一种组织修复原位凝胶滴液及其制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，抗菌材料技术领域，涉及一种大麻二酚和可自提供NO气体的抗菌混合温敏原位凝胶滴液及其制备方法。

背景技术

糖尿病是一种严重的世界性疾病。据估计到2045年，糖尿病患者的人数将达到6.29亿。糖尿病现已成为继心血管疾病和肿瘤之后，第三位威胁人类健康和生命的非传染性疾病。在我国，糖尿病近30年患病率从平均0.67％飙升到11.6％， 到2021年已达1.3亿人。糖尿病患者若无有效的治疗方法，就易被糖多种并发症困扰，包括糖尿病性神经病变、肾病以及糖尿病足等，出现双目失明、肾衰竭，甚至导致肢体残疾和死亡。

糖尿病足(Diabetic foot，DF)是因长期的高血糖导致糖尿病血管病变和(或) 神经病变和感染，进而导致糖尿病患者足或下肢组织坏死的一种病变，是糖尿病最严重并发症之一，是糖尿病患者致残、致死的主要原因之一，也是造成社会沉重负担的重大公共卫生问题。我国50岁以上的糖尿病患者，糖尿病足的发病率高达8.1％。溃疡与坏疽是糖尿病患者致残致死的重要原因，其晚期治疗手段之一为截肢，以上糖尿病性肢体缺血症的病理生理变化是由于代谢紊乱所引起的血管病变及神经系统的功能障碍，且糖尿病患者免疫功能常常受损，临床上易发生足部感染甚至出现溃烂、坏疽等愈合困难，严重者需截肢。更不幸的是，糖尿病足预后很差，甚至比大多数癌症的病死率和致残率还高(除肺癌、胰腺癌等)。糖尿病足是糖尿病慢性并发症之一，糖尿病患者的很多足部并发症起自感觉性神经病变及轻度的自主与运动神经病变。其中感觉神经病变合并过高的机械应力，是引起足部溃疡和感染的主要始动因素。现有技术中，常规选用抗生素局部换药，但伤口愈合时间长，疼痛明显，加重患者的痛苦。由于缺乏足够的医疗资源和有效的药物，导致疾病预后效果很差，糖尿病足是糖尿病领域最急迫解决的需求之一。

大麻二酚（cannabidiol，CBD）具有较强的抗氧化活性、抗菌消炎、祛痘舒缓、抗氧化、镇痛、消肿，对损伤细胞的修复作用等多种的功效，且对于各类细菌、真菌具有广谱的杀菌能力（对于革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、链球菌等，革兰氏阴性菌如大肠杆菌等及霉菌和酵母菌具有很好的抗菌活性，副作用低等优点。在医药、化妆品、材料和工程等领域具有很重要的应用前景。

一氧化氮（NO）广泛存在于人体各种组织和细胞中，具有重要的生理功能。NO又称“血管内皮舒张因子”，能松弛血管平滑肌，并抑制血小板凝聚，还能作用于相邻的周围神经元如突触前神经末梢和星状胶质细胞，激活鸟苷酸环化酶从而产生多种生理效应。NO同时也是一种有效的广谱抗细菌和真菌试剂，包括常见的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。研究表明，nM级别的NO就足以有效地破坏多种菌株形成的生物膜。含有NO供体的材料也可有效控制细菌感染，NO是半衰期极短的自由基气体分子，作用过程中不易产生抗药性和毒副作用，而伴随其的劣势是，NO自身气体及半衰期短的性质不利于存储和实际使用，这使得NO作为卫生用品抑菌剂或抗菌剂的应用受到很大限制。

本发明，通过温敏材料，可以很好从液体转化为固态，适合各种不规则形状伤口的优点，结合CBD和NO的抗微生物、消炎、止痛、修复受损细胞等疗效，目的在于提供一种抗菌、止痛的温敏滴液及其制备方法和应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于为“溃疡性伤口”提供一种抗菌、消炎、止痛的组织修复原位凝胶滴液，以提高药物的局部生物利用度，为临床提供一种实用、可靠、方便的治疗皮肤感染的CBD和可自提供NO气体的抗菌滴液及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种不规则创面修复功能性温敏滴液及其制备方法和用途，其处方的质量百分比包括：水溶性CBD 1-15%，温敏材料 15-40%，壳聚糖1-2%，乙酸0.1-0.5%，NO供体材料1-20%，分散剂1-15%，蒸馏水50-90%、戊二醛1-2%。

本发明所涉及的抗菌滴液中CBD，其特征在于，所述水溶性大麻二酚的制备方法，包括如下步骤：①用2-5倍乙醇将高纯度CBD晶体溶解，形成溶液；②将α-环糊精用1-5倍纯水或乙醇-水加热溶解，待溶解完全后将①所述溶液加入其中，搅拌混合均匀；③包合，将①、②形成的溶液混合均匀，使用高压均质法进行大麻二酚包合，结束后，使用旋转蒸发仪减压浓缩，去除大部分溶剂和水分；④干燥，将③所得物料进行真空干燥，即得大麻二酚包合物（水溶性CBD）。

本发明所涉及的抗菌液中NO供体材料在光、热或水汽的刺激下能缓慢释放NO，起到抑制微生物生长、杀菌抗病毒的作用；但单纯的NO供体材料在基底材料上分布不均匀且极易掉落，最终影响材料的抗菌性能，本发明通过加入温敏水凝胶，使NO供体材料稳定地粘附于不规则的伤口上。

优选地，所述NO供体材料包括亚硝基铁氢化钠、S-亚硝基-N-乙酰青霉胺、S-亚硝基谷胱甘肽、偶氮烯翁二醇系列化合物或偶氮烯翁二醇负载高分子中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如S-亚硝基谷胱甘肽和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺的组合、亚硝基铁氢化钠和偶氮烯翁二醇系列化合物的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。优选S-亚硝基谷胱甘肽。

本发明所涉及的抗菌功能材料中NO供体材料可任选上述类型，其中优选S-亚硝基谷胱甘肽和S-亚硝基-N-乙酰青霉胺两种材料作为NO供体材料，S-亚硝基谷胱甘肽粉末呈淡粉色，S-亚硝基-N-乙酰青霉胺粉末呈淡绿色，使得抗菌功能材料整体呈现淡粉色或淡绿色，随着NO的释放，抗菌功能材料逐渐变成无色，时间越长颜色越淡，这起到一个指示作用，从侧面反映出NO的释放速度以及抗菌功能材料抗菌活性的高低。若将其用于制备一氧化氮双频仪芯片，在使用过程中，由于紫外光源的作用，能够刺激释放NO，一次使用时长一般为3min，灯源照射的中心圆形部位由最初的淡粉色或淡绿色变成无色，说明供体在这治疗过程中释放出一定浓度的NO，通过检测发现其NO浓度与人体鼻腔内生理浓度相接近，起到扩张毛细血管缓解鼻塞和抗菌的作用。

优选地，所述温敏型即型凝胶基质至少包含泊洛沙姆407和壳聚糖。更优选地，所述温敏型即型凝胶基质包括质量比：泊洛沙姆407 15%-40%，壳聚糖1%-2%（中粘度壳聚糖，20-40KD），乙酸0.1%-0.5%，戊二醛1-2%。相比于其配比，上述组合保证在室温条件下呈液体状态（22-27.5°C），接触到体表能快速成凝胶（28-30°C）。戊二醛1-2%，有交联作用，用来交联壳聚糖。

优选地，所述分散剂包括聚乙烯醇、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如聚乙烯醇和聚乙二醇的组合、十二烷基硫酸钠和十二烷基磺酸钠的组合、聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。优选聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠的组合。相比于其他分散剂类型，聚乙烯醇和十二烷基硫酸钠的组合在促进功能材料在基底材料上的分散均匀性方面更加显著。

加入分散剂保证NO和CBD在溶液中分布均匀，三者相辅相成，协同增效。本发明所涉及的抗菌液在上述质量份数的配比下，能够使材料的粘附性、稳定性、分散均匀性、NO供体材料和CBD利用率、抗菌性达到更好的效果。

本发明中：术语“溃疡性伤口”是指因感染、循环障碍、肿瘤坏死及外伤等因素导致真皮或皮下组织的局限性缺损。例如，久治不愈，使生长的肉芽组织老化，创面停止缩小，可形成难治性溃疡。溃疡为皮肤或粘膜深层真皮或皮下组织的限局性缺损，其形态、大小及深浅可因病因和病情轻重而异。溃疡面常有浆液、脓液、血液或坏死组织。在本发明的一个实施方案中，所述溃疡性伤口为糖尿病足。

附图说明

图1为糖尿病模型鼠血糖统计结果。

图2为正常对照组（不给药、不接种金黄葡萄球菌）、糖尿病小鼠接种金黄葡萄球菌（30µl不含CBD和NO的温敏凝胶对照）、糖尿病小鼠接种金黄葡萄球菌药组（30µl含CBD/NO温敏凝胶）。各组伤口愈合情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

实施例1

温敏滴液的制备

制备不规则创面修复功能性温敏滴液，其处方的质量百分比包括：水溶性CBD 5%，温敏材料 20%，壳聚糖1%，乙酸0.5%，NO供体材料20%，分散剂5%，蒸馏水50-90%、戊二醛1%。

水溶性大麻二酚的制备方法，包括如下步骤：①用2-5倍乙醇将高纯度CBD晶体溶解，形成溶液；②将α-环糊精用1-5倍纯水或乙醇-水加热溶解，待溶解完全后将①所述溶液加入其中，搅拌混合均匀；③包合，将①、②形成的溶液混合均匀，使用高压均质法进行大麻二酚包合，结束后，使用旋转蒸发仪减压浓缩，去除大部分溶剂和水分；④干燥，将③所得物料进行真空干燥，即得大麻二酚包合物（水溶性CBD）。

NO供体：S-亚硝基谷胱甘肽。温敏型即型凝胶基质包括质量比：泊洛沙姆407 15%-40%：壳聚糖1%-2%（中粘度壳聚糖，20-40KD）：乙酸0.1%-0.5%，戊二醛1-2%。相比于其配比，上述组合保证在室温条件下呈液体状态（22-27.5°C），接触到体表能快速成凝胶（28-30°C）。戊二醛1-2%，有交联作用，用来交联壳聚糖。

加入分散剂聚乙烯醇5%，保证NO和CBD在溶液中分布均匀，三者相辅相成，协同增效。

检测抗菌液滴不同温度下的物理状态， 结果见下表：

实施例 2

诱导糖尿病小鼠模型（1）

采用低剂量链脲佐菌素和高脂料联合使用构建II型糖尿病模型的方法，是目前较为成熟的方法，且具有耗时短、造模成功率高、重复性好、死亡率低等优点。

（1）实验动物及分组

6-8周雄鼠（C57BL/6，购自维通利华）25只，体重均20g以上。对照组（Control）：5只，腹腔注射0.1mmol/L，pH4.2的柠檬酸缓冲液。糖尿病诱导组（STZ）：50只，腹腔注射1%链脲佐菌素；随机取25只统计。

（2）模型制作方法

造模前分别检测小鼠空腹下初始血糖。空腹下腹腔注射1%链脲佐菌素（50mg/Kg），链脲佐菌素由0.1mmol/L，pH 4.2的柠檬酸缓冲液配制而成，现用现配，注射1小时后给高脂料，并密切注意小鼠状态，根据小鼠状态适时补充胰岛素或葡萄糖（一般血糖过低时会出现萎靡，瘫软，严重的呼吸微弱甚至死亡，若出现此类情况应及时补充葡萄糖；血糖过高时，小鼠会出现尿频，眩晕，可通过检测血糖确定，严重者应适当补充胰岛素），连续5天。造模第6天，检测小鼠空腹血糖，未达199.8mg/dl的小鼠补一次链脲佐菌素，再检测空腹血糖。当小鼠血糖稳定在199.8mg/dl以上即为造模成功。见图1。

（3）结果显示

糖尿病模型构诱导后的血糖和体重持续下降，血糖大于199.8mg/dl，且小鼠具有多饮水多排泄等糖尿病症状，造模成功，见图1。

实施例3：

糖尿病小鼠金黄色葡萄球菌感染的皮肤创口愈合实验（2）

糖尿病病人伤口不仅难愈合还容易感染，金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。本研究采用金黄色葡萄球菌构建糖尿病小鼠皮肤感染模型，旨在更贴近人类伤口不易愈合的病症，使得研究更有意义。

（1）糖尿病鼠建模实验参照实例2。

（2）皮肤伤口模型的构建

取鼠龄相当的野生鼠（C57BL/6，购自维通利华公司）、建模成功的糖尿病鼠成年雄鼠，麻醉后背部脱毛，用6mm活检打孔器构建全皮层创口。注意消毒，预防感染。

（3）金黄色葡萄球菌制备方法

接种金黄色葡萄球菌1:100于LB液体培养基，37℃，220 rpm，培养至指数生长期，检测OD 600，将菌液稀释至10-5、10-6倍，涂于固体无抗LB培养板上，37℃过夜培养，计算菌落单位数。

（4）分组及给药方式

正常对照组：5只，不给药、不接种金黄葡萄球菌。

糖尿病小鼠接种金黄葡萄球菌:10只（30µl不含CBD和NO的温敏凝胶对照）。

糖尿病小鼠接种金黄葡萄球菌药组:10只（30µl含CBD/NO温敏凝胶）。

给药方式均为涂抹于伤口处，每天给药1次。

（5）检测方法

拍照记录给药第0天到14天小鼠伤口愈合情况，并以1cm2作标尺，用PhotoShop软件进行伤口面积愈合度的计算。具体步骤如下：

对于伤口的愈合情况记录都是通过直接的拍照来完成的，在照片中照一个1cm2的标尺作为参考，然后用PhopoShop软件勾画出伤口面积，再用伤口面积除以这个标尺的面积，得到伤口相对面积。

愈合度＝S/S0 ×100％

其中，S表示现有伤口相对面积，S0表示初始伤口相对面积。用1减去上述的愈合度，可获知愈合了多少。

（6）实验结果

各组伤口愈合情况如图2所示。CBD/NO混合的温敏滴液愈合程度较糖尿病对照组具明显优势，且恢复状况接近正常对照组水平。