一种超耐热葡葡糖氧化酶AtGOD及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种超耐热葡葡糖氧化酶

背景技术

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, E.C.1.1.3.4)广泛来源于植物和微生物中。微生物种类多，易于培养，因此微生物是葡萄糖氧化酶的主要来源。据文献报道，葡萄糖氧化酶大多数来源于真菌，主要为曲霉属和青霉属。除微生物来源之外，在蜜蜂、烟青虫、棉铃虫、甜菜夜蛾和蓓带夜蛾分泌的唾液中、蚱蜢的表皮角质层中均可检测到葡萄糖氧化酶的酶活性，可起到抵御有害真菌和细菌的作用。

葡萄糖氧化酶是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin Adenine Denucleotide,FAD)依赖型氧化酶，可专一性催化β-D-葡萄糖，对其它的糖类几乎没有催化活性，大多数为同型二聚体，分子质量在160 kDa左右。葡萄糖氧化酶易溶于水，不易溶解于甘油、丁醇、氯仿、吡啶、乙醚等有机试剂，受Cu

葡萄糖氧化酶作为一种新型饲用酶制剂，在动物饲料中的应用前景十分广阔。饲用葡萄糖氧化酶应具有良好的热稳定性，才能满足饲料制粒加工过程中的耐热需求和在动物胃液环境中发挥功能的耐酸需求。饲料中添加的多种维生素、胡萝卜素及油脂等物质易被空气中的氧气氧化，从而降低饲料中的营养价值及适口性，甚至导致饲料酸败变质，产生对动物有害的过氧化物。在饲料中添加安全、高效的氧化剂，可有效避免其不利影响，提高饲料的利用率，保护动物机体健康。葡萄糖氧化酶作为一种抗氧化剂，是一种替代抗生素的新型饲料添加剂，属于12种允许使用的饲料添加剂之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种超耐热的葡萄糖氧化酶

本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶的编码基因

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶基因

本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶基因

本发明的再一目的是提供一种制备葡萄糖氧化酶的基因工程方法。

本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶的应用。

根据本发明的具体实施方式，从土曲霉

本发明提供了编码上述葡萄糖氧化酶的编码基因

本发明提供了包含上述化葡萄糖氧化酶基因

本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化至毕赤酵母GS115细胞，得到重组菌株GS115/

根据本发明的具体实施方式，制备超耐热葡萄糖氧化酶

(1) 用含有超耐热葡萄糖氧化酶

(2) 培养重组菌株，诱导重组葡萄糖氧化酶

(3) 回收并纯化所表达的葡萄糖氧化酶

本发明还提供了编码上述超耐热葡萄糖氧化酶

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一超耐热葡萄糖氧化酶基因

本发明还提供了包含上述超耐热葡萄糖氧化酶

本发明还提供了上述超耐热葡萄糖氧化酶

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等工业中应用的新型葡萄糖氧化酶。本发明获得一种超耐热葡萄糖氧化酶

附图说明

图1显示本发明的葡萄糖氧化酶及其序列近似的葡萄糖氧化酶的比活分析结果；

图2显示本发明的葡萄糖氧化酶及其序列近似的葡萄糖氧化酶在90℃热稳定性分析结果；

图3显示本发明的葡萄糖氧化酶及其序列近似的葡萄糖氧化酶在100℃热稳定性分析结果；

图4显示本申请的超耐热葡萄糖氧化酶

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(

2、酶类及其它生化试剂：连接酶购自Invitrogen公司，定点突变试剂盒购自全式金公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

(1)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1% NaCl，pH7.O)。

(2) BMGY培养基；1%酵母粉，2%蛋白胨，1.34% YNB，0.000049< Biotin，1% 甘油(v/v)。

(3) BMMY培养基：以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J．萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 超耐热葡萄糖氧化酶

提取嗜热土曲霉

分别以上述基因组DNA和总RNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为：95℃变性5 min；94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸5 min，25个循环，4℃保温10 min。得到一约1800 bp片段，将该片段回收后与pEazy-T3载体相连送华大基因测序公司测序。

实施例2 超耐热葡萄糖氧化酶

将表达载体pPIC9进行双酶切 (

实施例3 超耐热重组葡萄糖氧化酶的制备

（1）葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出热稳定性好、酶活性较高的转化子，接种于300 mL BMGY液体培养基的1 L三角瓶中，30°C，220 rpm摇床振荡培养48 h；4500 rpm离心5 min，弃上清，再向菌体加入200 mL含有0.5%甲醇的BMMY液体培养基，30°C，220 rpm诱导培养48 h。诱导培养期间，间隔24 h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5%左右；12000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

（2）超耐热重组葡萄糖氧化酶的纯化

收集摇瓶发酵培养的超耐热重组葡萄糖氧化酶上清液，利用10 kDa膜包进行发酵液的浓缩，同时用pH 6.5 10 mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液置换其中的培养基，然后通过阴离子交换柱来进行纯化。

实施例4 测定纯化的葡萄糖氧化酶突变体的酶学性质

采用邻联茴香胺法对葡萄糖氧化酶GOD酶活性进行测定，具体方法如下：在pH 6.0的条件下，3mL的反应体系包括2.5mL邻联茴香胺缓冲液 (0.2 mL的1％邻联茴香胺加入25m的0.1M磷酸缓冲液中)，300μL 18％葡萄糖溶液，100μL 0.03％辣根过氧化物酶，100μL适当的稀释酶液。在30℃下反应3min后，用2mL 2M H

测定超耐热葡萄糖氧化酶

1、测定超耐热葡萄糖氧化酶

2、测定超耐热葡萄糖氧化酶

在0.1 M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)缓冲液体系中，超耐热葡萄糖氧化酶

实施例5 重组葡萄糖氧化酶

葡萄糖氧化酶

该葡萄糖氧化酶

对二者之间的三个差异氨基酸功能分别进行分析。

(1)将本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

(2)将本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

(3)将本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

(4)将本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

(5)将本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

(6) 本发明的将超耐热葡萄糖氧化酶

如图1所示，突变体Val41Thr、Cys126Gln、His520Arg、Val41Thr/Cys126Gln、Val41Thr/His520Arg、Cys126Gln/His520Arg在pH 6.0、30℃下的酶活分别为68.4 U/mg、68.0 U/mg、52.8 U/mg、61.6 U/mg、68.4 U/mg、83.7 U/mg、51.3 U/mg，本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

如图2所示，突变体Val41Thr、Cys126Gln、His520Arg、Val41Thr/Cys126Gln、Val41Thr/His520Arg、Cys126Gln/His520Arg在90℃下处理2min后的剩余酶活分别为82.8%、75.1%、87.3%、72.55%、89.5%、80.3%，本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

如图3所示，突变体Val41Thr、Cys126Gln、His520Arg、Val41Thr/Cys126Gln、Val41Thr/His520Arg、Cys126Gln/His520Arg在100℃下处理2min后的剩余酶活分别为25.6%、35.2%、48.7%、17.6%、39.6%、48.1%，本发明的超耐热葡萄糖氧化酶

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种超耐热葡葡糖氧化酶AtGOD及其基因和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 594

<212> PRT

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 1

Ala Leu Pro Lys Phe Pro Arg Asp His Leu Gly Val Glu Pro Gln Leu

1 5 10 15

Leu Thr Asp Pro Thr Val Leu Ala Asn Thr Thr Val Asp Tyr Ile Ile

20 25 30

Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Val Val Ala Ala Arg Leu Thr Glu

35 40 45

Asp Pro Asn Ile Lys Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Tyr Phe Glu Ser

50 55 60

Asn Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Arg Tyr Gly Glu Ile Phe

65 70 75 80

Gly Thr Glu Val Asp His Ala Phe Glu Thr Val Gln Leu Ala Val Asn

85 90 95

Asn Arg Thr Glu Ile Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr

100 105 110

Leu Ile Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro His Lys Val Cys Val Asp

115 120 125

Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Gln Gly Trp Asn Trp Asp Asp Leu

130 135 140

Leu Pro Tyr Met Leu Lys Ile Glu Lys Ala Arg Pro Pro Asn Gln Arg

145 150 155 160

Gln Ile Glu Ala Gly His Tyr Phe Asn Pro Gln Cys His Gly Phe Asn

165 170 175

Gly Ser Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Glu Pro Tyr Ser Pro

180 185 190

Ile Met Arg Ala Leu Met Asp Thr Val Ser Ala Glu Gly Val Pro Val

195 200 205

Arg Lys Asp Leu Cys Cys Gly Asp Pro His Gly Val Ser Met Phe Leu

210 215 220

Asn Thr Leu Tyr Pro Ser Gln Ile Arg Ala Asp Ala Ala Arg Glu Tyr

225 230 235 240

Leu Val Pro Asn Tyr His Arg Pro Asn Phe Gln Val Leu Thr Gly Gln

245 250 255

Arg Val Gly Lys Val Leu Leu Asp Lys Thr Val Pro Gly Ser Pro Lys

260 265 270

Ala Ile Gly Val Glu Phe Gly Thr His Arg Thr Arg Lys Tyr Glu Ala

275 280 285

Tyr Ala Arg Arg Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly Ser Thr Ile Ser Pro

290 295 300

Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys Ser Val Leu Asp Ser

305 310 315 320

Val Gly Ile Glu Gln Val Val Glu Leu Pro Val Gly Val Asn Leu Gln

325 330 335

Asp Gln Thr Thr Leu His Val Glu Ser Arg Ile Thr Pro Ala Gly Ala

340 345 350

Gly Gln Gly Gln Ala Ala Tyr Phe Ala Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly

355 360 365

Asp Phe Ala Pro Gln Ala His Glu Leu Leu Asn Thr Lys Leu Asp Gln

370 375 380

Trp Ala Glu Glu Val Val Ala Arg Gly Gly Phe His Asn Ala Thr Ala

385 390 395 400

Leu Arg Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asn Trp Leu Val Asn Asn Asn

405 410 415

Val Ala Phe Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala Gly Lys Ile Ser Phe

420 425 430

Asp Val Trp Asp Leu Ile Pro Phe Thr Arg Gly Tyr Val His Ile Ala

435 440 445

Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg Arg Leu Tyr Asn Asn Pro Gln Tyr Phe

450 455 460

Leu Asn Glu Leu Asp Val Leu Gly Glu Ala Ala Ala Ser Lys Leu Ala

465 470 475 480

Arg Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ala Met Ala Gln Tyr Tyr Ala Gly Glu

485 490 495

Thr Val Pro Gly Phe Asp Gln Leu Pro Ala Asp Ala Ser Leu Arg Asp

500 505 510

Trp Ala Lys Tyr Val Lys Asp His Phe Arg Pro Asn Tyr His Ala Val

515 520 525

Ser Thr Cys Ala Met Met Ser Lys Glu Leu Gly Gly Val Val Asp Ser

530 535 540

Ala Ala Arg Val Tyr Asp Val Glu Arg Leu Arg Val Val Asp Gly Ser

545 550 555 560

Ile Pro Pro Thr Gln Val Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Gly

565 570 575

Met Ala Glu Lys Ile Ala Glu Ala Ile Leu Gln Asp Tyr His Ala Arg

580 585 590

Lys Ala

<210> 2

<211> 1785

<212> DNA

<213> 土曲霉(Aspergillus terreus)

<400> 2

gctttgccaa agttcccaag agatcacctg ggtgttgaac cacagttgtt gactgaccca 60

actgttttgg ctaacaccac cgtggactac attattgctg gtggtggttt gaccggtttg 120

gttgttgctg ctagattgac tgaggaccca aacatcaagg tcttggttat cgagtccggt 180

tacttcgagt ctaacagagg tccaatcatc gaggacttga acagatacgg tgagattttc 240

ggtactgagg ttgaccacgc tttcgagact gttcagttgg ccgttaacaa cagaaccgag 300

atcatcagat ccggtaacgg tcttggtggt tccactttga ttaacggtgg tacttggacc 360

agaccacaca aggtttgtgt tgactcttgg gagactgtgt tcggtaatca aggttggaac 420

tgggacgact tgttgcccta catgttgaag atcgagaagg ccagaccacc aaaccagaga 480

caaattgaag ctggtcacta cttcaaccca cagtgccatg gttttaacgg ttccgttcat 540

gctggtccta gagacactgg tgaaccatac tctccaatca tgagagcctt gatggacact 600

gtttctgctg agggtgttcc agtcagaaag gacttgtgtt gtggtgatcc acacggtgtc 660

tccatgttct tgaacactct gtacccatct cagatcagag cagacgctgc tagagagtac 720

ttggtcccaa actaccacag accaaacttc caggttttga ctggtcagag agttggtaag 780

gtcttgttgg acaagactgt cccaggttct ccaaaggcta ttggtgttga gttcggtact 840

cacagaacca gaaagtacga ggcttacgcc agaagagagg ttttgttggc tgctggttct 900

actatctccc caaccatctt ggaatactcc ggtatcggta tgaagtccgt tttggactcc 960

gttggtatcg agcaggttgt tgaattgcca gtcggtgtta acttgcagga ccaaactact 1020

ctgcacgtcg agtccagaat tactccagct ggtgctggtc aaggtcaagc tgcttacttt 1080

gctaccttca acgagacttt cggtgacttc gctccacaag ctcacgagtt gttgaacact 1140

aagttggacc aatgggccga agaggttgtt gctagaggtg gttttcataa cgctaccgcc 1200

ttgagaatcc agtacgagaa ctacagaaac tggctggtca acaacaacgt tgccttctcc 1260

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actagaggtt acgttcacat tgccgacaag gacccatact tgagaaggct gtacaacaac 1380

cctcagtact tcttgaacga gttggacgtt ttgggtgaag ctgctgcttc taagttggcc 1440

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ttcgaccaat tgccagctga cgcttctttg agagattggg ctaagtacgt caaggaccac 1560

ttcagaccta actaccacgc tgtttccacc tgtgccatga tgtccaaaga acttggtggt 1620

gttgttgatt ccgccgccag agtttacgac gtcgaaagat tgagagtcgt ggacggttct 1680

attccaccaa ctcaagtttc ttcccacgtc atgaccgttt tctacggtat ggctgagaag 1740

atcgctgagg ctatcttgca ggattaccac gctagaaagg cgtaa 1785

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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Gly Ser Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr Gly Glu Pro Tyr Ser Pro

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