2'-O-没食子酰基金丝桃苷在制备抗纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于抗纤维化药物技术领域，具体涉及一种2″-O-没食子酰基金丝桃苷在制备抗纤维化药物中的应用。

技术背景

纤维化是组织异常修复的结果，其主要特征是多余的纤维结缔组织形成和细胞外基质沉积，导致肺、肝、肠和皮肤等器官的结构重塑。纤维化通常由严重或反复的组织损伤引起，早期主要以局部炎症反应为主，随着疾病发展，免疫细胞渗出和浸润逐渐减少，上皮细胞分化为成纤维细胞样细胞，成纤维细胞异常增殖，细胞外基质过度累积，最终导致纤维化的产生。纤维化的不断发展会致使组织结构破坏，器官功能障碍进而衰竭，甚至导致死亡。

由于纤维化病理机制复杂，尚未完全探明，目前能特异性治疗纤维化疾病的药物寥寥无几。2014年，尼达尼布和吡非尼酮作为治疗特发性肺纤维化的药物上市，但这两种药物只能减缓纤维化的进程，无法逆转纤维化。而对于其余器官的纤维化，市场上尚无能特异性靶向纤维化过程的药物。目前临床常用的药物治疗方案为糖皮质激素联合细胞毒性药物，期望通过免疫抑制来阻止早期的纤维化进程，但治疗效果有限且通常伴有骨髓抑制和粒细胞减少甚至缺乏的副作用。除药物治疗外，严重的纤维化常通过手术治疗。近年来，特异性靶向纤维化进程中关键因子的抗体正在研发中，间充质干细胞移植技术在纤维化疾病治疗中的也得到应用，但上述方法仍存在治疗成本高、治疗体系尚不成熟等问题。因此，开发新型抗纤维化药物具有广阔应用前景和重要社会意义。

泽漆(Euphorbia helioscopia L.)是大戟科大戟属的年生草本植物，味辛、苦，性凉，具有逐水消肿、散结和杀虫的功能，主要用于治疗水肿、肝硬化腹水和细菌性痢疾等疾病。目前已从泽漆中分离出二萜、三萜类化合物、槲皮素和2″-O-没食子酰基金丝桃苷等化合物，其中，2″-O-没食子酰基金丝桃苷还被报道存在于柿叶、华北大戟、红花鹿蹄草等植物中。目前尚无2″-O-没食子酰基金丝桃苷用于抗纤维化的相关报道。

发明内容

本发明人发现2″-O-没食子酰基金丝桃苷(结构式如下)具有抗纤维化作用，在肺上皮细胞间质转化模型、人皮肤成纤维细胞活化模型以及博来霉素诱导小鼠肺纤维化动物模型中均表现出显著的抗纤维化效果。

基于此，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供2″-O-没食子酰基金丝桃苷在制备抗纤维化药物中的应用。

第二方面，本发明提供包含2″-O-没食子酰基金丝桃苷，以及可选地药学上可接受的辅料的组合物，在制备抗纤维化药物中的应用。

第三方面，本发明提供包含2″-O-没食子酰基金丝桃苷的植物提取物在制备抗纤维化药物中的应用。

进一步地，所述植物可以为泽漆、柿(柿叶)、华北大戟、红花鹿蹄草等。

第四方面，本发明提供2″-O-没食子酰基金丝桃苷、包含2″-O-没食子酰基金丝桃苷的组合物或包含2″-O-没食子酰基金丝桃苷的植物提取物在制备具有以下一种或多种作用的产品中的应用：

(a)抑制细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和/或纤连蛋白(fibronectin)表达上调；

(b)抑制细胞的I型胶原(COl1A1)基因和/或纤连蛋白(FN1)基因转录上调；

进一步地，所述α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和/或纤连蛋白(fibronectin)表达上调，或者I型胶原(COl1A1)基因和/或纤连蛋白(FN1)基因转录上调是由TGF-β1或博来霉素诱导产生。

进一步地，所述细胞为肺上皮细胞或皮肤成纤维细胞，进一步地，所述皮肤成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。

进一步地，所述产品可以为药物、试剂等。

所述试剂是指用于生命科学研究、临床诊断以及医学研究用的产品。

附图说明

图1为实施例2中2″-O-没食子酰基金丝桃苷对TGF-β1诱导的肺上皮细胞间质转化模型中成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(fibronectin)表达水平的影响；

图2为实施例2中2″-O-没食子酰基金丝桃苷对TGF-β1诱导的肺上皮细胞间质转化模型中细胞外基质I型胶原(COl1A1)基因和纤连蛋白(FN1)基因的转录水平的影响；

图3为实施例3中2″-O-没食子酰基金丝桃苷对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞活化模型中细胞外基质I型胶原(collagen)和纤连蛋白(fibronectin)表达水平的影响；

图4为实施例3中2″-O-没食子酰基金丝桃苷对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞活化模型中细胞外基质I型胶原(COl1A1)基因和纤连蛋白(FN1)基因转录水平的影响；

图5为实施例4中博来霉素诱导小鼠肺纤维化动物模型实验流程；

图6为实施例4中各组小鼠的肺部CT成像；

图7为实施例4中2″-O-没食子酰基金丝桃苷对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺部细胞外基质编码基因(I型胶原(Col1a1)基因和纤连蛋白(Fn1)基因)转录水平的影响；

使用one-way ANOVA对数据进行统计分析，#表示模型组与正常组对比P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001；*表示化合物组与模型组对比P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面用实施例的形式提供2″-O-没食子酰基金丝桃苷治疗纤维化的药理实验结果，说明其在制药领域的新用途。同时必须说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下实施例以泽漆为例，从其中提取2″-O-没食子酰基金丝桃苷用以研究，但并不以此限制2″-O-没食子酰基金丝桃苷的来源。

实施例1. 2″-O-没食子酰基金丝桃苷的制备。

取中药泽漆茎叶粗粉，加入10倍量(v/w)水回流提取1小时，过滤提取液，药渣再加入8倍量(v/w)水回流提取1小时，过滤提取液。合并两次提取液，减压浓缩至干。加入1倍量(v/w)水加热回流1小时，室温静置过夜。过滤析出物，用少量二甲基亚砜溶解，高速离心，取上清液进行C18反相制备HPLC分离，10～50％乙腈-水梯度洗脱，检测波长254nm，收集2″-O-没食子酰基金丝桃苷色谱峰流出液，减压蒸干，得2″-O-没食子酰基金丝桃苷纯品，用以进行下面的实施例实验。化合物2″-O-没食子酰基金丝桃苷的

以下提供实施例2至4用以说明2″-O-没食子酰基金丝桃苷对TGF-β1诱导的肺上皮细胞间质转化与皮肤成纤维细胞活化过程的影响，以及对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度、肺部细胞外基质编码基因转录水平的影响。

实施例2. 2″-O-没食子酰基金丝桃苷对TGF-β1诱导的肺上皮细胞间质转化模型中的药物活性评价

TGF-β1可以诱导上皮细胞向成纤维细胞样细胞的转化，并激活成纤维细胞样细胞分泌大量细胞外基质，因此TGF-β1诱导的上皮细胞间质转化模型是纤维化研究中常用的体外模型之一。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(fibronectin)都是成纤维细胞的标志物，用以表征纤维化的严重程度。

(1)实验采用人正常肺上皮细胞(Beas-2b)，分为5组，包括正常组、模型组和2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药组(称作化合物组，其药液以不含血清的DMEM培养基稀释制备，药物浓度分别为100μM、50μM和25μM)。Beas-2b细胞(2×10

(2)给药组用上述不同浓度的2″-O-没食子酰基金丝桃苷药液分别同细胞预孵育30分钟，其余组细胞同时加入等体积不含血清的DMEM培养基。用不含血清的DMEM培养基稀释TGF-β1，令其终浓度为10ng/mL，加入模型组和给药组细胞对应的孔中，刺激24小时，进行肺上皮细胞间质转化模型的构建，正常组细胞加入等体积的不含血清的DMEM培养基。

(3)收集各组细胞样品，进行细胞外基质I型胶原(collagen)和纤连蛋白(fibronectin)表达水平的研究，具体操作包括：使用SDS溶液裂解细胞，提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量。蛋白样品(10μL/泳道)通过7.5％的SDS-PAGE胶分离，随后转印到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂牛奶室温封闭膜1小时，4℃下用一抗孵育过夜，清洗后用二抗室温下孵育1小时。用ECL Prime Western Blotting Detection Reagent进行曝光。用ImageJ软件进行灰度分析。结果见图1。

另取上述细胞样品，进行细胞外基质编码基因(I型胶原(CO/1A1)基因和纤连蛋白(FN1)基因)的转录水平研究，具体操作包括：将细胞匀浆，使用RNA simple总RNA提取试剂盒提取细胞样品中的RNA。使用Nano Drop分光光度计检测RNA含量。使用HifairTM II 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒将RNA逆转录为cDNA。配制样品-引物-SYBR Green反应体系，使用qPCR仪扩增细胞外基质编码基因(I型胶原(COl1A1)基因(正向引物序列为GAGGGCCAAGACGAAGACATC(SEQ ID NO：1)，反向引物序列为CAGATCACGTCATCGCACAAC(SEQ ID NO：2))和纤连蛋白(FN1)基因(正向引物序列为CGGTGGCTGTCAGTCAAAG(SEQ ID NO：3)，反向引物序列为AAACCTCGGCTTCCTCCATAA(SEQ IDNO：4))，通过ΔΔCt值法进行相对定量分析，结果见图2。

实验结果：

如图1所示，与正常组细胞相比，模型组细胞中α-平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白表达水平均升高，表明模型组细胞较多地向成纤维细胞样细胞转变。2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药组细胞的α-平滑肌肌动蛋白和纤连蛋白表达水平相较模型组降低，表明2″-O-没食子酰基金丝桃苷可以抑制肺上皮细胞向成纤维细胞样细胞的转变。

如图2所示，与正常组细胞相比，模型组细胞中I型胶原(COl1A1)和纤连蛋白(FN1)编码基因转录水平均升高，表明模型组细胞表达过量的细胞外基质。相较于模型组细胞，2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药组中I型胶原(COl1A1)基因和纤连蛋白(FN1)基因转录水平均下降，表明2″-O-没食子酰基金丝桃苷可以抑制TGF-β1诱导的肺上皮细胞间质转化模型中细胞外基质编码基因的转录。

实施例3. 2″-O-没食子酰基金丝桃苷对TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞活化模型中的药物活性评价

(1)实验采用人皮肤成纤维细胞(BJ)，分为5组，包括正常组、模型组和2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药组(称作化合物组，其药液以含0.5％血清的DMEM培养基稀释制备，药物浓度分别为100μM、50μM和25μM)。BJ细胞(2×10

(2)给药组用上述不同浓度的2″-O-没食子酰基金丝桃苷药液分别同细胞预孵育30分钟，其余组细胞同时加入等体积含0.5％血清的DMEM培养基。用含0.5％血清的DMEM培养基稀释TGF-β1，令其终浓度为25ng/mL，加入模型组和给药组细胞对应的孔中，刺激24小时，进行人皮肤成纤维细胞活化模型的构建，正常组细胞加入等体积的含0.5％血清的DMEM培养基。

(3)收集各组细胞样品，进行细胞外基质I型胶原(collagen)和纤连蛋白(fibronectin)表达水平的研究，具体操作包括：将细胞匀浆，使用SDS溶液裂解细胞，提取蛋白，用BCA法进行蛋白定量。蛋白样品(10μL/泳道)通过7.5％的SDS-PAGE胶分离，随后转印到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂牛奶室温封闭膜1小时，4℃下用一抗孵育过夜，清洗后用二抗室温下孵育1小时。用ECL Prime Western Blotting Detection Reagent进行曝光。用ImageJ软件进行灰度分析。结果见图3。

另取上述各组细胞样品，进行细胞外基质I型胶原(COL1A1)基因和纤连蛋白(FN1)基因的转录水平的研究，具体操作包括：使用RNA simple总RNA提取试剂盒提取细胞样品中的RNA。使用Nano Drop分光光度计检测RNA含量。使用HifairTMII 1st Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR试剂盒将RNA逆转录为cDNA。配制样品-引物-SYBR Green反应体系，使用qPCR仪扩增I型胶原(COL1A1)(正向引物序列为GAGGGCCAAGACGAAGACATC(SEQID NO：1)，反向引物序列为CAGATCACGTCATCGCACAAC(SEQ ID NO：2))和纤连蛋白(FN1)(正向引物序列为CGGTGGCTGTCAGTCAAAG(SEQ ID NO：3)，反向引物序列为AAACCTCGGCTTCCTCCATAA(SEQ ID NO：4))的编码基因，通过ΔΔCt值法进行相对定量分析，结果见图4。

实验结果：

如图3所示，与正常组细胞相比，模型组细胞中I型胶原(collagen)和纤连蛋白(fibronectin)表达水平均升高，表明模型组更多成纤维细胞活化并表达大量细胞外基质。相较于模型组细胞，2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药组细胞的I型胶原和纤连蛋白表达水平降低，表明2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药可以抑制皮肤成纤维细胞的活化并减少细胞外基质I型胶原(collagen)和纤连蛋白的表达。

如图4所示，与正常组细胞相比，模型组细胞中I型胶原和纤连蛋白编码基因转录水平均升高，表明模型组细胞表达过量的细胞外基质。相较于模型组细胞，2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药组中I型胶原和纤连蛋白转录水平均下降，表明2″-O-没食子酰基金丝桃苷给药可以抑制TGF-β1诱导的皮肤成纤维细胞活化模型中I型胶原(COL1A1)基因和纤连蛋白(FN1)基因的转录。

实施例4. 2″-O-没食子酰基金丝桃苷对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中药物活性评价

(1)实验动物采用8周龄雄性C57BL/6小鼠。采用随机分组的方法根据表1对其进行分组、建模及给药。通过腹腔注射舒泰将小鼠麻醉后，固定于操作台，向小鼠支气管中滴注博来霉素(0.85mg/kg)，建立肺纤维化模型。

(2)建模后第一天开始给药，化合物组小鼠进行100mg/kg的2″-O-没食子酰基金丝桃苷灌胃给药，尼达尼布组小鼠进行60mg/kg尼达尼布灌胃给药，每天给药一次。

(3)第28天利用CT对小鼠肺部成像，用以表征肺纤维化的情况，结果见图6。后安乐死小鼠，收集肺组织进行匀浆，使用RNA simple总RNA提取试剂盒提取组织样品中的RNA。使用Nano Drop分光光度计检测RNA含量。使用HifairTMII 1st Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR试剂盒将RNA逆转录为cDNA。配制样品-引物-SYBR Green反应体系，使用qPCR仪扩增I型胶原(Col1a1)(正向引物序列为GCTCCTCTTAGGGGCCACT(SEQ ID NO：5)，反向引物序列为ATTGGGGACCCTTAGGCCAT(SEQ ID NO：6))和纤连蛋白(Fn1)(正向引物序列为ATGTGGACCCCTCCTGATAGT(SEQ ID NO：7)，反向引物序列为GCCCAGTGATTTCAGCAAAGG(SEQ IDNO：8))的编码基因，通过ΔΔCt值法进行相对定量分析，结果见图7。

表1.博来霉素诱导的小鼠肺纤维化动物模型分组及处理情况

实验结果：

CT肺部成像结果如图6所示，正常组小鼠肺部CT影像颜色较深，模型组小鼠肺部CT影像颜色明显变浅，表明模型组小鼠肺组织密度变高，发生了肺纤维化。化合物组和尼达尼布组小鼠肺部CT影像颜色较模型组小鼠明显更深，表明口服2″-O-没食子酰基金丝桃苷和尼达尼布可以减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化程度。

如图7所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肺组织中I型胶原(Col1a1)和纤连蛋白(Fn1)编码基因转录水平均升高，表明模型组小鼠肺部细胞外基质过度累积。相较于模型组小鼠，化合物组和尼达尼布组小鼠肺组织中I型胶原和纤连蛋白转录水平均下降，表明口服2″-O-没食子酰基金丝桃苷可以改善肺部细胞外基质的过度累积。