四氢-β-咔啉酚类衍生物及其制备方法及应用、美白霜

技术领域

本发明涉及四氢-β-咔啉酚类衍生物及其制备方法及应用、美白霜的技术领域。

背景技术

随着人们对皮肤重视程度的上升，抗衰老和美白已成为众人关注的两大焦点。皮肤长期暴露于紫外线中，会产生大量的活性氧自由基，不仅加速皮肤衰老，还会促进酪氨酸酶表达形成大量黑色素，需要使用抗氧化剂，清除过量的自由基，防止皮肤过早老化和预防色素沉着病。

尽管具有抗氧化活性的物质多种多样，但分析这些物质的分子结构发现，大量的活性物都是酚类物质。天然来源的酚类物质大多是以植物提取物的形式引入化妆品中，存在成分复杂机理不明确、质量难以控制等问题，而人工合成的酚类物质在应用时可以有效的避免这些问题。因此，基于具有生理活性的天然产物分子结构进行设计和优化，通过化学合成得到具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的目标酚类衍生物，保证稳定的纯度和质量，是目前更安全有效的方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的提供四氢-β-咔啉酚类衍生物及其制备方法及应用、美白霜，具备抗氧化能力，有利于保证稳定的纯度和质量。

本发明通过下列技术方案来实现：

本发明四氢-β-咔啉酚类衍生物，其特征在于：所述四氢-β-咔啉酚类衍生物为以L-色氨酸乙酯盐酸盐为起点与不同羟基取代的苯甲醛反应得到的骨架结构一致，取代基团不同的六种四氢-β-咔啉酚类衍生物，所述的六种四氢-β-咔啉酚类衍生物分别为CL-a为(1S,3S)-1-(4-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-b为(1S,3S)-1-(3-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-c为(3S)-1-(2-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-d为(1S,3S)-1-(3,4-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-e为(1S,3S)-1-(3,5-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-f为(3S)-1-(2,5-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯。

一种所述四氢-β-咔啉酚类衍生物的制备方法，其特征在于所述四氢-β-咔啉酚类衍生物的制备方法是以溶剂为反应介质，以L-色氨酸乙酯盐酸盐为起点，升温，冷凝回流，反应至L-色氨酸乙酯盐酸盐转化完全，然后进行纯化即得到所述四氢-β-咔啉酚类衍生物；所述羟基取代包括间位羟基取代，邻位羟基取代，对位羟基取代，羟基取代的数量至少为一个；所述溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、冰醋酸中的至少一种。

所述升温的温度为75℃～90℃，较佳温度82℃，所述L-色氨酸乙酯盐酸盐与羟基取代的苯甲醛的摩尔比为1:1.0～1.3，较佳摩尔比为1:1.1。

所述纯化包括下列步骤(1)、(2)、(3)、(4)中的至少一种，

(1)将反应液抽滤，得到滤饼，将滤饼放入水中搅拌使其溶解，再用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，充分搅拌，有大量白色固体析出，再次减压抽滤，滤饼依次用饱和碳酸氢钠水溶液、水、异丙醇洗涤。将将滤饼干燥后使用甲醇重结晶，过滤，干燥，得到白色固体，即为最终产物四氢-β-咔啉酚类衍生物；

(2)将反应液抽滤，得到滤饼，将滤饼放入水中搅拌使其溶解，再用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，加入乙酸乙酯萃取，分液，有机相加入无水硫酸钠干燥和活性炭脱色，过滤，浓缩除去有机溶剂，得到白色固体，即为最终产物四氢-β-咔啉酚类衍生物；

(3)将反应液抽滤，得到滤饼，将滤饼放入水中搅拌使其溶解，再用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，过滤，滤饼依次使用水、甲醇洗涤。将滤饼放至烘箱内60℃干燥，得到白色固体，即为最终产物四氢-β-咔啉酚类衍生物；

(4)反应液减压浓缩除去溶剂，残余物先用乙酸乙酯溶解，依次加入用饱和碳酸氢钠溶液、水充分搅拌洗涤有机相，萃取分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩除去溶剂，通过硅胶柱层析分离得到白色固体，即为最终产物四氢-β-咔啉酚类衍生物。

在制备所述CL-a为(1S,3S)-1-(4-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯的方法中，反应物为所述L-色氨酸乙酯盐酸盐与对羟基取代的苯甲醛，所述L-色氨酸乙酯盐酸盐的分子结构式为

在制备所述的CL-b为(1S,3S)-1-(3-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯的方法中，反应物是所述L-色氨酸乙酯盐酸盐与间羟基取代的苯甲醛，所述的间羟基苯甲醛的分子结构式为

在制备所述的CL-c为(1S,3S)-1-(2-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯的方法中，反应物是所述L-色氨酸乙酯盐酸盐与邻位羟基取代的苯甲醛，所述的邻位羟基苯甲醛的分子结构式为

在制备所述的CL-d为(1S,3S)-1-(3,4-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯的方法中，反应物是所述L-色氨酸乙酯盐酸盐与间位羟基取代、对位羟基取代的苯甲醛即3,4-二羟基苯甲醛，所述的3,4-二羟基苯甲醛的分子结构式为

在制备所述的CL-e为(1S,3S)-1-(3,5-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯的方法中，反应物是所述L-色氨酸乙酯盐酸盐与间位二羟基取代的苯甲醛即3,5-二羟基苯甲醛，所述的3,5-二羟基苯甲醛的分子结构式为

在制备所述的CL-f为(1S,3S)-1-(2,5-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯的方法中，反应物是所述L-色氨酸乙酯盐酸盐与邻位羟基取代、间位羟基取代的苯甲醛即2,5-二羟基苯甲醛，所述的2,5-二羟基苯甲醛的分子结构式为

所述四氢-β-咔啉酚类衍生物用于美白产品，即将所制备的六种四氢-β-咔啉酚类衍生物作为有效的关键成分，添加入各种乳、霜或膏中的护肤品中，使其具备美白的效果。

一种美白霜，其特征在于：所述四氢-β-咔啉酚类衍生物作为美白添加剂而获得

本发明与现有技术相比，优点主要体现如下：

本发明的四氢-β-咔啉酚类衍生物CL-a为(1S,3S)-1-(4-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-b为(1S,3S)-1-(3-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-c为(3S)-1-(2-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-d为(1S,3S)-1-(3,4-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-e为(1S,3S)-1-(3,5-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，CL-f为(3S)-1-(2,5-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯；六种物质，均为四氢-β-咔啉酚类衍生物由L-色氨酸乙酯盐酸盐为起点与羟基取代苯甲醛反应得到，其与醛的缩合产物四氢-β-咔啉酚类衍生物具有很强的自由基清除能力。其具备抗氧化性能，将其作为有效的关键成分，添加入各种乳、霜、膏等护肤品中，使其具备了美白的效果。

酚类化合物在美容与皮肤病学的重要性主要来源于其抗氧化作用。在化妆品中加入抗氧化剂，可减少皮肤因过量活性氧造成的氧化损伤，是治疗和预防皮肤过早老化的良好选择，还向皮肤提供光保护作用，通过抗炎活性缓解皮肤的敏感状态。除此之外，抗氧化剂还用于防止或减少化妆品活性成分的氧化变质，并避免配方中的油性基质成分氧化。

本发明创造性地将L-色氨酸乙酯盐酸盐与羟基取代的苯甲醛发生缩合反应，在发生反应时，通过加入的乙腈影响产物的构型，促进缩合反应的进行。本发明获得了六种骨架结构一致取代基团不同的四氢-β-咔啉酚类衍生物，其能保留良好的抗氧化性能。

在DPPH自由基清除实验中，四氢-β-咔啉酚类衍生物(CL-a至CL-f的六种不同结构)均具有清除DPPH自由基的能力，对DPPH自由基的清除率随着浓度的增大而逐渐增大。四氢-β-咔啉酚类衍生物CL-a至CL-f中，抗氧化能力最强的是酚羟基位于苯环2,5位的衍生物CL-f，其IC50值为0.33mM，优于阳性对照α-生育酚(其IC50值为0.38mM)，该系列酚类衍生物抗氧化能力由强到弱的顺序依次为CL-f>CL-d>CL-c>CL-e>CL-a>CL-b。

黑色素是肤色的主要决定因素，它的形成主要发生在表皮底部的黑色素细胞中，涉及多种化学和酶促反应。而黑色素异常积累主要是因为皮肤暴露于紫外线中，产生了大量的活性氧ROS，刺激黑色素细胞通过酪氨酸酶的催化作用将L-酪氨酸转化为黑色素。因此，需要通过酪氨酸酶抑制剂来控制酪氨酸酶的表达，减少黑色素的积累，防止色素沉着病和提亮肤色。由于酚类物质的酚羟基不仅能与酶活中心的金属离子配位，还具有清除活性氧自由基的作用，同时分子中的共轭苯环能够吸收紫外线的辐射，所以酚类物质是酪氨酸酶抑制剂中占比最大的化合物之一。

在对四氢-β-咔啉酚类衍生物对酪氨酸酶活力的影响的实验中，对单酚酶抑制效果最好的是CL-d，其IC50为0.85mM，其次是CL-f和CL-a，IC50分别为1.59mM和1.72mM，抑制效果最弱的是CL-e、CL-b、CL-c，IC50分别为13.64mM、15.21mM、31.87mM。对双酚酶抑制活性最好的化合物是CL-d，IC50为0.46mM，其次是CL-f和CL-a，IC50分别为5.31mM和9.30mM，抑制效果最弱的是CL-e、CL-c、CL-b，IC50分别为30.42mM、35.63mM和38.70mM。

总之，本发明六种骨架结构一致取代基团不同的四氢-β-咔啉酚类衍生物制备方法即合成路线合理；本发明中四氢-β-咔啉酚类衍生物具有抗氧化性的活性是能够实现皮肤美白的关键；本发明通过实验体现出了四氢-β-咔啉酚类衍生物能够皮肤美白的实验结果和结论。

附图说明

图1为化合物CL-a的DPPH自由基清除效果图；

图2为化合物CL-b的DPPH自由基清除效果图；

图3为化合物CL-c的DPPH自由基清除效果图；

图4为化合物CL-d的DPPH自由基清除效果图；

图5为化合物CL-e的DPPH自由基清除效果图；

图6为化合物CL-f的DPPH自由基清除效果图。

图7为化合物CL-a的

图8为化合物CL-b的

图9为化合物CL-c的

图10为化合物CL-d的

图11为化合物CL-e的

图12为化合物CL-f的

具体实施方式

下面结合附图以及实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。显然，所描述的实施例仅用于阐明本发明的技术方案，并非全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下获得的所有其他实施例，仍在本发明的保护范围之内。

L-色氨酸，又称β-吲哚基丙氨酸，是人体必需的氨基酸之一。色氨酸作为一种有效的抗氧化剂，能够降低自由基的含量，抑制氧化应激状态下的脂质过氧化。

L-色氨酸乙酯盐酸盐分子中的盐酸起到自催化作用，提供酸性环境，使苯甲醛的羰基氧被质子化进而被底物分子中的氨基进攻发生缩合环化反应。

四氢-β-咔啉类化合物可由L-色氨酸衍生得到，是一种吲哚类生物碱，广泛存在于食品、植物和人体中，因其具有抗炎、抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等广泛的生物学或药理学活性而受到重视。

下面是本发明涉及到的相关物质的分子结构式：

四氢-β-咔啉的分子结构式：

L-色氨酸的分子结构式：

L-色氨酸乙酯盐酸盐的分子结构式：

本发明所制备的四氢-β-咔啉酚类衍生物是由羟基取代的苯甲醛分子中的羰基与L-色氨酸分子中的胺基发生缩合反应得到的。原料中L-色氨酸乙酯盐酸盐分子中的盐酸起到自催化作用，提供酸性环境，使苯甲醛的羰基氧被质子化进而被底物分子中的氨基进攻发生缩合环化反应。在盐酸盐的自催化下，反应生成的四氢-β-咔啉衍生物也是以盐酸盐的形式呈现的，

由于原料中只有羟基取代的苯甲醛的转化可由TLC监测，且L-色氨酸与产物的溶解性质差异大，易于除去，本发明实验时选择以L-色氨酸乙酯盐酸盐与羟基取代的苯甲醛在乙腈溶液中反应。

羟基取代的苯甲醛包括对羟基苯甲醛，分子结构式为

间羟基苯甲醛，分子结构式为

2-羟基苯甲醛，其分子结构式为

3,4-二羟基苯甲醛，其分子结构式为

3,5-二羟基苯甲醛，其分子结构式为

2,5-二羟基甲醛，其分子结构式为

在乙腈作为反应介质的测活体系中，反应生成六种不同的四氢-β-咔啉酚类衍生物为CL-a、CL-b、CL-c、CL-d、CL-e、CL-f。

通用化学式表述如下：

所述的CL-a为(1S,3S)-1-(4-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，其分子结构式为

CL-b为(1S,3S)-1-(3-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，其分子结构式为

CL-c为(3S)-1-(2-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，其分子结构式为

CL-d为(1S,3S)-1-(3,4-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，其分子结构式为

CL-e为(1S,3S)-1-(3,5-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，其分子结构式为

CL-f为(3S)-1-(2,5-二羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯，其分子结构式为

制备实施例1：

(1S,3S)-1-(4-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯(CL-a)的合成方法如下：

反应步骤:在100mL的圆底烧瓶中，加入5.36g(0.02mol)的L-色氨酸乙酯盐酸盐，2.69g(0.022mol)的对羟基苯甲醛、60mL乙腈，升温至82℃，冷凝回流，反应15h至L-色氨酸乙酯盐酸盐转化完全。

纯化步骤：将反应液减压抽滤，将滤饼加入200mL水中快速搅拌10min使其溶解，再用饱和碳酸氢钠溶液调节溶液的pH至8～9，充分搅拌30min，有大量白色固体析出，减压过滤，滤饼依次用饱和碳酸氢钠水溶液、水、异丙醇洗涤。将滤饼干燥后使用甲醇重结晶，过滤，干燥，得到白色固体4.11g，即为产物CL-a，收率为61.2％。

监测步骤：采用TLC监测反应进度，展开剂为V(二氯甲烷)：V(乙酸乙酯)：V(乙醇)＝30:10:1。

化合物CL-a的结构表征数据：

化合物CL-a的

制备实施例2:

(1S,3S)-1-(3-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯(CL-b)的合成方法如下：

反应步骤：同实施例1，区别在于反应物为间羟基苯甲醛，加入乙腈的体积为70mL，反应时间为7h。

纯化步骤：反应液减压抽滤，将滤饼加入150mL水中快速搅拌10min使其溶解，再用饱和碳酸氢钠溶液调节溶液的pH至8～9，充分搅拌30min，加入乙酸乙酯(100mL×3)萃取，分液，有机相加入无水硫酸钠干燥和活性炭脱色，过滤，浓缩除去有机溶剂，得到白色固体5.14g，即为产物CL-b，收率为76.5％。

监测步骤：同实施例1，展开剂为V(二氯甲烷)：V(乙酸乙酯)：V(乙醇)＝30:6:1。

化合物CL-b的结构表征数据：

化合物CL-b的

制备实施例3:

(3S)-1-(2-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯(CL-c)的合成方法如下：

反应步骤：同实施例1，区别在于反应物为2-羟基苯甲醛，加入乙腈的体积为50mL，反应时间为24h。

纯化步骤：反应液减压浓缩除去溶剂，残余物先用70mL乙酸乙酯溶解，依次加入用饱和碳酸氢钠溶液(70mL×3)、水70mL充分搅拌洗涤有机相，萃取分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩除去溶剂，通过硅胶柱层析分离得到白色固体3.49g，即为产物CL-c，收率为52.1％。

检测步骤：同实施1，区别在于：展开剂为V(石油醚)：V(二氯甲烷)：V(乙酸乙酯)＝3:1:1。

化合物CL-c的结构表征数据(由

CL-c的

制备实施例4:

(1S,3S)-1-(3,4-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯(CL-d)的合成方法如下：

反应步骤：同实施例2：区别在于反应物为3,4-二羟基苯甲醛，添加量为3.04g(0.022mol)，反应时间为10h。

纯化步骤：减压抽滤反应液，滤饼加入250mL水中快速搅拌20min，少量多次加入碳酸钠调节溶液的pH至8～9，充分搅拌30min，过滤，滤饼依次使用水、甲醇洗涤。将滤饼放至烘箱内60℃干燥，得到白色固体6.34g，即为产物CL-d，收率为90.6％。

检测步骤：同实施例1，区别在于：展开剂为V(二氯甲烷)：V(乙酸乙酯)：V(甲醇)＝20:20:2

化合物CL-d的结构表征数据：

化合物CL-d的

制备实施例5:

(1S,3S)-1-(3,5-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯(CL-e)的合成方法如下：

反应步骤：同实施例4，区别在于反应物为3,5-二羟基苯甲醛，反应时间为5h。

纯化步骤：同实施例2，得到白色固体4.5g，即为产物CL-e，收率为64.5％。

监测步骤：同实施例1，展开剂为V(二氯甲烷)：V(乙酸乙酯)：V(甲醇)＝20:20:2。

化合物CL-e的结构表征数据：

CL-e的

实施例6:

(3S)-1-(2,5-羟基苯基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]吲哚-3-甲酸乙酯(CL-f)的合成方法如下：

反应步骤：同实例4，区别在于反应物为3,5-二羟基苯甲醛，反应时间为20h。

纯化步骤：同实例3，得到白色固体3.52g，即为产物CL-f，收率为50.1％。

监测步骤：同实例1，采用TLC监测反应过程，展开剂V(石油醚)：V(二氯甲烷)：V(乙酸乙酯)＝3:2:2。

化合物CL-f的结构表征数据(由

CL-f的

效果实施例1：DPPH自由基清除能力测定。

以α-生育酚为阳性对照，确定以上制备的六种四氢-β-咔啉酚类衍生物清除DPPH自由基的能力，从而判定它们的抗氧化活性。

具体原理：稳定的DPPH自由基的醇溶液呈紫色，在波长517nm处具有最大吸收。当溶液中的自由基清除剂将氢原子或电子转移到DPPH自由基的具有单电子的氮原子上时，形成非自由基形式，导致吸光度成降低。因此，可以通过在波长517nm处检测吸光度的变化，来判断检测样品的抗氧化能力。

按照以下步骤测定样品溶液的DPPH自由基清除率：在96孔板中中进行试验：

(1)取一个孔板，加入浓度为0.3mmol/L的DPPH溶液150μL和50μL的DMSO为空白对照组，测得的吸光度值记为A

(2)取一个孔板，加入150μL的无水乙醇和50μL的DMSO为溶剂空白组，测得的吸光度值记为A

(3)取一个孔板，加入浓度为0.3mmol/L的DPPH溶液150μL和50μL样品溶液为样品组，测得的吸光度值记为A

(4)取一个孔板，加入150μL的无水乙醇与50μL样品溶液为样品空白组，测得的吸光度值,记为A

(5)在室温下避光反应45min后于517nm处测定反应体系的吸光度值，每组均设置三个复孔，取平均值由下式计算各效应物对DPPH自由基的清除率。

结果如图1～6所示。在实验浓度范围内，化合物CL-a至CL-f均具有清除DPPH自由基的能力，对DPPH自由基的清除率随着浓度的增大而逐渐增大。

与α-生育酚的浓度效应曲线类似，六种四氢-β-咔啉酚类衍生物的DPPH自由基清除能力随着浓度增长发生的变化也存在三个阶段：低浓度范围内的清除率快速增长阶段、浓度增加清除率增速降低的缓慢增长阶段、浓度增长清除率不再显著增长的相对稳定阶段。

化合物IC

将六种四氢-β-咔啉酚类衍生物为CL-a、CL-b、CL-c、CL-d、CL-e、CL-f值结果如下表1：四氢-β-咔啉酚类衍生物的IC

表1四氢-β-咔啉酚类衍生物的IC

由表1可知，四氢-β-咔啉酚类衍生物CL-a至CL-f中，抗氧化能力最强的是酚羟基位于苯环2,5位的衍生物CL-f，其IC50值为0.33mM，优于阳性对照α-生育酚，其IC50值为0.38mM。该系列酚类衍生物抗氧化能力由强到弱的顺序依次为CL-f>CL-d>CL-c>CL-e>CL-a>CL-b。

对于化合物CL-a与CL-b，虽然二者的IC

实验二：酪氨酸酶抑制活性测定。本发明所涉及的四氢-β-咔啉酚类衍生物对酪氨酸酶(单酚酶和双酚酶)的抑制效果：

酪氨酸酶是黑色形成的关键限速酶，具有两种催化活性——将L-酪氨酸氧化成多巴的单酚酶活性和将多巴进一步氧化成多巴醌的双酚酶活性。因此选择多巴速率氧化法测定化合物对酪氨酸单酚酶和酪氨酸双酚酶的抑制作用。该方法也是行业内对美白功效评价的常用方法。通过酪氨酸单酚酶和酪氨酸双酚酶的抑制活性来说明物质抑制黑色素的能力强弱；其半抑制浓度IC50越小，说明其抑制黑色素能力越强。抑制黑色素能力越强，化合物可防止皮肤色素沉着，美白效果更好。

具体操作步骤如下：

将样品用DMSO稀释成一定浓度梯度的溶液待用。

酪氨酸酶单酚酶活力测定以1mmol/L的L-酪氨酸溶液为底物，添加的酪氨酸酶溶液浓度为0.4mg/mL。

在96孔板中加入总体积为200μL的测活体系：先加入120μL的底物溶液和20μL不同浓度的样品溶液(样品浓度为0mmol/L时，添加20μL的DMSO作为空白对照)，再加入40μL的PBS缓冲溶液，于37℃下保温5min后，加入20μL对应浓度的酪氨酸酶溶液，快速混匀，立即放入酶标仪在37℃的恒定温度下于波长475nm处测定吸光度OD475随时间变化的曲线，连续监测20min(每隔1min扫描一次)，得到酪氨酸酶催化L-酪氨酸的酶反应动力学曲线。从酶反应动力学曲线直线部分外推与横轴的交点为迟滞时间，求得直线段斜率即为单酚酶活力(酶反应初速度)。每组实验设置三个复孔，取平均值通过下式计算获得相对酶活力。

相对酶活力的计算公式如下：

公式中：S1—实验组酶反应动力学曲线的斜率；S0—空白组酶反应动力学曲线的斜率。

IC50的计算方法：以相对酶活力对样品浓度作图，得到样品的浓度效应曲线。相对剩余活力为50％时对应的样品浓度即为半抑制浓度(IC50)(数据使用软件OriginPro 2022分析处理)。

酪氨酸酶双酚酶活力测活体系除底物溶液为0.5mmol/L的L-多巴溶液、添加的酪氨酸酶溶液浓度为0.2mg/mL外，其余溶液种类和添加量均与单酚酶测活体系相同。

样品对酪氨酸单酚酶和酪氨酸双酚酶半抑制浓度结果如表2所示：

表2四氢-β-咔啉酚类衍生物对酪氨酸单酚酶和酪氨酸双酚酶的半抑制浓度

由表2可以看出，对单酚酶抑制效果最好的是CL-d，IC50为0.85mM，其次是CL-f和CL-a，IC50分别为1.59mM和1.72mM，抑制效果最弱的是CL-e、CL-b、CL-c，IC50分别为13.64mM、15.21mM、31.87mM。对双酚酶抑制活性最好的化合物是CL-d，IC50为0.46mM，其次是CL-f和CL-a，IC50分别为5.31mM和9.30mM，抑制效果最弱的是CL-e、CL-c、CL-b，IC50分别为30.42mM、35.63mM和38.70mM。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。