COX6C蛋白在制备早期妊娠丢失诊断的试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及COX6C蛋白在制备早期妊娠丢失诊断的试剂盒中的应用，属于妇产科领域。

背景技术

早期妊娠丢失主要发生在妊娠12周之前，是人类妊娠过程中常见的并发症之一。在中国，早期妊娠丢失是一种广泛的临床事件，影响了50％-70％的妊娠妇女，严重损害了育龄妇女的身体健康，还对中国人口质量造成很大的负面影响。近年来，早期妊娠丢失在育龄妇女中的发病率显著性增多。由于早期妊娠丢失可以导致胎盘组织机化，清除机化组织容易对子宫内膜造成损伤，给育龄妇女再次受孕造成困难。

早期妊娠丢失的发病机制非常复杂，主要包括染色体异常、遗传因素、生殖道畸形、感染、免疫功能异常、内分泌异常、环境因素及心理因素等。然而，早期妊娠丢失的致病机理尚未阐明。胎盘是在母体和胎儿系统之间输送营养物质、呼吸气体和废物的器官，在胚胎发育中起着重要的作用。胎盘发育依赖于胎盘滋养层对母蜕膜的有效植入和侵袭。有报道提示，很多基因在早期妊娠丢失的绒毛及蜕膜组织中均有显著性差异表达，并可能通过细胞凋亡、氧化应激等信号通路调控胎盘细胞的功能和存活。

当机体处于应激状态或者遭遇各种有害刺激时，体内氧化系统和抗氧化系统失衡，从而出现了氧化应激反应，最终介导了细胞凋亡、缺血再灌注损伤、炎症反应等多个生物学事件。在妊娠早期,胎盘血液循环建立时,胎盘部位爆发氧化应激,产生过多的活性氧自由基，并激活Nrf2、NF-κB等经典的氧化应激相关通路。与此同时，抗氧化因子也随之升高,使氧化/抗氧化在新的水平上保持平衡,妊娠得以维持。当胎盘缺血缺氧时，胎盘滋养细胞发生氧化应激，产生大量活性氧自由基，超过了抗氧化系统代偿能力，从而引起胎盘功能障碍。转录组学研究表明，抗氧化相关基因的表达水平在早期妊娠丢失患者胎盘组织中呈现显著性失调，而氧化应激标志物则明显增多，说明氧化应激过程可能在早期妊娠丢失中发挥了重要作用。

COX6C蛋白参与多种细胞代谢过程，包括凋亡途径、葡萄糖分解代谢等过程。COX6C受到hsa-miRNA-4276的调控，并可以进一步调节凋亡关键蛋白Caspase-9的表达水平。研究发现，白介素24通过早期激活细胞周期阻滞过程来介导线粒体凋亡途径蛋白，如Bax、Bid、Casp8、COX6C和COX7B。DAZAP1是一种高度保守的RNA结合蛋白，在小鼠和人的多种组织中表达。DAZAP1是前体mRNA剪接体的负性调控因子，可以通过特异性内含子依赖途径装载到COX6C转录本上,进而调控COX6C的表达水平来控制线粒体能量的产生，诱导细胞生长阻滞。

尽管抗氧化基因的在胎盘组织中的重要性已经知晓，而氧化应激在早期妊娠丢失中的作用机理仍知之甚少。COX6C蛋白作为潜在的抗氧化因子，在早期妊娠丢失中可能通过抗氧化应激减少细胞的凋亡，从而减少早期妊娠丢失的发生。COX6C以及其他氧化应激相关蛋白在早期妊娠丢失中的调控机理尚属空白，因此具有重要的研究意义和临床应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种COX6C蛋白在制备早期妊娠丢失诊断的试剂盒中的应用。COX6C蛋白是前期通过蛋白质组学技术鉴定到的差异蛋白之一。COX6C在早期妊娠丢失的绒毛和蜕膜组织中显著性下调，极具可能成为早期妊娠丢失的临床靶标。本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

COX6C蛋白在制备早期妊娠丢失诊断的试剂盒中的应用，所述的试剂盒以在组织中低表达的COX6C蛋白作为诊断早期妊娠丢失的标志物。

进一步的，所述试剂盒利用COX6C蛋白的抗体来检测受试者样本组织中COX6C的C端50-150位氨基酸的表达水平。

进一步的，早期妊娠丢失患者样本组织中的COX6C的C端50-150位氨基酸的表达水平显著下调。

进一步的，所述样本组织为绒毛组织和蜕膜组织。

进一步的，所述试剂盒采用免疫印迹法分析检测样本组织中COX6C的C端50-150位氨基酸的表达水平。

有益效果

本发明通过实验发现COX6C蛋白的表达水平在早期妊娠丢失绒毛和蜕膜组织中显著性下调，极具可能成为早期妊娠丢失的临床靶标；通过检测受试者样本组织中的COX6C蛋白的表达水平可以有效的判断受试者是否患有早期妊娠丢失；并且发现了COX6C可以调控细胞凋亡过程，在早期妊娠丢失过程中提供保护性作用。对于早期妊娠丢失具有重要的研究意义和临床应用价值。

附图说明

图1为早期妊娠丢失蜕膜和绒毛差异蛋白的表达水平。图A为蜕膜组织中蛋白免疫印迹分析结果；图B为绒毛组织中蛋白免疫印迹分析结果；图C为蜕膜组织中蛋白表达水平统计结果；图D为绒毛组织中蛋白表达水平统计结果；

图2为COX6C在早期妊娠丢失的蜕膜和绒毛中的表达模式。

图3为在HTR-8/SVeno细胞中下调COX6C抑制细胞凋亡过程。(A)COX6C siRNA干涉效率验证。(B)HTR-8/SVeno细胞的TUNEL染色。(C)TUNEL阳性细胞的比率统计。(D)HTR-8/SVeno细胞的免疫荧光染色。(E)Cleaved Caspase-3阳性细胞的比率统计。(F)HTR-8/SVeno细胞的流式细胞检测。(G)HTR-8/SVeno细胞中存活、凋亡、坏死细胞比率的统计。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

实施例1 COX6C在早期妊娠丢失中的表达模式

在对照组(人工流产组)和实验组(早期妊娠丢失组)的绒毛和蜕膜组织、外周血中观察COX6C的表达模式。利用免疫组化、蛋白免疫印迹等方法观察COX6C在绒毛和蜕膜的表达模式及定位情况。

(1)标本采集:

选取稽留流产患者作为实验组(早期妊娠丢失组)，同期收治的正常妊娠患者拟终止妊娠者作为对照组(人工流产组)，详细记录孕周，血HCG及孕酮水平，孕囊大小，以及组织病检结果。所选孕妇均无近期感染证据，无染色体异常，无免疫性疾病，未经过保胎治疗。

两组患者行清宫术后分别采集其绒毛及蜕膜，用生理盐水漂洗血液。一份蜕膜和绒毛组织分别放入冻存管内，半小时内放入-80℃冰箱，待日后行蛋白免疫印迹等实验；一份组织包埋成蜡块，待日后行免疫组化染色。

(2)免疫组化染色

标本经10％中性福尔马林固定，石蜡包埋后连续切片，石蜡切片染色前应置于60℃孵箱1小时，随后进行免疫组化染色。染色方法按照常规实验步骤进行，主要包括石蜡切片脱蜡至水、过氧化氢封闭内源性过氧化物酶、抗原修复、正常血清封闭、一抗孵育及清洗、二抗孵育及清洗、三抗(SAB复合物)孵育及清洗、DAB显色、苏木素复染、酒精脱水、二甲苯透明及封片等步骤。

(3)蛋白免疫印迹

收集绒毛和蜕膜组织，分别加RIPA裂解液，提取总蛋白，BCA法测定浓度。加samplebuffer,95℃加热5min,取20μg总蛋白进行10％SDS-PAGE胶电泳,转膜至PVDF膜，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加一抗4℃孵育过夜，TBST洗3×5min，二抗室温孵育1h，洗膜后采用ECL化学发光法显色。通过灰度比值表示目的蛋白COX6C的C端50-150位氨基酸的相对表达水平。

蛋白免疫印迹结果显示(图1)，COX6C蛋白的表达水平在早期妊娠丢失蜕膜组织中下调为对照组的32.4％，在早期妊娠丢失绒毛组织中下调为对照组的36.5％，说明COX6C蛋白的表达水平在早期妊娠丢失绒毛和蜕膜组织中显著性下调。

COX6C蛋白主要参与调控了细胞凋亡，所以我们进一步对COX6C蛋白进行免疫组化染色，结果提示COX6C蛋白在对照组绒毛组织的合胞体滋养层和细胞滋养层细胞中高度表达，在对照组蜕膜中也是广泛表达的，而在早期妊娠丢失组中均表现为显著性降低(图2)。

实施例2 COX6C在早期妊娠丢失模型中的功能分析

(1)细胞培养

人滋养层细胞HTR-8/SVeno使用RPMI-1640+10％FBS+1％P/S培养液作为完全培养基，于37℃、5％CO

(2)流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期细胞以每孔1×10

(3)免疫荧光染色

细胞爬片后，利用4％PFA固定1小时，经过PBS清洗，封闭，一抗过夜及PBS清洗，二抗孵育及PBS清洗，DNA染色和封片等步骤，于暗盒保存。

为了进一步研究COX6C在HTR-8/SVeno中的作用，通过siRNA转染实现COX6C基因的表达沉默，并利用qRT-PCR技术进行干涉效率验证(图3A)。免疫荧光结果显示，下调COX6C基因的表达水平可以降低TUNEL阳性细胞和Cleaved Caspase-3阳性细胞的比率(图3B-E)。

更重要的是，流式细胞检测结果显示，下调COX6C基因同样可以下调细胞凋亡的比率(图3F-G)。这些结果提示，COX6C可以调控细胞凋亡过程，在早期妊娠丢失过程中提供保护性作用。