一种用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，涉及一种用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

活性氧作为重要的细胞内信号分子，在人体中起着重要的作用。次氯酸是白细胞中髓过氧化物酶催化氯离子和过氧化氢在一定生理条件下反应产生的，是生物系统中最重要的活性氧之一。研究表明，当体内次氯酸浓度过高时，会会导致体内的生物分子(如蛋白质、核酸、脂质和酶)氧化，导致组织损伤、炎症等一系列疾病，如心血管疾病、肾脏疾病、神经退行性疾病，甚至肿瘤。因此，能够准确检测次氯酸的浓度大小对揭示其引发的生理和病理过程具有非常重要的意义。因此，开发一种高选择性、高灵敏度的方法用于体内和环境中次氯酸的实时监测具有重大的意义。

目前检测次氯酸的方法主要有：比色法、碘量滴定法、电化学法、化学发光法等。近年来，荧光探针作为一种理想的检测工具，与其它检测方法相比，具有灵敏度高、可操作性强、可在体内进行生物成像分析等独特的优势而得到了广泛应用。与这些检测方法相比，荧光探针因具有检测速度快、灵敏度高、选择性好、操作简单等优点，并且在环境科学、生命科学等领域得到广泛应用。由于次氯酸的亚细胞分布尚不清楚，仍难以阐述次氯酸在细胞内的功能。因此，有必要开发荧光探针来检测次氯酸在亚细胞水平的分布。尽管目前已报道了多种次氯酸荧光探针，已经应用于亚细胞器(线粒体或溶酶体)中次氯酸的荧光成像分析。但他们仍然存在一些共同的问题，这些细胞器靶向的荧光探针发射波长大多在可见光区域，且只有单一的发射信号，这将会影响探针在生物系统中的应用。因此，设计一种检测线粒体次氯酸的近红外比率荧光探针是很有必要的。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针，具有长波长(在近红外区)、高灵敏度以及高选择性的检测次氯酸，并能够应用于活细胞线粒体中次氯酸的比率荧光成像。

为实现解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针结构式为：

该荧光探针，分子式为：C

所述的用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

1)以10-((3,5-二甲氧基-4-羟基)苯基)-1,3,7,9-四甲基氟硼二吡咯为原料，在对甲苯磺酸和哌啶的催化下，与4-(甲基硫基)苯甲醛发生柯诺瓦诺格缩合反应，制得目标化合物10-(3,5-二甲氧基)苯酚基)-3,7-二((4-甲硫基)苯乙烯基)-1,9-二甲基氟硼二吡咯；

2)在无水碳酸钾的催化下，10-(3,5-二甲氧基)苯酚基)-3,7-二((4-甲硫基)苯乙烯基)-1,9-二甲基氟硼二吡咯与(4-溴丁基)三苯基溴化膦发生取代反应，制得目标探针10-(3,5-二甲氧基-4-(2-三苯基膦代丁氧基)苯基)-3,7-二((4-甲硫基)苯乙烯基)-1,9-二甲基氟硼二吡咯。

所述的用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针的制备方法，具体包括如下步骤：

1)0.5～2.5mmol10-((3,5-二甲氧基-4-羟基)苯基)-1,3,7,9-四甲基氟硼二吡咯(BODIPY-1)、1.5～7.5mmol 4-(甲基硫基)苯甲醛和1.5～7.5mmol对甲苯磺酸溶于无水甲苯；随后，逐渐加入0.5～2.0mL哌啶，反应混合物回流搅拌6h；反应后，对反应混合物进行洗涤、干燥和柱层析处理，得到绿色固体目标化合物10-(3,5-二甲氧基)苯酚基)-3,7-二((4-甲硫基)苯乙烯基)-1,9-二甲基氟硼二吡咯(BODIPY-S)。

2)将1.0mmol BODIPY-S、1.0～3.0mmol(4-溴丁基)三苯基溴化膦和2.0～4.0mmol无水碳酸钾，溶解在无水乙醇中，然后混合物在85℃回流6h后，对反应混合物进行洗涤和干燥处理；粗产物经硅胶柱层析纯化得到黑色固体目标化合物10-(3,5-二甲氧基-4-(2-三苯基膦代丁氧基)苯基)-3,7-二((4-甲硫基)苯乙烯基)-1,9-二甲基氟硼二吡咯(Mito-BS)。

所述用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针在检测次氯酸中的应用；所述的检测为非疾病诊断和治疗。

所述用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针在检测离体活细胞中线粒体中次氯酸中的应用。

所述的应用，在次氯酸的存在下荧光发射光谱会发生蓝移。

所述的应用，该荧光探针的线性范围为0-80μM，检测限为31nM，响应时间在20s内。

所述的应用，在日光下，该探针溶液遇到次氯酸后，溶液颜色由绿色变成蓝色。

有益效果：与现有技术相比，本发明的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针Mito-BS在次氯酸的存在下荧光发射光谱会发生明显的蓝移，可以用于次氯酸的高灵敏度检测，该荧光探针的线性范围为0-80μM，检测限为31nM。同时，该荧光探针对次氯酸响应迅速，反应时间在20s内。并且该荧光探针对次氯酸表现出很好的选择性,不受其他活性氧、活性硫和阴离子等干扰物的影响。Mito-BS作为检测次氯酸的荧光探针具有合成方便、响应迅速、灵敏度高、选择性好、发射波长大等诸多优点，具有良好的应用价值。

附图说明

图1是Mito-BS与不同浓度次氯酸作用后在620-780nm处荧光强度的荧光光谱图；

图2是Mito-BS与不同浓度次氯酸作用后荧光强度比(680nm荧光强度/645nm荧光强度)变化的线性关系图；

图3是Mito-BS与不同浓度次氯酸作用下荧光强度比随时间变化荧光光谱图；

图4是Mito-BS与其他干扰分析物作用后荧光强度比变化的荧光柱状图；

图5是Mito-BS的细胞毒性试验；横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为HepG2和RAW264.7细胞的存活率；

图6是Mito-BS与商业线粒体绿色染料共定位染色实验的荧光共聚焦图；其中，(a-c)为探针和线粒体绿色定位剂在HepG2细胞中共染色实验的荧光成像图；(a)激发波长为405nm，发射波长扫描范围为480-580nm；(b)激发波长为605nm,发射波长扫描范围为620-700nm；(c)明场图；(d)图为(a)、(b)和(c)叠加图；(e)荧光分布散点图；(f)线性区域红色和绿色荧光强度位置与强度关系图；

图7是Mito-BS在RAW264.7细胞中与外源性次氯酸的荧光成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

制备用于检测次氯酸的BODIPY基线粒体靶向近红外荧光探针Mito-BS的方法，具体步骤如下：

1)化合物BODIPY-1(0.5mmol)、4-(甲基硫基)苯甲醛(2.5mmol)和对甲苯磺酸(2.5mmol)一起放入带有Dean-Stark装置的三口烧瓶中，溶于50mL无水甲苯。随后，逐渐加入哌啶(1mL)，反应混合物在110℃下回流搅拌6h。反应后，对反应混合物进行旋转蒸发、洗涤、干燥处理。粗产物经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝5:1,v/v)，得到绿色固体，即目标化合物BODIPY-S(产率40％)。

反应路线如下：

2)将BODIPY-S(1mmol)、(4-溴丁基)三苯基溴化膦(2mmol)和无水碳酸钾(2.5mmol)，溶解在50mL无水乙醇中，然后混合物在85℃回流下搅拌6h，反应后对反应混合物进行旋转蒸发、洗涤和干燥处理。粗产物经硅胶柱层析纯化(DCM:MeOH＝25:1,v/v)得到黑色固体Mito-BS(产率19％)。

反应路线如下：

实施例2

将Mito-BS制成1×10

与此同时，在日光下，该化合物溶液遇到次氯酸后，溶液颜色会由绿色变成蓝色。因此，该探针可以作为一种比色且比率型的荧光探针用于灵敏的检测次氯酸浓度变化。

实施例3

将Mito-BS配制成1×10

实施例4

首先，采用标准MTT法测试Mito-BS对HepG2细胞和RAW264.7细胞的细胞毒性。将细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM中培养。然后，加入不同浓度的Mito-BS(0、5、10、20、30μM)孵育48h。每孔中注入MTT溶液(5mg/mL,10μL)，维持4h，去除悬浮液后，补充200μL DMSO溶液。在490nm波长处获得各板的吸光度。如图5所示，当加入0-3×10

然后，进行探针(Mito-BS)与HepG2细胞的线粒体共定位的荧光成像实验。在共聚焦培养皿中加入0-3×10

实施例4

进行探针Mito-BS在RAW 264.7细胞中与外源性次氯酸的荧光成像实验。先用PBS缓冲溶液清洗死细胞，将稀释于PBS缓冲溶液中3×10