可离子化脂质化合物及其在核酸递送领域的应用

技术领域

本发明涉及生物医药和药物制剂学领域，特别是一种可离子化脂质化合物及其在核酸递送领域的应用。

背景技术

核酸包括小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、质粒和免疫刺激性核酸等，可以通过多种作用机制发挥调控作用。以mRNA为例，在细胞质中，核糖体结合在mRNA分子上,将特定的核苷酸序列转换为氨基酸序列，它无需进入细胞核，因此不会带来基因突变的风险。mRNA药物本身具备诸多优势，包括研发周期短、抗原选择广泛、安全性高、低剂量、稳定表达等特点。然而从起效机制来看，mRNA药物面临着两个生物屏障。首先当核酸药物进入人体，由于分子量较大，分子被攻击破坏的位点较多，因此稳定性差，在体内容易被降解。此外mRNA本身负电性和亲水性极强，因此不易跨过细胞膜，体内递送效率极低。如何将mRNA有效地递送到细胞内是发挥其药效的关键技术。

现有技术的状况及不足：

目前，应用最为广泛和成熟的核酸药物递送技术为脂质纳米颗粒(LNP)，它可以保护核酸在体内不被迅速降解，延长循环时间，助力药物突破细胞外屏障和细胞内屏障从而发挥药效。LNP一般由四种组分构成，包括可离子化/阳离子脂质，PEG修饰的脂质，辅助磷脂以及胆固醇。其中，可离子化脂质在其中扮演着最重要的角色，该种化合物一方面可以有效的负载核酸药物，另一方面可以在特定的酸性环境中质子化，从而提高溶酶体逃逸的能力。可离子化脂质化合物仍旧是限制高性能LNP开发的主要制约因素。因此，开发一种新型、高效、低毒的可离子化脂质具有重要的应用价值。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可离子化脂质化合物及其在核酸递送领域的应用，本发明的化合物合成方法条件温和、合成路线产品产率较高的合成路线；本发明的化合物制备成的LNP具有高的溶酶体逃逸能力，核酸递送效率高，低毒安全性高，具有重要的应用价值。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

可离子化脂质化合物，为以下式(1)结构的化合物：

G1为吡啶、喹啉或其衍生物；

L1选自：

G2为以下式(2)、(3)的结构式：

其中，L2为C3-C9亚烷基；R1、R2各自独立的为C3-C9烷基；

G3为以下式(4)、(5)的结构式：

其中，L3为C3-C9亚烷基；R3、R4各自独立的为C3-C9烷基。

前述的可离子化脂质化合物，其-C(R1)R2或-C(R3)R4选自如下结构：

前述的可离子化脂质化合物，包括如下化合物：

前述的可离子化脂质化合物在核酸递送领域的应用，应用于包含阳离子脂质化合物的组合物、其立体异构体、其互变异构体或其在药学上可接受的盐.

前述的可离子化脂质化合物在核酸递送领域的应用，包含阳离子脂质化合物的组合物包括：核酸活性分子，包裹核酸活性分子的LNP，药物试剂。

前述的可离子化脂质化合物在核酸递送领域的应用，LNP按照质量百分比包括：一种或多种可电离的脂质化合物30-50％,辅助磷脂8-12％、胆固醇35-60％以及PEG脂质1-3％。

前述的一种阳离子脂质化合物的应用，辅助磷脂包括：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、(二油酰基卵磷脂)DOPC、(二棕榈酰磷脂酰胆碱)DPPC或(二油酰磷脂酰乙醇胺)DOPE中的一种或多种。

前述的一种阳离子脂质化合物的应用，PEG脂质包括：DMG-PEG2000或DSG-PEG2000中的一种或多种。

前述的一种阳离子脂质化合物的应用，核酸活性分子选自mRNA、siRNA、ASO、saRNA、miRNA、DNA。

前述的可离子化脂质化合物在核酸递送领域的应用，LNP的制备方法为：将可离子化脂质化学物、辅助磷脂、胆固醇和PEG脂质溶解在乙醇中，得到脂质乙醇液；通过器件混合，将所述脂质乙醇液与核酸水溶液混合，得到了包裹核酸的脂质纳米颗粒。

本发明的有益之处在于：

1.通过在改进可电离脂质氨基头部结构，引入了吡啶基团，得到了一类新型结构的可离子化脂质。

2.将该类可离子化脂质化合物与辅助磷脂、胆固醇以及PEG脂质组合可以得到尺寸均一、稳定性好的脂质纳米颗粒，同时可以高效稳定地包裹核酸活性分子。

3.相对于已商业化的SM102-LNP或MC3 LNP，本发明提出的含新型可离子化脂质化合物的LNP具有更高效的体外和体内细胞翻译表达水平，提升了核酸分子递送效率。

4.从小鼠实验可知本专利发明提出的含新型的吡啶基可离子化脂质的LNP对小鼠的毒副作用小，小鼠生存状态良好，安全性良好。

附图说明

图1 L-9-LNP/mRNA的冷冻电镜照片。

图2 L-1-LNP～L-5-LNP对DC2.4细胞的转染效率图。

图3 L-6-LNP～L-12-LNP对DC2.4细胞的转染效率图。

图4 L-13-LNP～L-19-LNP对DC2.4细胞的转染效率图。

图5 L-20-LNP～L-33-LNP对DC2.4细胞的转染效率图。

图6 是L-X-LNP与SM102 LNP在体内递送Fluc-mRNA的表达效率图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明内容作具体的介绍。

实施例1，脂质化合物L-1的合成

在圆底烧瓶中将化合物1-1(10mmol)溶于10ml DCM，依次将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，3.35g)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，1.64g)和化合物1-2(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物1-3。

在圆底烧瓶中将化合物1-4(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物1-5(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物1-6。

将化合物1-7(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物1-8。

将化合物1-8(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例2，脂质化合物L-2的合成

将化合物2-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物2-2。

将化合物2-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例3，脂质化合物L-3的合成

将化合物3-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物3-2。

将化合物3-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例4，脂质化合物L-4的合成

将化合物4-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物4-2。

将化合物4-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例5，脂质化合物L-5的合成

将化合物5-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物5-2。

将化合物5-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例6，脂质化合物L-6的合成

将化合物6-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物6-2。

将化合物6-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例7，脂质化合物L-7的合成

将化合物7-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物7-2。

将化合物7-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例8，脂质化合物L-8的合成

将化合物8-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物8-2。

将化合物8-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例9，脂质化合物L-9的合成

将化合物9-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物9-2。

将化合物9-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例10，脂质化合物L-10的合成

将化合物10-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物10-2。

将化合物10-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例11，脂质化合物L-11的合成

将化合物11-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物11-2。

将化合物11-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例12，脂质化合物L-12的合成

将化合物12-1(12mmol)，和化合物1-6(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物12-1。

将化合物12-1(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例13，脂质化合物L-13的合成

在圆底烧瓶中将化合物13-1(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物13-2(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物13-3。

将化合物6-1(12mmol)，和化合物13-3(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物13-4。

将化合物13-4(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例14，脂质化合物L-14的合成

在圆底烧瓶中将化合物1-4(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物14-1(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物14-2。

将化合物6-1(12mmol)，和化合物14-2(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物14-3。

将化合物14-3(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例15，脂质化合物L-15的合成

/>

在圆底烧瓶中将化合物1-1(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物1-5(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物15-1。

将化合物6-1(12mmol)，和化合物15-1(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物15-2。

将化合物15-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例16，脂质化合物L-16的合成

在圆底烧瓶中将化合物16-1(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物16-2(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物16-3。

将化合物6-1(12mmol)，和化合物16-3(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物16-4。

将化合物16-4(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例17，脂质化合物L-17的合成

在圆底烧瓶中将化合物13-1(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物17-1(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物17-2。

将化合物15-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例18，脂质化合物L-18的合成

在圆底烧瓶中将化合物16-1(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物18-1(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物18-2。

将化合物15-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例19，脂质化合物L-19的合成

在圆底烧瓶中将化合物19-1(10mmol)溶于10ml DCM，依次将EDCI(3.35g)，DMAP(1.64g)和化合物19-2(11mmol)加入反应体系，室温反应2小时之后过硅胶柱纯化，并通过旋蒸得到化合物19-3。

将化合物15-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例20，脂质化合物L-20的合成

将化合物15-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例21，脂质化合物L-21的合成

将化合物15-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例22，脂质化合物L-22的合成

将化合物15-2(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例23，脂质化合物L-23的合成

将化合物6-1(12mmol)，和化合物1-3(10mmol)加入乙腈溶液(100mL)溶液，并加入研磨的碳酸钾(4.5g)。将混合物在70℃搅拌3小时，之后将产物过滤去除碳酸钾，过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到化合物23-1。

将化合物23-1(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例24，脂质化合物L-24的合成

将化合物23-1(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例25，脂质化合物L-25的合成

将化合物23-1(1mmol)溶于乙腈(10ml)，室温搅拌。然后依次称取NaI(170mg)，K

实施例26，脂质化合物L-26的合成

取1mmol化合物3-1，2.4mmol化合物26-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-26(510mg,收率75.6％)。

实施例27，脂质化合物L-27的合成

取1mmol化合物3-1，2.4mmol化合物27-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-27(412mg,收率65.4％)。

实施例28，脂质化合物L-28的合成

取1mmol化合物3-1，2.4mmol化合物28-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-28(412mg,收率60％)。

实施例29，脂质化合物L-29的合成

取1mmol化合物3-1，2.4mmol化合物29-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-29(464mg,收率65％)。

实施例30，脂质化合物L-30的合成

取1mmol化合物1-7，2.4mmol化合物28-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-30(510mg,收率74.2％)。

实施例31，脂质化合物L-31的合成

取1mmol化合物2-1，2.4mmol化合物28-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-31(500mg,收率72.7％)。

实施例32，脂质化合物L-32的合成

取1mmol化合物4-1，2.4mmol化合物28-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-32(490mg,收率71.3％)。

实施例33，脂质化合物L-33的合成

取1mmol化合物5-1，2.4mmol化合物28-1，加入到聚四氟乙烯内衬的玻璃螺旋盖小瓶中，并加入2ml ACN溶剂混合均匀之后，在70℃水热反应48小时。过硅胶柱纯化后，用旋转蒸发仪去除溶剂得到脂质化合物L-33(440mg,收率59.7％)。

实施例34 LNP脂质纳米颗粒的制备

将可离子化脂质L-X(X＝1～33)或SM102,DSPC，胆固醇以及DMG-PEG 2000，按照摩尔比50：10：38.5：1.5溶解于乙醇溶液中,总脂质浓度12mM。将含有萤火虫荧光素酶(luciferase)或绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的mRNA，按照N:P＝6:1(可离子化脂质和mRNA的质量比为6:1)溶解于pH＝4.5的柠檬酸-柠檬酸铵缓冲液中。使用微流控设备将乙醇脂质溶液和mRNA缓冲液按照体积比1：3混合。将收集得到的产品放入透析袋中(截留分子量100KDa)在pH＝7.4的PBS中透析12小时，随后用超滤管将mRNA-LNP浓缩，并用1XPBS将mRNA定容至150μg/ml，冷冻保存。

试验例：

实验一

实验名称：L-X-LNP及SM102对照品粒径包封率表征测定

实验材料：实施例34制备得到eGFP mRNA-LNP

实验过程：1)粒径分析测试：用规格为10mm×10mm×40mm的石英比色皿做样品皿，用DLS测试样品溶液的粒径大小及分布，测试连续测试2次，间隔30s，最终取两次测试的平均值做最终数据。3)mRNA包封率测定：使用Quant-it

实验结果：如表2～6所示，本发明所制备的L-X-LNP(X＝1～33)具有较窄的粒径分布，尺寸大小满足理想的纳米疫苗尺寸。同时得益于可离子化脂质在酸性缓冲液中，可以很好地负载mRNA，因此所制备的eGFP mRNA-LNP具有较高的mRNA包封率。同时，以L-9-LNP为例，如图1所示，制备得到的mRNA/L-9-LNP具有规则的颗粒形貌。

表格1

表格2

表格3

表格4

表格5

实验二

实验名称：体外mRNA的翻译表达评估实验

实验材料：实施例34制备得到eGFP mRNA-LNP

实验过程：将DC2.4细胞分别用RPMI 1640培养基辅以10％(V/V)胎牛血清FBS(Gibco)、1％(V/V)P/S抗体培养至对数生长期。将细胞以每孔100000的数量接种到24孔板中，并用含有2μg eGFP mRNA的L-X-LNP进行转染。转染24小时之后，吸去细胞培养基，用PBS缓慢轻柔地洗涤一次，之后用流式细胞仪分析各组的阳性细胞比率。

实验结果：首先我们考量了吡啶取代基团所在位置对转染效率的影响，如图2所示，对位取代具有最高的转染效率。而相对来说临位取代的转染效率较低，这可能是由于空间位阻的原因导致的。接着我们进一步研究了连接片段L1的影响，如图3所示对连接片段进行侧链取代会降低转染效率。然后我们进一步研究了不同结构的疏水尾巴对体外细胞转染效率的影响，如图4所示，酯键前后疏水片段长度对细胞转染效率影响并不大。同时，我们还考量了不同数量的疏水尾巴对转染效率的影响，如图5所示，4条疏水尾巴的LNP转染效率明显高于2条疏水尾巴的LNP，这可能是由于疏水片段的增加可以提高LNP与细胞膜的相互作用力。相对于商用的SM102-LNP，本专利发明提出的含新型的吡啶基可离子化脂质的LNP，对于细胞的转染效率显著提升。

实验三：

实验名称：小鼠体内萤火虫萤光素酶mRNA的表达评估实验

实验材料：实施例34制备得到luc mRNA-LNP

实验过程：分别在4-6周的BALB/c小鼠的尾根部皮下注射20μg不同递送载体的Luc-mRNA。在给药8小时之后，将体积为100μL浓度为15mg/ml的luciferin腹膜注射。10分钟之后，用IVIS小鼠活体成像仪(PerkinElmer)观察荧光信号的分布。

实验结果：为了直接评估不同L-X-LNP递药系统在小鼠体内的翻译表达效率，我们采用不同递药系统包裹Luc-mRNA。如图6所示，相对于商用的SM102-LNP，本专利发明提出的含新型的吡啶基可离子化脂质的LNP，可以显著提升mRNA编码抗原在体内的高效表达。同时，含新型的吡啶基可离子化脂质的LNP的毒副作用不明显，小鼠生存状态良好，安全性良好。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。