGFP慢病毒表达质粒。

尽管已证明肿瘤细胞中GRP78膜转移能自发产生，但不同肿瘤细胞情况不一样、也有肿瘤细胞没有csGRP78表达，这使得在csGRP78阴性的肿瘤细胞中单纯过表达外源性GRP78可能很难达到上调csGRP78的目的。经多株细胞测试发现，人CD3+T细胞较特殊，可用于Pep42-CAR靶向csGRP78特异性验证。

将EGFP与GRP78在T细胞中共表达，使用流式细胞分析仪对EGFP阳性CD3+T细胞的PI染色情况进行检测，观察细胞杀伤情况。同时，使用IFNγHuman ELISA Kit(lifetechnology)对共培养细胞上清中IFNγ的释放情况进行检测，操作步骤如实施例8和实施例9所述。

Pep42-CAR-T对过表达GRP78后CD3+T细胞的杀伤检测情况如图7(左)所示，GRP78在CD3+T细胞中过表达引起Pep42-CAR-T显著的杀伤作用。IFNγ释放情况如图7(右)所示，Pep42-CAR-T能大量释放IFNγ，杀伤过表达GRP78的CD3+T细胞。图7中**(p＜0.01)代表GRP78过表达CD3+T细胞和Pep42-CAR-T共培养组相较于其它任意组统计学均具有极显著差异。

实施例11：Pep42-CAR-T在正常细胞及csGRP78低表达肿瘤细胞中的杀伤作用

HEK293T细胞是人正常胚肾来源细胞系，PANC1细胞是csGRP78表达很低的人胰腺癌细胞，我们按照效靶比(E:T＝5:1)将Pep42-CAR-T细胞分别与HEK293T和PANC1细胞共孵育，通过荧光值变化检测Pep42-CAR-T对两株细胞的杀伤。

结果如图8所示，csGRP78染色可见csGRP78在PANC1细胞中表达量少，Pep42-CAR-T对HEK293T和PANC1细胞均没有明显的杀伤作用。该结果证实Pep42-CAR-T对正常细胞及csGRP78低表达的肿瘤细胞均无杀伤作用，具有高特异性。

实施例12：Pep42-CAR-T非人灵长类体内安全性评价

用Ficoll分离液从猕猴外周血中分离单核细胞，由RosetteSep Human T CellEnrichment Cocktail(Stemcell technologies)试剂盒分离纯化获得CD3+T细胞。T细胞用CD3/CD28磁珠(Life technology)进行活化，再加入200U/ml的IL2(PeproTech)，刺激培养48小时后进行Pep42-CAR慢病毒感染。慢病毒在lentiboost存在时按照MOI＝200感染猴子T细胞制备CAR-T细胞。感染病毒4天后的CAR-T细胞按5*10

结果如图9所示，Pep42-CAR-T回输到健康猕猴体内后一段时间(42天)内，猴子体温、体重、血压和心率等相较于回输前均无异常变化，表现出较好的安全性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种基于多肽Pep42构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用

<130> P2021-1801

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Cys Thr Val Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Val Arg Val Cys

1 5 10

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met His Met Lys Leu Tyr Met Glu

1 5 1015

Gly Thr Val Asn Asn His His Phe Lys Cys Thr Ser Glu Gly Glu Gly

202530

Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Met Arg Ile Lys Ala Val Glu Gly

354045

Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ala Thr Ser Phe Met Tyr

505560

Gly Ser Lys Thr Phe Ile Asn His Thr Gln Gly Ile Pro Asp Phe Phe

65707580

Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Val Thr Thr Tyr

859095

Glu Asp Gly Gly Val Leu Thr Ala Thr Gln Asp Thr Ser Leu Gln Asp

100 105 110

Gly Cys Leu Ile Tyr Asn Val Lys Ile Arg Gly Val Asn Phe Pro Ser

115 120 125

Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Leu Gly Trp Glu Ala Ser Thr

130 135 140

Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Gly Leu Glu Gly Arg Ala Asp Met

145 150 155 160

Ala Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu Ile Cys Asn Leu Lys Thr

165 170 175

Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Lys Asn Leu Lys Met Pro Gly Val

180 185 190

Tyr Tyr Val Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu

195 200 205

Thr Tyr Val Glu Gln His Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu

210 215 220

Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn

225 230

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 1015

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 1015

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

202530

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

354045

<210> 5

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 1015

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 6

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 1015

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

202530

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

3540

<210> 7

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

1 5 1015

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

202530

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

354045

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

505560

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

65707580

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

859095

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 1015

His Ala Ala Arg Pro Cys Thr Val Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Val Arg

202530

Val Cys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

354045

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

505560

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

65707580

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

859095

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

100 105 110

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

115 120 125

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

130 135 140

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln

145 150 155 160

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

165 170 175

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

180 185 190

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

195 200 205

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

210 215 220

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

225 230 235 240

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

245 250 255

Arg

<210> 9

<211> 771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggccctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccccttgctc tgcttcttca tgcagcaagg 60

ccgtgcacag tggctctgcc tggcggctat gtgagagtgt gcaccacgac gccagcgccg 120

cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgct agccagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 180

tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 240

tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 300

ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 360

ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 420

ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag 480

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 540

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 600

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 660

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 720

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg c 771

<210> 10

<211> 170

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accggtgcgc tgccaccatg gccctgcccg tcaccgctct gctgctgccc cttgctctgc 60

ttcttcatgc agcaaggccg tgcacagtgg ctctgcctgg cggctatgtg agagtgtgca 120

ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgctagc 170