一种基于形态学和分子鉴定识别橡胶草的方法

技术领域

本发明属于植物组织鉴定技术领域，尤其涉及一种基于形态学和分子鉴定识别橡胶草的方法。

背景技术

橡胶草其中甲羟戊酸(MVA)途径中用于调节天然橡胶生物合成，橡胶草是二倍体(2n＝16)，具有相对简单的基因组，长度为1.29Gb，其中包含46,731个预测的蛋白质编码基因，橡胶草根含有高分子量橡胶分子，其特性与巴西橡胶树的橡胶胶乳相当，可以作为一种替代橡胶作物，橡胶草根的橡胶含量高，占其总干重的3％至28％[17]，它们也是菊粉的新来源(线性β-(2-1)-连锁果聚糖)，这是另一种丰富的蒲公英代谢产物，存储在韧皮部附近的实质根细胞液泡中，与质外分离的乳胶虫相邻，是食品工业和生物乙醇生产的重要材料。此外，橡胶草可以在相对较短的生命周期中在寒冷和温带地区广泛生长，并且易于收获和进行遗传转化，因此可以用作发明小麦基因功能的理想模型植物。天然橡胶的生物合成材料。

但是，由于橡胶草植物特征容易与其他蒲公英混淆，普通蒲公英叶片为羽状，边缘呈锯齿状，基部为楔形，而橡胶草叶片为楔形，叶缘几乎光滑而圆形。从许多橡胶草组织中可以检测到大量的胶乳细胞和橡胶颗粒，并且橡胶草的干燥根含有大量的天然橡胶,胶乳细胞和橡胶颗粒只能在橡胶草的静脉，茎和根中检查,其根乳胶中的平均分子量为2180kDa，这与从蒲公英中获得的非常相似。因此，单纯冲分子量进行比较难以区别橡胶草和蒲公英。因此需要一种基于形态学和分子鉴定识别橡胶草的方法。

发明内容

本发明提供一种排除蒲公英与橡胶草杂种干扰，基于形态学和分子鉴定识别橡胶草的方法。

本发明包括以下步骤：

A选取待测橡胶草完整的植物组织；

B选择所述待测橡胶草进行形态学观察初筛得到一次筛选的橡胶草；

C对筛选后的所述橡胶草进行分子鉴定，对获得的数据进行统计和分析输出结果；

D通过所述结果鉴定识别所述待测橡胶草；

进一步地，所述分子鉴定的方法包括

a利用层析法待测橡胶草提取叶绿体后；

b提取橡胶草叶绿体的总DNA，用橡胶草叶绿体物种特异性标记 C5基因进行检测进行PCR后；

c经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，其显示橡胶草和普通蒲公英正确条带(659bp)，

d用TaqI酶进行PCR产物单酶切，在橡胶草(C5)产物中会出现多条不定片段的多态性现象，酶切后能够出现多态性条带，由此确定为橡胶草。

进一步地，所述形态学观察的方法包括

A获取标准橡胶草的特征图像中并选定清晰而且具有特征明显的图形；

B将所述标准橡胶草的图像数据进行记录储存，作为待测橡胶草的图像比对的标准图像数据并储存于植物特征数据库；

C当橡胶草需要进行识别鉴定时，利用植物特征数据库中橡胶草模型或者在实时现场应用同样的方法测量橡胶草特征图形对应的数据进行计算并比对；

进一步地，所述反应体系为：

DNA 2μL

TaKaRa 1×PCRMix7μL

Primers 1μL

ddH2O 10μL

Totalvolume 20.0μL

反应条件设定为：预变性94℃,3min；变性94℃,30sec，退火 54℃,30sec，延伸72℃，1min，循环30次；72℃，10min；4℃存放。

进一步地，以橡胶草叶绿体(Chloroplast)基因特异引物C5(InterspacebetweentrnN-GUUandrps15)作为检测引物进行PCR反应，引物序列为：Annotation:C5 (InterspacebetweentrnN-GUUandrps15)

Forwardprimer:5′-TCAAAGGATCTATGCGCAATCA-3′

Reverseprimer:5′-TCGAGAATTGAAGACCCCTAGT-3′

C5基因总长Length:462bp,time:54℃，

Enzyme:TaqI,TKS:Polymorphic,TO:

本发明的有益效果为：

本发明可以结合形态学观察和分子水平共同鉴定，能够排除蒲公英与橡胶草杂种干扰，既适于从野外橡胶草的植物材料收取，还可用于橡胶草纯种种质保存。

附图说明

图1本发明的流程示意图；

图2是叶绿体提取图片展示图。

图2A.蒲公英叶绿体；图2B.橡胶草叶绿体

图3为叶绿体特异性C5引物验证示意图。

其中图3A.C5基因PCR结果示意图；图3B.单酶切C5基因多态性验证示意图

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

如图1所示，在本实施例子中包括以下步骤：

A选取待测橡胶草完整的植物组织，分别采集植物叶子、花蕾、根茎和种子；

B选择所述待测橡胶草进行形态学观察初筛得到一次筛选的橡胶草；

普通蒲公英和橡胶草都属于蒲公英属，起初看起来像是同一物种。橡胶草和普通蒲公英的叶子呈玫瑰花状。普通蒲公英的叶子是羽状但橡胶草的叶子更楔形。普通蒲公英叶片的边缘边缘参差不齐，其基部是楔形的。刀片尖端尖锐，主静脉基部为红棕色，呈侧向平行静脉形式。橡胶草叶片形状也楔形，叶片边缘近乎光滑圆形，叶基也楔形，刀尖为半圈。主静脉的基部为白色或红色，也呈侧向形式平行静脉。

蒲公英的花是头状花序，但有明显的差异在普通蒲公英和橡胶草花蕾的外部片之间的形态。普通蒲公英花蕾外片是向外伸展，而橡胶草花蕾的外片将向内形成一个角度。在光学显微镜下观察蒲公英的种子和纺锤体形态属于瘦果。普通蒲公英和橡胶草种子分别为深棕色和深绿色。种子表面的形态排列成山脊和小沟的轮廓，以及倒钩出现在山脊的后半部分。种子的形态特征有利于着陆后迅速渗透到土壤中。由于橡胶草具有自我不相容性，橡胶草受精种子表面轮廓清晰，单个种子大且饱满；普通蒲公英根断处没有胶体拉丝，并且有连续的橡胶草干根断裂处的白色胶体线图。

形态学观察法进行橡胶草鉴定：

普通蒲公英和橡胶草花蕾的外片有明显差异。橡胶草片为倒针形，先端钝，边缘平滑和弯曲，其花蕾和面板总包片的外层向内弯曲形成一定角度。橡胶草是自交不亲和的，其种子为纺锤形瘦果，并显示垂直饱满。

1.野生橡胶草与蒲公英进行对比，垂直观察整个植株呈圆，蒲公英叶片有锯齿状缺口，叶柄呈现粉红色，整体叶面积较大；

2.橡胶草盘状面积较小，叶片没有锯齿状缺口，叶片以茎为中心散射周围叶片呈墨绿色，叶片呈卵圆形且厚于普通蒲公英叶片，叶脉白色，叶缘没有明显缺口整体呈卵圆形；

3.橡胶草的花蕾较小，花萼最外层萼片内扣，呈显出一定角度。

4.橡胶草花蕾底层萼片向内扣，形成一定角度；

5.种子对比，观察两种植物种子形态和颜色，普通蒲公英的种子褐色，倒刺较长，种子纹理清晰；

橡胶草种子呈墨绿色，种子细长，倒刺较短，种子纹理浅；橡胶草受精和未受精的种子对比橡胶草的授粉种子和未授粉种子，授粉种子明显饱满，种子个体较大，未授粉种子干瘪，个体小较轻；

C对筛选后的所述橡胶草进行分子鉴定，对获得的数据进行统计和分析输出结果；

橡胶草分子水平鉴定(叶绿体)

(1)以上述得到的叶绿体DNA为模板，以橡胶草叶绿体

(Chloroplast)基因特异引物C5(InterspacebetweentrnN-GUUandrps15)作为检测引物进行PCR反应，引物序列为：

Annotation:C5(InterspacebetweentrnN-GUUandrps15)

Forwardprimer:5′-TCAAAGGATCTATGCGCAATCA-3′

Reverseprimer:5′-TCGAGAATTGAAGACCCCTAGT-3′

C5基因总长Length:462bp,time:54℃，Enzyme:TaqI,橡胶草:Polymorphic,普通蒲公英:

Fixed；

反应体系：

反应条件设定为：预变性94℃,3min；变性94℃,30sec，退火 54℃,30sec，延伸72℃，1min，循环30次；72℃，10min；4℃存放。

(2)待PCR反应结束后，取5-8μL的PCR产物反应液，用琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis)检测，确认PCR扩增产物条带大小是正确的，记录扩增产物大小以备后用；如果此PCR扩增产物需用于后续实验，请于-20℃保存。分子遗传学鉴定能充分证明橡胶草品系的纯度。本发明利用上述Procoll梯度离心法提取橡胶草叶片叶绿体(图2)，经光学显微镜镜检，蒲公英(普通蒲公英)和橡胶草的叶绿体提取质量较好。

D通过所述结果鉴定识别所述待测橡胶草；

利用以上层析法提取叶绿体后，再用多糖多酚植物DNA试剂盒，提取橡胶草叶绿体的总DNA，用橡胶草叶绿体物种特异性标记C5基因进行检测进行PCR后(图2A)，经1.2％的琼脂糖凝胶电泳 (Agarosegelelectrophoresis)检测，其显示橡胶草和普通蒲公英正确条带(659bp)，再用TaqI酶进行PCR产物单酶切，在橡胶草(C5) 产物中会出现多条不定片段的多态性现象(图2B)，酶切后能够出现多态性条带，由此确定为橡胶草橡胶草。此方法作为橡胶草基因功能验证时也作为qRTPCR内参基因，也可以作为半定量RT-PCR的内参基因作为参照，也可以验证橡胶草与普通蒲公英之间是否存在杂交等情况下运用.

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。