高通量功能物质筛选双报告基因模型及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种高通量功能物质筛选双报告基因模型及其构建方法与应用。

背景技术

早期胚胎死亡率高是限制母猪繁殖性能的关键因素之一，猪的胚胎死亡率约为30％～50％，其中主要发生在妊娠早期。早期胚胎丢失的主要原因是早期胚胎发育不良导致的附植失败。因此，如何改善胚胎的营养状况，调控早期胚胎的发育和着床，从而提高早期胚胎的成活率一直是该领域的热点。

哺乳动物早期胚胎发育过程受多种因素调控，如激素、母体营养、生长因子和细胞因子等。越来越多的证据表明，母体营养的变化会影响哺乳动物胚胎质量和早期胚胎发育。均衡精准的营养可以有效改善胎儿的生理环境，提高早期胚胎的存活率。由此可见，利用营养干预母猪妊娠早期胚胎发育、提高母猪繁殖性能具有很大的实际应用潜力。

目前的研究大多以单一营养素的角度开展相关试验，现有的研究方法无法实现从大量营养素中快速、高效地筛选出能够调节母猪早期胚胎发育的候选营养素或组合。因此，亟需构建一种可用于高通量筛选调节母猪早期胚胎发育的营养物质的检测系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量功能物质筛选双报告基因模型及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种高通量功能物质筛选双报告基因模型的构建方法，将萤火虫荧光素酶报告基因表达盒和海肾荧光素酶报告基因表达盒通过慢病毒转导至猪胚胎滋养层细胞中，经G418和Puro筛选后得到高通量功能物质筛选双报告基因模型(细胞模型)；

其中，所述萤火虫荧光素酶报告基因表达盒中萤火虫荧光素酶报告基因与猪Cdx2基因启动子可操作地连接，所述海肾荧光素酶报告基因表达盒中海肾荧光素酶报告基因与猪TEAD4基因启动子可操作地连接。

优选地，所述猪Cdx2基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述猪TEAD4基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

第二方面，本发明提供按照所述方法制备的高通量功能物质筛选双报告基因模型。

第三方面，本发明提供一种双荧光素酶报告基因细胞系，分类命名为猪胚胎滋养层细胞pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc，该细胞系现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.45522，保藏日期2023年3月30日。

第四方面，本发明提供所述细胞模型或细胞系在高通量筛选调节母猪早期胚胎发育的功能物质中的应用。

第五方面，本发明提供一种利用所述细胞模型筛选出的促进母猪早期胚胎发育的组合物，所述组合物由赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸按2:1:2:(0.66-2):(2-6)摩尔比混合而成。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明构建的双荧光素酶报告基因细胞系可用于高通量筛选调节母猪早期胚胎发育的功能物质，对于快速、高效地鉴定可促进母猪早期胚胎发育的功能物质具有重要意义。

在构建单荧光高通量筛选细胞模型基础上，本发明创新性地将第二种基因Tead4的启动子插入到海肾荧光素酶基因前，并构建慢病毒载体，通过慢病毒转导将Tead4的启动子与海肾荧光素酶基因导入pTc-Cdx2/luc细胞核中，经Puro筛选后，得到可以表达两种荧光素酶的pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc细胞。该细胞在加入荧光素和海参荧光素后，产生的荧光强度分别代表了Cdx2和Tead4启动子的活性。双荧光高通量筛选细胞模型可同时针对Cdx2和Tead4两种基因进行营养物质的高通量筛选，进一步地增加了高通量筛选的准确性与稳定性。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中Cdx2和Tead4启动子电泳图。

图2为本发明较佳实施例中Cdx2和Tead4最适启动子筛选结果。

图3为本发明较佳实施例中所用慢病毒载体结构图谱。

图4为本发明较佳实施例中慢病毒包装结果。

图5为本发明较佳实施例中荧光强度表达情况。

图6为本发明较佳实施例中高通量筛选氨基酸组合。

图7为本发明较佳实施例中氨基酸组合在mRNA水平上的验证。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中，萤火虫荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶报告基因在NCBI中的编号分别为160793、160819。

实施例1高通量功能物质筛选双报告基因模型的构建及应用

1.材料与方法

1.1主要试验材料

本试验使用的猪胚胎滋养层细胞系(Porcine trophectoderm cells，pTc)，人胚胎肾细胞293T(Human Embryonic Kidney Cells 293T，HEK-293T)，pGL-4.17，psPAX2和pMD2.g质粒获赠于中国农业大学动物科技学院谯仕彦老师课题组(质粒pGL4.17可参见LeeYH,Andersen JB,Song HT,Judge AD,Seo D,Ishikawa T,Marquardt JU,Kitade M,DurkinME,Raggi C,Woo HG,Conner EA,Avital I,Maclachlan I,Factor VM,ThorgeirssonSS.Definition of ubiquitination modulator COP1 as a novel therapeutic targetin human hepatocellular carcinoma.Cancer Res.2010Nov 1；70(21):8264-9.doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-0749.Epub 2010Oct 19.PMID:20959491；PMCID:PMC2970744.质粒psPAX2和pMD2.g可参见Hong L,Sharp T,Khorsand B,Fischer C,Eliason S,SalemA,Akkouch A,Brogden K,Amendt BA.MicroRNA-200c Represses IL-6,IL-8,and CCL-5Expression and Enhances Osteogenic Differentiation.PLoS One.2016Aug 16；11(8):e0160915.doi:10.1371/journal.pone.0160915.Erratum in:PLoS One.2016Dec 29；11(12):e0169381.PMID:27529418；PMCID:PMC4987006.)。pGF-mCMV-EF1-Neo慢病毒质粒购自美国System Biosciences公司，pLV-Rluc慢病毒质粒购自重庆英茂盛业公司。

1.2试验方法

1.2.1 pGL4.17-cdx2 promoter和pGL4.17-Tead4 promoter重组质粒构建

在NCBI数据库查询猪CDX2和TEAD4基因的相关序列信息，确定其基因ID分别为100127132和100152085。分别下载包括起始密码子ATG前2000bp左右的Cdx2、Tead4启动子序列，用Snapgene软件对每种基因启动子设计6种不同长度的启动调控区的引物，引物序列如表1所示。对于pGL4.17的线性化，依据同源臂原则设计引物，引物序列如表1所示。

表1启动子扩增引物序列

1.2.2cdx2-luc慢病毒包装及感染

(1)pGF-cdx2-luc慢病毒质粒构建

使用EcoRⅠ和SpeⅠ酶对pGF-mCMV-EF1-Neo慢病毒载体进行双酶切，使其线性化。利用In-fusion酶将筛选出的转录起始活性最强的启动子克隆至线性化的pGF-mCMV-EF1-Neo慢病毒载体中。

(2)转染HEK-293T细胞

准备HEK-239T细胞，提前一天铺板细胞至10cm培养皿，待细胞融合度达到70％以上，再开始细胞转染。用500ul的Opti-MEM减血清培养基稀释质粒，转染共20μg质粒，其中pGF-cdx2-luc：psPAX2：pMD2.g＝5：3：2(质量比)。再加入40μL lipo3000转染试剂，吹打混匀，孵育15min，将混合液加入到细胞中。转染6-8h后，更换为DMEM-Hepes培养基，培养48h和72h后，分别收取病毒上清液。将得到的上清液2,000g离心10min，经过0.22μm的滤膜过滤，再用慢病毒浓缩试剂按比例浓缩病毒上清，4℃过夜。4℃4,000g离心20min，弃上清液，灰白色沉淀即为病毒，用PBS重悬，分装后于-80℃保存。

(3)感染pTc细胞

准备pTc细胞，提前一天将pTc细胞以1×10

1.2.3G418筛选稳转株

首先通过预实验确定G418最适筛选浓度为600μg/mL，用该浓度的G418筛选培养基培养pTc细胞10-14天，期间每2-3天以1：2传代。将得到的稳转株细胞命名为pTc-Cdx2/luc细胞。

1.2.4Tead4-Ruc慢病毒包装及感染

(1)pLV-Taed4-Rluc慢病毒质粒构建

使用XbaⅠ和EcoRⅠ对pLV-Rluci慢病毒载体进行双酶切，使其线性化。利用In-fusion酶将筛选出的转录起始活性最强的启动子克隆至线性化的pLV-Rluc中。

(2)转染HEK-293T细胞

准备HEK-239T细胞，提前一天铺板细胞至10cm培养皿，待细胞融合度达到70％以上，再开始转染。用500ul的Opti-MEM减血清培养基稀释质粒，转染共20μg质粒，其中pLv-Tead4-Rluc：psPAX2：pMD2.g＝5：3：2(质量比)。

(3)感染pTc-Cdx2/luc细胞

准备pTc-Cdx2/luc细胞，提前一天将pTc-Cdx2/luc细胞以1×10

2.2.5Puro筛选稳转株

首先通过预实验确定嘌呤霉素最适筛选浓度为1.2μg/mL，用该浓度的嘌呤霉素筛选培养基培养pTc-Cdx2/luc细胞7-10天，期间每2-3天以1：2传代。将得到的稳转株细胞命名为pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc细胞。

2.2.6荧光素酶活性检测

参考诺唯赞Duo-Lite Luciferase Assay System试剂盒说明书进行双荧光素酶活性检测。试验前一天，按每孔1×10

处理：待细胞融合度达到80％后，用含有不同氨基酸组合的培养基处理细胞24h。

裂解：24h后，移除培养基，每孔加入50μL细胞裂解液，静置10min。

萤火虫荧光素发光：每孔加入100ul荧光素。

上机：将不透光96孔板放入Biotek多功能酶标仪中，选用Luciferase检测模块，设置灵敏度为150，间隔时间5s，开始检测。

海肾荧光素发光：每孔加入100ul海肾荧光素。

上机：将不透光96孔板放入Biotek多功能酶标仪中，选用Luciferase检测模块，设置灵敏度为150，间隔时间5s，开始检测。

1.2.7基因表达测定

对于筛选出的这两种氨基酸组合，进行mRNA水平上的验证。将pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc细胞接种至6孔板，待细胞融合度达到80％，进行2h无特定氨基酸饥饿(赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)，随后分别用特定氨基酸缺乏培养基、45号氨基酸组合培养基、47号氨基酸组合培养基和完全培养基处理12h、24h和48h。检测Cdx2和Tead4等基因的表达情况。qPCR所用引物如表2所示。

表2载体线性化引物序列

2.结果

2.1Cdx2和Tead4启动子扩增

参照NCBI数据库中公布的猪Cdx2基因的序列，设计猪Cdx2基因启动子序列的引物，以pTc细胞基因组DNA为模板，扩增不同长度的Cdx2基因启动子区序列，长度分别为210bp，315bp，521bp，1,027bp，1,313bp，1,992bp。所扩增的片段经琼脂糖凝胶电泳检测分析，如图1所示，与2,000Marker对比五种不同长度的启动子DNA条带均在正确的位置上。

参照NCBI数据库中公布的猪Tead4基因的序列，设计猪Tead4基因启动子序列的引物，以pTc细胞基因组DNA为模板，扩增不同长度的Tead4基因启动子区序列，长度分别为208bp，333bp，589bp，989bp，1,542bp，1,992bp。所扩增的片段经琼脂糖凝胶电泳检测分析，如图1所示，与2,000Marker对比五种不同长度的启动子DNA条带均在正确的位置上。

2.2最佳启动子筛选

将不同长度的启动子片段重组质粒分别瞬时转染至96孔板中的pTc细胞，培养2天后，加入荧光素底物，随后检测荧光强度，结果如图2所示。

Cdx2基因最佳启动子的选择：用pGL-cdx2-210、pGL-cdx2-315、pGL-cdx2-521、pGL-cdx2-1027、pGL-cdx2-1313和pGL-cdx2-1992分别转染pTc细胞后，荧光素酶活性结果显示1,313bp长度的启动子转录活性较高，可能存在正向调控元件的结合位点。因此，对于Cdx2基因，选择1,313bp长度的启动子(序列如SEQ ID NO:1所示)进行后续的慢病毒包装工作。

Tead4基因最佳启动子的选择：用pGL-tead4-208、pGL-tead4-333、pGL-tead4-589、pGL-tead4-989、pGL-tead4-1542和pGL-tead4-1998分别转染pTc细胞后，荧光素酶活性结果显示989bp长度的启动子转录活性较高，可能存在正向调控元件的结合位点。因此，对于Tead4基因，选取989bp长度的启动子(序列如SEQ ID NO:2所示)进行后续的慢病毒包装工作。

2.3Cdx2慢病毒包装、感染以及抗性筛选

将pGF-cdx2-luc、psPAX2和pMD2.g按5:3:2的比例共转染至HEK293T细胞，共转染20μg质粒。在转染后24h、48h时分别在荧光显微镜下检测荧光信号和转染效率。在24h、48h荧光强度和转染效率如图3所示。收集上清液备用。使用浓缩后的慢病毒上清感染pTc细胞，3天后，开始用600μg/mL的G418进行抗性筛选，持续10-14天，得到pTc-Cdx2/luc细胞。该细胞可以表达萤火虫荧光素酶，加入荧光素底物后，荧光强度反应了cdx2启动子的表达强弱。

2.4Tead4慢病毒包装、感染以及抗性筛选

将pGF-Tead4-Rluc、psPAX2和pMD2.g按5:3:2的比例共转染至HEK293T细胞，共转染20μg质粒。在转染后24h、48h时分别在荧光显微镜下检测荧光信号和转染效率。在24h、48h荧光强度和转染效率如图3所示。收集上清液备用。使用浓缩后的慢病毒上清感染pTc-Cdx2/luc细胞，3天后，开始用1.2μg/mL的Puro进行抗性筛选，持续10-14天，得到pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc细胞。该细胞可以表达萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，加入荧光素底物后，产生荧光，荧光强度代表了cdx2启动子的表达强弱，加入海肾荧光素底物后，萤火虫荧光猝灭，再检测一次荧光，该荧光强度则代表了Tead4启动子的表达强弱。

2.5验证试验

将pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc细胞(保藏编号CGMCC No.45522)接种至96孔板，待细胞长满后，进行荧光素酶活性测定，依次检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶的活性代表了Cdx2基因启动子的活性，海肾荧光素酶活性代表了Tead4基因启动子的活性。如图5所示，裂解细胞并加入萤火虫素荧光素酶后，荧光强度达到了5000以上，而加入海肾荧光素酶后，荧光强度达到了10000以上，以上结果表明两种荧光素酶报告基因已成功导入。

2.6氨基酸组合筛选

2.6.1高通量筛选

为了探究早期胚胎发育的理想氨基酸模式，我们利用构建好的pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc高通量筛选细胞模型，结合响应面设计，进行了理想氨基酸模式的高通量筛选以及验证试验。

利用Design Expert软件对赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸进行响应面设计，得到了50种氨基酸组合。

将pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc细胞接种至96孔板，待细胞融合度达到80％，进行2h无特定氨基酸饥饿(赖氨酸、组氨酸、苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)，随后用不同氨基酸组合处理24h。裂解细胞后，检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，结果如图6所示。对于萤火虫荧光素酶，47号氨基酸组合(赖氨酸：组氨酸：苏氨酸：缬氨酸：异亮氨酸＝6:3:6:2:6)的效果最好，该组合对Cdx2基因启动子的促进效果达到了2.08倍。对于海肾荧光素酶，45号氨基酸组合(赖氨酸：组氨酸：苏氨酸：缬氨酸：异亮氨酸＝2:1:2:2:6)的效果最好，该组合对Tead4基因启动子的促进效果达到了1.84倍。

2.6.2mRNA水平验证

由于高通量筛选细胞模型只能测定关键基因启动子的表达强弱，可能与实际基因的表达情况有所差异，为了验证高通量筛选的准确性，测定了Cdx2基因和Tead4基因的表达情况，结果如图7所示。45号氨基酸组合在处理12h时就显著促进了Cdx2基因和Tead4基因的表达，而47号氨基酸组合则在处理48h时显著促进了cdx2基因和Tead4基因的表达，这些结果进一步这证明了高通量筛选试验的准确性。

通过两次慢病毒转导和抗性筛选，得到了pTc-Cdx2/luc-Tead4/Rluc细胞，该细胞可用于高通量筛选工作。双荧光高通量筛选细胞模型可同时针对两种基因进行营养物质的高通量筛选，进一步地增加了高通量筛选的准确性与稳定性。与此同时，我们利用该细胞模型筛选出了调节早期胚胎发育的候选理想氨基酸组合(赖氨酸：组氨酸：苏氨酸：缬氨酸：异亮氨酸＝2:1:2:0.66-2:2-6(摩尔比)，并在mRNA水平上做了进一步验证。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。