一种检测Aβ寡聚体的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于特异性分子识别材料领域，特别涉及一种检测Aβ寡聚体的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

到目前为止，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种无法治愈的神经退行性疾病，具有进行性认知障碍和行为障碍。细胞外错折叠的β淀粉样蛋白斑块和细胞内微管蛋白结合(tau)蛋白缠结是AD的主要病理特征。近年来，全球各大制药巨头投入巨资研发抗AD药物，由于其病理机制复杂，AD药物研发多以未到达主要疗效告终。同时AD患者确诊时已为晚期，因而大多数疗法均无效。所以，提高AD的诊断水平对于AD早期治疗和对其病理机制的了解都具有重要的意义。

荧光探针是检测复杂生物标志物的省时省力的方法。目前，AD上的荧光探针通常用于检测Aβ斑块和tau蛋白，例如花青衍生物，BODIPY衍生物，姜黄素衍生物和吲哚花青绿色衍生物。

Aβ寡聚体是阿尔茨海默症诊早期诊断和治疗的有效靶标，但是由于靶向Aβ寡聚体分子的策略不明确，如今能够有力检测Aβ的荧光探针寥寥可数。

因此，研发具有特异性结合Aβ寡聚体的分子探针引人关注。结合Aβ荧光探针和分子成像技术进行Aβ斑块的显像，可实现无创的、实时的Aβ斑块的体内示踪和检测，进而为AD等疾病患者进行早期诊断、疗效检测以及治疗药物的研究等提供极大便利。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测Aβ寡聚体的荧光探针。

本发明的另一目的在于提供所述检测Aβ寡聚体的荧光探针的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述检测Aβ寡聚体的荧光探针的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测Aβ寡聚体的荧光探针，其结构通式如式(I)所示：

所述的检测Aβ寡聚体的荧光探针的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)制备中间体1

①将对羟基苯甲醛、N-乙酰甘氨酸和乙酸钠(作为催化剂)加入到有机溶剂中混合均匀，然后加热至110±5℃进行回流反应，待反应结束后加入乙醇冷却至室温析出晶体，过滤，洗涤，得到黄色固体；

②将黄色固体、甲胺水溶液和碳酸钾(作为催化剂)加入到有机溶剂中，加热至80±5℃进行回流反应，待反应结束后冷却至室温，并调节pH值至中性，再降温析出固体，过滤，干燥，得到中间体1；其结构式如式(II)所示：

(2)制备中间体2

将中间体1溶于有机溶剂中，加入三溴化硼二氯甲烷溶液，在保护性气体氛围下，加热至110±5℃进行回流反应，待反应结束后冷却、过滤、洗涤，然后加入氟化氢(HF)溶液搅拌均匀，再依次用乙酸乙酯、碳酸钾溶液和水萃取，浓缩、纯化，得到中间体2；其结构式如式(III)所示：

(3)制备荧光探针

将中间体2、对二甲氨基苯甲醛和哌啶(作为催化剂)加入到有机溶剂中，在100±5℃条件下进行反应，待反应结束后浓缩、洗涤、纯化，得到所述检测Aβ寡聚体的荧光探针。

步骤(1)①中所述的对羟基苯甲醛，N-乙酰甘氨酸和乙酸钠的摩尔比为1：0.9～1.1:0.7～1.3；优选为1:1:0.9。

步骤(1)①中所述的有机溶剂优选为乙酸酐。

步骤(1)①中所述的有机溶剂的用为按每摩尔对羟基苯甲醛配比1L有机溶剂计算。

步骤(1)①中所述的回流反应的时间为3～5h；优选为4h。

步骤(1)①中所述的加入的乙醇的温度为50～60℃；优选为50℃。

步骤(1)①中所述的析出晶体的时间为3～5h；优选为4h。

步骤(1)①中所述的洗涤为依次用冰乙醇和热水进行洗涤。

步骤(1)②中所述的黄色固体、碳酸钾和甲胺的摩尔比为1：1.5：4。

步骤(1)②中所述的甲胺水溶液的浓度为体积百分比33％。

步骤(1)②中所述的有机溶剂优选为乙醇。

步骤(1)②中所述的甲胺水溶液与有机溶剂的体积比为1:1。

步骤(1)②中所述的回流反应的时间为2～3h；优选为2.5h。

步骤(1)②中所述的调节pH值为采用HCl乙醇溶液进行调节；优选为采用体积百分比10％的HCl乙醇溶液进行调节。

步骤(1)②中所述的降温为将至0℃。

步骤(2)中所述的中间体1和三溴化硼二氯甲烷的摩尔比为1:1.1～2；优选为1:2。

步骤(2)中所述的有机溶剂为二氯乙烷。

步骤(2)中所述的有机溶剂的用量为按每毫摩尔(mmol)中间体1配比1～2mL有机溶剂计算；优选为按每毫摩尔中间体1配比1.33mL有机溶剂计算。

步骤(2)中所述的保护性气体为氮气。

步骤(2)中所述的回流反应的时间为6～8h；优选为7h。

步骤(2)中所述的氟化氢(HF)溶液的浓度为质量百分比48％～55％。

步骤(2)中所述的氟化氢溶液的用量为按每毫摩尔(mmol)中间体1配比3～5mL氟化氢溶液计算；优选为按每毫摩尔中间体1配比3.33mL氟化氢溶液计算。

步骤(2)中所述的搅拌的时间为20～30min；优选为30min。

步骤(2)中所述的碳酸钾溶液的浓度为质量百分比5％。

步骤(2)和(3)中所述的纯化为采用柱层析进行纯化；其柱层析条件为：三氯甲烷与乙醇的体积比(CHCl

步骤(3)中所述的中间体2、对二甲氨基苯甲醛和哌啶的摩尔比为1:5:1.2～1.5；优选为1:5:1.25。

步骤(3)中所述的有机溶剂为吡啶。

步骤(3)中所述的有机溶剂用为按每摩尔中间体2配比25mL有机溶剂计算。

步骤(3)中所述的反应的时间为2～5min；优选为3min。

步骤(3)中所述的洗涤为采用乙酸乙酯进行洗涤；优选为采用乙酸乙酯洗涤3～5次；更优选为采用乙酸乙酯洗涤4次。

所述的检测Aβ寡聚体的荧光探针在制备用于诊断阿尔茨海默氏病(AD)的产品中的应用。

所述的产品包括荧光探针，检测(诊断)试剂及试剂盒等。

所述的检测Aβ寡聚体的荧光探针在制备治疗阿尔茨海默氏病(AD)的药物中的应用。

所述的检测Aβ寡聚体的荧光探针在制备用于检测β-淀粉样蛋白的产品中的应用。

所述的产品包括荧光探针，检测(诊断)试剂及试剂盒等。

所述的β-淀粉样蛋白为Aβ寡聚体。

所述的检测包括定量检测Aβ寡聚体。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一种检测Aβ寡聚体的荧光探针，该荧光探针的合成只需要三步，并且后处理过程简单，易于操作，产物易得，在阿尔茨海默症的早期诊断和病理机制的揭示方面具有广阔的应用前景。

(2)本发明中的荧光探针能灵敏检测Aβ寡聚体并成像Aβ斑块。

(3)本发明为基于绿色荧光蛋白发色团设计的开关型探针，能用于β-淀粉样蛋白斑块成像且灵敏度高。

附图说明

图1是本发明荧光探针制备方法的合成路线图(图中，1和2分别表示中间体1和中间体2；a：①对羟基苯甲醛，N-乙酰甘氨酸，醋酸钠，乙酸酐，110℃回流4h；②碳酸钾，甲胺/水，乙醇，回流2.5h；b：二氯乙烷，三溴化硼/二氯甲烷，110℃回流7小时；c：4-二甲基氨基苯甲醛，吡啶，哌啶，100℃)。

图2是本发明实施例1所得探针(I)的

图3是本发明实施例1所得探针(I)的

图4是本发明实施例1所得探针(I)的HRMS谱图。

图5是本发明实施例1所得探针(I)与Aβ蛋白的结合能力的评价结果图；其中，A为探针(I)在DMSO中的紫外-荧光图谱；B为探针(I)对Aβ蛋白的特异性结果；C和D为探针(I)的选择性结果；E为滴定结果；F为结合常数。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。以下实施例对于未特别注明的参数，可参照常规技术进行。

本发明实施例中，核磁谱采用德国Bruker公司Avance III 400MHz(600MHz)核磁共振仪测定，氘代氯仿，氘代甲醇或氘代DMSO做溶剂。荧光光谱采用日本日立公司FL-4500荧光光谱仪测定。

实施例1合成有机小分子荧光探针(I)

本实施例的一种有机小分子荧光探针(I)的合成，合成路线图如图1所示，具体合成步骤如下：

(1)合成中间体1

①将反应物对羟基苯甲醛(0.02mol,2.44g)，N-乙酰甘氨酸(0.02mol，2.34g),无水醋酸钠(0.018mmol,1.47g)和乙酸酐20mL混合均匀，然后加热搅拌110℃回流4h，待反应完成后缓慢加入加热(50℃)后的乙醇，反应液降至室温，冷却4h，析出晶体，过滤，冰乙醇洗涤，再用热水洗涤得到黄色固体，干燥后得3.64g。

②在75mL容量瓶中将黄色固体(0.01mol,2.03g)，碳酸钾(0.015mol,2.07g)，33％(v/v)甲胺水溶液4mL和4mL乙醇混合，反应液加热(80℃)回流2.5h，反应完成后冷却至室温，反应液pH使用10％(v/v)HCl乙醇溶液调至中性，0℃冷却析晶4h，固体过滤即得淡黄色固体，干燥得1.43g中间体1(结构式如式(II)所示)，产率为66.20％。

(2)合成中间体2

将中间体1(3mmol,648mg)溶于干燥的二氯乙烷4mL，然后加入6mL1mol/L的三溴化硼二氯甲烷溶液，反应在氮气中加热(110℃)回流7h，完成后冷却、分子筛过滤，依次用乙醇和二氯乙烷洗涤，然后加入10mL氟化氢(HF)水溶液(48％～55％，w/w)，搅拌30min之后依次用乙酸乙酯、用5％(w/v)碳酸钾溶液以及水分别萃取2次，浓缩过柱(柱层析：CHCl

(3)合成有机小分子荧光探针(I)

将中间体2(0.4mmol,105mg)、对二甲氨基苯甲醛(2mmol,300mg)和哌啶(0.05mL)溶于10mL吡啶中，反应物在100℃反应3min后，浓缩反应液。将粗产物用乙酸乙酯洗涤(4×10mL)，然后进行柱层析(CHCl

合成的有机小分子荧光探针的

实施例2有机小分子荧光探针(I)的紫外-荧光试验

将实施例1制备的探针(I)溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制10mM的母液；然后取3μL10mM母液溶于3mL DMSO中，得到10μM的探针溶液。在紫外分光光度计下测试紫外吸收光谱和记录最大吸收波长。在荧光分光光度计下测试荧光光谱和记录最大发射波长。

结果如图5A所示：10μM的探针(I)在DMSO溶液中最大吸收波长为546nm，最大发射波长为650nm，Stokes位移为104nm。

实施例3有机小分子荧光探针(I)与Aβ蛋白的结合能力的评价

荧光滴定光谱测定：在PBS缓冲液(pH＝7.4,10mM)中加入适量的100μM的Aβ蛋白(Aβ单体，Aβ寡聚体和Aβ聚集体，购于上海强耀生物)溶液，总体积为600μL，保持探针(I)的(实施例1制备)浓度为1μM不变，蛋白浓度为10μM，在荧光分光光度计下测试其荧光光谱，进行数据处理。荧光分光光度计的参数为：工作电压700V，外狭缝＝10nm,电磁狭缝＝10nm。

结果如图5B所示：相比于Aβ单体和Aβ聚集体，探针(I)与Aβ寡聚体结合后，荧光强度显著增加。

实施例4有机小分子荧光探针(I)的选择性评价

荧光滴定光谱测定：在PBS缓冲液(pH＝7.4,10mM)中加入Aβ寡聚体(上海强耀生物)，再分别加入不同的金属离子(K

结果如图5C和5D所示：相比于Aβ寡聚体，探针(I)与不同的金属离子和各种氨基酸结合后，荧光轻度前后几乎没有变化，探针(I)展现出的良好选择性。

实施例5有机小分子荧光探针(I)与Aβ寡聚体的滴定试验

荧光滴定光谱测定：在PBS缓冲液(pH＝7.4,10mM)中加入不同体积的100μM的Aβ寡聚体蛋白(上海强耀生物)溶液，总体积为600μL，保持探针(I)的(实施例1制备)浓度为1μM不变，蛋白浓度由0μM提高至5μM，在荧光分光光度计下测试其荧光光谱，进行数据处理。荧光分光光度计的参数为：工作电压700V，外狭缝＝10nm，电磁狭缝＝10nm。

结果如图5E所示：在逐渐加大Aβ寡聚体浓度的情况下，荧光强度逐渐增加。在Aβ寡聚体浓度在0～5μM范围内，探针(I)的荧光强度与Aβ寡聚体的浓度呈线性关系，线性相关系数(R)为0.9906，说明探针(I)可用于Aβ寡聚体的定量检测。

实施例6有机小分子荧光探针(I)的体外饱和结合测试

体外结合常数的测试使用饱和结合法测定：在荧光酶标板中加入PBS缓冲溶液(pH＝7.4,10mM)，然后每个孔加入4μL的100μM的Aβ寡聚体蛋白溶液(上海强耀生物；蛋白终浓度为2μM)，继续加入终浓度为0μM～4μM的不同浓度的有机小分子荧光探针(I)(实施例1制备)，确定各孔溶液的终体积为200μL。将上述方法所配制的混合溶液在多功能微孔检测设备中扫描，记录其最大发射波长处的荧光值。结合常数Kd值运用GraphPad Prism 8.0.1(GraphPad Software,Inc,USA)计算得到。

结果如图5F所示：探针(I)的体外结合常数(Kd)为88.16nM。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。