一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法。

背景技术

CRISPR系统作为一种新兴的基因定点编辑技术逐渐成熟并在多个植物中成功取得应用，利用此技术能够对目的基因进行靶向的敲除或敲入。CRISPR/Cas9通过RNA-DNA碱基对识别DNA序列，任何含有NGG的PAM序列都可作为靶点。自该技术兴起以来，CRISPR/Cas9由于其简单、高效和通用的特性，已迅速成为基因组编辑的首选技术。但是CRISPR/Cas9系统的研究多集中在构建CRISPR/Cas9载体，再进行农杆菌介导或者物理转化。目前，基于CRISPR/Cas9的植物转化系统中需要引入外源基因和标记基因。标记基因主要是抗生素或除草剂的抗性基因。对于草本植物而言，因其生长周期短，可以通过相关标记基因剔除方法及多代自交杂交对外源基因进行清除。但是对于木本植物而言，个体生长周期长，重组质粒的转基因不仅会增加剔除外源基因的时间，而且随着时间的推移，这些外来的基因可能会分散到环境中其他生物体内，造成不可预估的基因突变后果或引起未知的过敏反应，进而产生无法估量的危害。因此，建立安全可靠、耗时短和低成本的无外源基因插入(DNA-free)的转基因体系对于缓解木本植物基因转化潜在的负面影响是至关重要的。

落叶松作为北方地区最具代表性的寒湿性针叶林树种之一，其材质好，用途广，是北方林区的主要造林树种。相对于草本模式植物及粮食作物，获得突变体较为困难，因而，针对落叶松建立一种基于CRISPR系统的DNA-free基因编辑方法对本领域技术人员来讲是非常重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法，利用本发明提供的DNA-free基因编辑方法可以实现落叶松目的基因的无外源基因污染编辑，成功获得落叶松基因编辑突变体。

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法，包括如下步骤：

将Cas9蛋白与落叶松目的基因gRNA混合，得到落叶松RNP复合物；

将所述落叶松RNP复合物转化到落叶松中，得到落叶松基因编辑突变体。

优选的，所述落叶松目的基因包括PDS基因；

所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，对PDS基因进行编辑的靶点包括gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA 4和gRNA 5中的任意一个；

所述gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

优选的，所述gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5的引物分别为gRNA-primer-1、gRNA-primer-2、gRNA-primer-3、gRNA-primer-4和gRNA-primer-5；

所述gRNA-primer-1、gRNA-primer-2、gRNA-primer-3、gRNA-primer-4和gRNA-primer-5的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。

优选的，所述转化方式包括基因枪介导转化法。

优选的，完成所述转化后，还包括对转化得到的组织进行体细胞胚诱导培养、成熟培养和植株再生。

优选的，所述落叶松DNA-free基因编辑方法还包括PDS基因的克隆和体外验证。

优选的，用于所述体外验证的表达载体包括pAbAi或pUC19-35S-GFP；

所述PDS基因的克隆的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

本发明提供了一种落叶松PDS基因，所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述落叶松DNA-free基因编辑方法或所述落叶松PDS基因在构建落叶松新品种中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法，通过确定落叶松目的基因编辑位点，设计目的靶点的gRNA，结合CRISPR/Cas9系统实现落叶松目的基因的DNA-free编辑，获得落叶松基因编辑突变体，为落叶松及其他木本植物的基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术提供参考。

其次，本发明还提供了一种落叶松PDS基因，并将其成功应用到上述落叶松DNA-free基因编辑方法中，获得落叶松PDS基因编辑突变体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中PDS基因克隆电泳检测结果；

图2为实施例1中PDS基因片段的克隆序列比对结果；

图3为实施例1中为体外验证实验中pAbAi-PDS-E1线性化酶切电泳图谱，其中，M：DL 15000，1：pAbAi-PDS-E1线性化质粒；

图4-1为实施例1中PDS基因编辑位点体外验证结果，其中，M：DL 5000，1～5：分别为五个靶点的切割结果，+：阳性对照，-：阴性对照(空载)，gRNA(-)：无gRNA对照，Cas(-)：无Cas9蛋白对照；

图4-2为实施例1中PDS基因编辑位点体外验证结果，其中，M：DL 2000，1～5：分别为五个靶点的切割结果，gRNA(-)：无gRNA对照，Cas(-)：无Cas9蛋白对照；

图5为实施例2中体细胞胚的诱导过程，其中，A为预培养阶段，B为愈伤组织的过渡培养阶段，C为体细胞胚的诱导阶段，D为体细胞胚的成熟阶段；

图6为实施例2中体细胞胚见光培养14天时的生长状态，其中，A为野生型对照体胚，B和C均为白色体胚；

图7为实施例2中落叶松PDS基因编辑突变株，其中绿色植株为野生型，白色植株、白色与绿色的嵌合体植株为所获得的突变体植株；

图8为实施例2中落叶松PDS基因编辑突变株测序比对结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法，包括如下步骤：将Cas9蛋白与落叶松目的基因gRNA混合，得到落叶松RNP复合物；将所述落叶松RNP复合物转化到落叶松中，得到落叶松基因编辑突变体。

本发明优选以PDS基因为例对所述落叶松DNA-free基因编辑方法进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部技术方案，落叶松上的任意基因均可利用本发明所述的方法实现基因编辑。

本发明优选克隆落叶松目的基因和确认落叶松目的基因的靶点，得到落叶松目的基因靶点。本发明对所述落叶松目的基因克隆的方法和试剂没有特殊限定，采用本领域常规克隆方法即可，如本发明实施例中克隆落叶松PDS基因，使用KOD DNA聚合酶进行所述落叶松PDS基因的克隆，克隆所述PDS基因的引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列优选如SEQ ID No.12所示，具体为：5’-ATGCAAGGCCTTCTTTGC-3’；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，具体为5’-CCTGTCTCATACCAGTCC-3’。本发明所述落叶松PDS基因克隆PCR扩增体系优选以20μL计，其优选的配置方式为：

本发明所述落叶松PDS基因克隆的PCR反应程序优选为：

本发明优选基于CRISPR-P 2.0网站中的Design确认所述落叶松目的基因的靶点。当所述落叶松目的基因为PDS基因时，对PDS基因进行编辑的靶点优选包括gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA 4和gRNA 5中的任意一个，更优选包括gRNA 3、gRNA 5和gRNA 1。本发明所述gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，具体为：

得到所述落叶松目的基因靶点后，本发明优选设计所述落叶松目的基因靶点的gRNA引物，得到落叶松目的基因gRNA引物(下称gRNA-primer)。本发明所述PDS基因的靶点gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA 4和gRNA 5的引物分别优选为gRNA-primer-1、gRNA-primer-2、gRNA-primer-3、gRNA-primer-4和gRNA-primer-5，所述gRNA-primer-1、gRNA-primer-2、gRNA-primer-3、gRNA-primer-4和gRNA-primer-5的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，从5’-3’，具体为：

gRNA-primer-1:TAATACGACTCACTATAGGCAGCAGTCTGTCATCTGCGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGG(SEQ ID No.7)

gRNA-primer-2:TAATACGACTCACTATAGTGCGCTCTGTGAAAAAGAAAGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGG(SEQ ID No.8)

gRNA-primer-3:TAATACGACTCACTATAGAAAGGGATCGAAACGCGACGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGG(SEQ ID No.9)

gRNA-primer-4:TAATACGACTCACTATAGAGGTTTGGCTGGCTTGTCAAGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGG(SEQ ID No.10)

gRNA-primer-5:TAATACGACTCACTATAGGAGGCAAGAGATGTTCTTGGGTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGG(SEQ ID No.11)。

得到所述落叶松目的基因gRNA引物后，本发明优选还包括对所述落叶松目的基因靶点进行体外验证。本发明所述体外验证优选包括构建表达载体、制备双链DNA、体外转录gRNA、表达载体线性化和体外靶点检测。

本发明用于构建所述落叶松PDS基因表达载体的载体优选包括pAbAi或pUC19-35S-GFP，更优选为pAbAi。本发明对所述载体的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明优选将所述落叶松目的基因插入到酶切位点SacI和SalI间；所述酶切引物包括正向酶切引物和反向酶切引物，所述正向酶切引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，具体为5’-GGAGCTCATGCAAGGCCTTCTTTGC-3’；所述反向酶切引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示，具体为5’-CGTCGACCCTGTCTCATACCAGTCC-3’。本发明优选采用T4连接酶将所述落叶松PDS基因与酶切后载体连接。本发明所述落叶松PDS基因与酶切后载体的体积比优选为3～10：1，更优选为3：1；所述连接体系优选以10μL计，具体为：PDS基因3.75μL，酶切后pAbAi载体1.25μL，5×T4 ligase buffer 2μL，T4 DNALigase 1μL，去离子水2μL。本发明所述连接的反应温度优选为16～25℃，更优选为20℃；所述连接的反应时间优选为1～2h，更优选为2h。

完成所述构建表达载体后，本发明优选制备双链DNA。本发明所述制备双链DNA的步骤优选包括：将所述落叶松目的基因gRNA引物进行双链PCR扩增，得到双链模板DNA。本发明所述双链PCR扩增的的体系以50μL计，其优选的配制方式为：

本发明所述双链PCR扩增的程序优选为：

本发明所述BS6与BS7用于获得gRNA中的环状结构，T25-long是包含T7启动子的序列，所述BS6的核苷酸序列优选如SEQ ID No.16所示，具体为：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTCCAGC-3’；所述BS7的核苷酸序列优选如SEQ ID No.17所示，具体为：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGC-3’；所述T25-long的核苷酸序列优选如SEQ ID No.18所示，具体为：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAG-3’。

得到所述双链模板DNA后，本发明优选对所述双链DNA模板进行体外转录，得到体外转录gRNA。本发明所述体外转录的体系优选以20μL计，所述体外转录体系优选为：

本发明所述体外转录的孵育温度优选为30～42℃，更优选为37℃；所述体外转录的孵育时间优选为2～4h，更优选为4h。

完成所述体外转录后，本发明优选进行表达载体线性化，得到线性化DNA模板。本发明优选通过单酶切实现所述表达载体的线性化，所述单酶切使用的限制性内切酶优选为BstBI、BsmBI或BbsI，更优选为BstBI。本发明所述表达载体线性化的反应体系优选以200μL计，所述反应体系优选为：

本发明所述表达载体线性化的反应温度和时间优选依据BioLabs的BstBI说明书进行，分别为37℃和3h。

完成所述表达载体线性化后，本发明优选进行体外靶点检测，所述体外靶点检测的反应体系优选以20μL计，所述反应体系优选为：

本发明所述体外靶点检测的温度优选为优选为37～42℃，更优选为37℃，所述反应时间优选为为30min～1h，更优选为1h。本发明优选还包括对完成所述体外靶点检测的产物进行纯化和琼脂糖凝胶电泳检测，判断选择靶点的编辑效果。本发明对所述纯化和琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规方法即可。本发明所述判断选择靶点标准优选为理论编辑效率高，距离ATG较近，GC含量较高的靶点。

完成所述体外验证后，本发明将Cas9蛋白与落叶松目的基因gRNA混合，得到落叶松RNP复合物。本发明所述落叶松目的基因gRNA优选为符合所述判断选择靶点标准的gRNA。本发明所述Cas9蛋白与落叶松目的基因的体积比优选为1：(1～2)，更优选为1：1。本发明对所述Cas9蛋白与落叶松目的基因gRNA的混合方式没有特殊限定，依据编辑基因和转化方式调整即可，如本发明所述PDS基因gRNA与Cas9蛋白的混合体系优选以15μL计，包括：gRNA 2μL、Cas9蛋白2μL、1×Cas9 buffer 6μL、基因枪金粉微粒5μL。

得到所述落叶松RNP复合物后，本发明将所述落叶松RNP复合物转化到植物中，得到转化后落叶松组织。本发明所述转化方式优选包括基因枪介导转化法。本发明优选采用PDS-1000/He型基因枪进行所述转化，本发明对采用所述PDS-1000/He型基因枪进行转化的方式没有特殊限定，依据说明书操作即可。本发明用于所述转化的组织优选为愈伤组织。

得到所述转化后落叶松组织后，本发明优选还包括对所述转化后落叶松组织进行体细胞胚诱导和植株再生。本发明所述体细胞胚诱导包括：将所述转化后落叶松组织经继代培养、过渡培养、体细胞胚诱导培养和成熟培养，得到成熟体细胞胚。本发明所述继代培养的培养基优选以BM培养基为基础培养基，还包括0.05mg/L 6-BA、0.05mg/L KT、0.1mg/L2,4-D、30g/L蔗糖和7g/L琼脂；所述继代培养的温度优选为25～28℃，更优选为28℃；所述继代培养的时间优选为7～11天，更优选为7天。本发明优选将所述转化后落叶松组织分割成块状组织再进行所述继代培养，所述块状组织的直径优选为0.8～1cm，更优选为0.8cm。本发明所述过渡培养的培养基优选为不含植物生长调节物质的BM培养基，具体组分如下：BM+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。本发明所述过渡培养的时间优选为7～11天，更优选为7天；所述过渡培养的温度优选为25～28℃，更优选为28℃。本发明优选完成所述过渡培养后挑取新增殖组织用于体细胞胚诱导和成熟培养。当用于所述转化的组织为愈伤组织时，本发明优选挑取新增殖愈伤组织上的透明部分。本发明所述体细胞胚诱导培养和成熟培养的培养基优选包括如下组分：BM+200mg/L IBA+30mg/LABA+60g/L蔗糖+9g/L琼脂；所述体细胞胚诱导和成熟培养的温度均优选为25～28℃，更优选为28℃；所述体细胞胚诱导及成熟培养的时间优选为42～56天，更优选为49天。本发明所述成熟体细胞胚的颜色优选为白色。本发明所述体细胞胚诱导和成熟培养环境均优选为暗培养，所述暗培养均优选为全遮光培养。

得到所述成熟的体细胞胚后，本发明优选将所述成熟体细胞胚进行植株再生，得到落叶松基因编辑突变株。本发明所述植物再生优选包括：将所述成熟体细胞胚进行干化处理和萌发培养。本发明所述干化处理的时间优选为30min～1h，更优选为40min，本发明对所述干化培养的步骤没有特殊限定，采用本领域常规干化步骤即可。本发明所述体细胞胚萌发的培养基优选包括如下组分：1/2MS培养基+20g/L蔗糖+6g/L琼脂。本发明所述萌发培养的光照条件优选为，光照周期为16h/8h光照/黑暗，光照强度为3000lux，所述萌发培养的温度优选为22～25℃，更优选为25℃。

本发明还提供了一种落叶松PDS基因，所述PDS基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明所述PDS基因为八青番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)编码基因，PDS基因是在植物类胡萝卜素的生物合成中起关键作用的酶之一，类胡萝卜素又是重要的天然色素之一。当PDS基因受到破坏时，会导致叶绿素含量会降低，进而使富含叶绿素的叶片和组织出现斑驳、褪色、黄化甚至变白色，利用其具有可改变叶色的特性，可以通过敲除PDS基因获得白化植株。因此，在基于CRISPR系统的落叶松转基因体系的建立过程中，本发明应用PDS基因的这一特性，在利用预实验探索转基因体系时，可以将落叶松PDS基因作为预实验的目的基因，在不同转化实验参数条件中转化PDS基因，这样在对获得的转基因植株进行前期筛选时，可以通过对植株颜色性状的观察直接进行筛选，这样就可以直观地确定最佳的转化参数，这一过程极大的缩短了初步检测的工作量又为分子水平的检测节省了时间。由此可以缓解落叶松在遗传转化过程中容易耗费大量人力物力等弊端，同时缩短在进行遗传改良实验的操作过程中由于检测工作而导致的较长的育种周期。因此，PDS基因可以用来作为探索基于CRISPR系统的落叶松转基因体系的基因。

本发明还提供了上述技术方案所述落叶松DNA-free基因编辑方法或所述落叶松PDS基因在构建落叶松新品种中的应用。采用本发明提供的落叶松DNA-free基因编辑方法可以对落叶松目的基因进行编辑，得到落叶松基因编辑突变株，在此基础上为落叶松新品种的培育提供技术支持。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

日本落叶松PDS基因靶位点的确定及其体外验证：

1、日本落叶松PDS基因靶点的确定

根据日本落叶松PDS基因序列的克隆结果，将序列输入到网站CRISPR-P 2.0的Design中，该网站自动识别筛选特异性靶点序列，即在该基因的CDS序列区域中NGG(PAM序列，N为A、T、C或G)前20bp可作为目标序列，并以距离ATG越近打靶效率越高为基础原则，确定五个打靶位点，具体见表1。

表1靶点序列

2、DNA水平PDS基因的克隆

以提取的日本落叶松愈伤DNA为模板，使用KOD酶进行PCR扩增反应克隆基因片段，反应体系及程序如下表2、表3，电泳检测结果如图1所示。将PCR产物胶回收送生物公司进行测序比对，结果如图2所示，在靶点相应位置均无碱基突变，该克隆结果可以用于体外验证表达载体的构建。在图2中1号靶点对应gRNA 1、2号靶点对应gRNA 2、3号靶点对应gRNA 3、4号靶点对应gRNA4、5号靶点对应对应gRNA 5。

表2 PDS基因的克隆PCR扩增体系

表3 PDS基因的克隆PCR反应程序

3、体外验证表达载体的构建

通过分析PDS基因全长序列及pAbAi载体图谱，设计带有酶切位点的基因引物。在载体图谱的多个插入位点中找出载体可用的全部酶切位点，以筛选可使用的限制性内切酶，然后将该基因全长序列输入到BioEdit软件中，通过软件分析得到不能切断该基因的限制性内切酶，以此选取出既可以切断载体又不会切断基因的限制性内切酶作为最终所用酶。本实验选取SacI和SalI两个限制性内切酶，并根据所使用的内切酶确定酶切位点序列，由此设计正向酶切引物：SEQ ID No.14和反向酶切引物SEQ ID No.15。

酶切引物合成后，以基因连接T载体序列比对成功的菌液提取的质粒为模板进行目的基因的扩增，PCR产物在120V电压下，以电泳检测目的条带长度是否正确，若条带正确则利用购自南京诺唯赞生物公司的2×Easy Taq Master Mix以胶回收体系进行PCR扩增，然后使用胶回收试剂盒对其进行胶回收，并按产物纯化试剂盒说明书的操作步骤进行纯化。

纯化后的目的片段与载体使用全式金T4连接酶按照如下体系(10μL)进行连接：PDS基因：pAbAi载体3：1，5×T4 ligase buffer 2μL，T4 DNA Ligase 1μL，去离子水2μL。反应条件为：20℃，2h。

最后使用限制性内切酶SacI和SalI分别对PDS基因连Ti载体质粒及空白pAbAi载体质粒进行双酶切，酶切产物进行纯化后连接。连接产物转入大肠杆菌，菌液PCR检测结果所示，目的条带位置正确，初步表明连接成功。选取3个阳性菌液送公司测序成功，表达载体构建完成。

4、体外验证

4.1gRNA的制备：由生工生物公司合成引物，其中BS6与BS7可以获得gRNA中的环状结构，T25-long是包含T7启动子的序列。设计PDS基因的靶点gRNA 1、gRNA 2、gRNA 3、gRNA4和gRNA 5的引物gRNA-primer-1、gRNA-primer-2、gRNA-primer-3、gRNA-primer-4和gRNA-primer-5。

4.2制备双链DNA：将设计的单链靶点引物通过特定的PCR程序，合成双链的DNA模板，PCR体系及引物浓度如表4，程序如表5。

表4制备双链DNA的PCR体系及其终浓度

表5制备双链DNA的PCR程序

4.4体外转录制备gRNA：反应体系如表6。反应条件：37℃孵育4h。

表6制备gRNA逆转录体系

4.5表达载体和空白载体的线性化：构建的表达载体和空载均为圆形质粒，而在体外切割验证过程中作用在线性载体上，空载作为阴性对照，所以需要对表达载体和空载均进行单酶切。反应体系如表7。反应条件：37℃3h。之后对产物进行1％的琼脂糖凝胶检测，结果如图3，电泳条带在5000bp-7500bp间清晰可见，对其进行回收纯化。

表7线性化体系

4.6体外靶点检测：PCR体系如表8。该反应一共有9个样品，分别为五个不同靶点1、2、3、4、5以及进行过体外验证的pAbAi-PDS为阳性对照(+)、pAbAi空白载体为阴性对照(-)，同时在一号靶点下做两个缺失对照：即无Cas9蛋白和无gRNA。向PCR管中依次添加磷酸缓冲液、MgCl

表8体外靶点检测反应体系

根据实施例1的上述记载可知，本发明将日本落叶松基因组中克隆的PDS基因片段构建到环状pAbAi载体上，并使用BstBⅠ对其进行单酶切得到了线性化pAbAi-PDS-E1载体；根据PDS基因片段上的五个靶位点序列体外合成gRNA，最后，加入缓冲液将Cas9蛋白和gRNA与线性化pAbAi-PDS-E1载体混合进行反应。基于CRISPR原理，Cas9蛋白与gRNA复合物会作用在基因组DNA上的特定靶位点，使pAbAi-PDS-E1发生断裂，致使一条线性的pAbAi-PDS-E1载体成为两条，并且该作用位置在我们所设计的靶位点内，已知pAbAi的长度为4894bp，构建的PDS基因片段为769bp，总长5663bp，1-5号靶点距离BstBⅠ位点的距离分别为633bp、690bp、707bp、874bp和938bp，因此本发明得到的两条带的长度分别为BstBⅠ位点到1-5靶点的长度以及总长剩下部分。因而，根据实施例1中的结果可从理论上验证Cas9蛋白与gRNA复合物的作用效果，进而证明我们所设计位点理论上的编辑可行性。

由此通过体外验证电泳图4-1和4-2可知，所选5个靶点均可被酶切得到两条谱带，且条带长度与我们所设计的靶点区域符合，从理论上证明了5个靶点的编辑可行性，而图中最下侧条带多为引物二聚体以及gRNA中未参与反应的短片段集合，并无实际意义。空白对照及缺失对照均为单一谱带。表明上述复合物是作用在所构建的表达载体上，并且作用条件缺少Cas9蛋白或gRNA都不能的到相应结果。

实施例2

基因枪介导DNA-free的PDS基因编辑：

1、金粉的预处理

(1)称取0.06g金粉放入到经高温高压灭菌的1.5mL Eppendorf管中，加入700μL75％无水乙醇，充分涡旋振荡10min，室温静置20min，室温1500rpm离心5min，使用移液枪抽弃上清；

(2)加入1mL无菌水，充分涡旋振荡5min，室温1500rpm离心5min，使用移液枪抽弃上清；

(3)重复(2)步骤两次。

(4)加入1mL的RNase-free water，充分涡旋振荡混匀，此时制备的金粉终浓度达到了60mg/mL，4℃保存备用。

2、RNP复合物的混合制备

(1)首先按照每轰击一枪所需混合物的量为gRNA 2μL、Cas9蛋白2μL、1×Cas9buffer 6μL、预处理后的金粉5μL，总体积15μL，以及轰击次数，计算出转化一次所需混合物总量。

在超净工作台中向灭菌的1.5mL Eppendorf管中依次加入1×Cas9 buffer、Cas9蛋白、gRNA，每加入一种药品轻轻涡旋震荡5s；

(2)所有药品加完后将混合物于25℃室温孵育10min；

(3)重悬金粉微粒加入到试管中，与药品充分混匀；

(4)室温条件下保存2h。

3、基因枪转化

采用PDS-1000/He型基因枪操作，具体如下：

(1)首先转化前先把落叶松愈伤组织集中放在培养皿的中心，直径为2-3cm左右。并且将基因枪中的载体膜托盘和可裂膜挡盖以及载体膜、阻挡网和离心管均于121℃高压灭菌20min备用，同时要将基因枪轰室用75％酒精充分消毒，打开室门晾干，并对超净工作台做30min的紫外杀菌处理。之后打开超净工作台，先将无水氯化钙颗粒倒入一个经灭菌处理的培养皿中，并在氯化钙颗粒上平铺一张经灭菌处理的滤纸，以此做干化处理。之后将载体膜嵌入载体膜支架中，并将支架平放于滤纸上，载体膜向上。

(2)打开真空泵和基因枪的电源，逆时针打开氦气开关，并调节输出压力调节阀门，使输出压力表显示的数值在可裂膜耐受数值基础上增加200psi。拧下可裂膜挡盖，将可裂膜在70％的异丙醇中迅速蘸一下后放在挡盖中心，将挡盖旋上，并用扳手加固使其发生轻微形变即可。

(3)将RNPs复合物充分涡旋后，吸取15μL复合物打到载体膜中央并均匀涂抹在载体膜上，静置使复合物充分风干。之后先将阻挡网放到托盘下方正中央，再在其上方放置载体膜托盘，最后将盖子拧紧。之后基因枪各组分配件安装到相应部位，样品放置在距离微粒9cm位置，进行轰击。

(4)长按“Fire”键，听到“砰”一声，一次转化结束。重复操作。转化结束后，取下微粒发生装置，卸下载体托盘和阻挡网，旋下可裂膜挡盖，清除可裂膜碎片等杂物。关闭舱室门，关掉氦气瓶的开关，重复操作基因枪过程，在按住“Fire”键的同时，逆时针调节输出压力调节阀门至0，松开“Fire”键，最后关闭电源。

4、转化后愈伤组织培养以及体细胞胚的诱导和植株再生

轰击后的愈伤分成直径为0.8cm左右的小块放在培养基上28℃暗培养一周后，将每个愈伤组织团继续分成直径为0.8cm左右的小块放到不添加任何植物生长调节物质的BM培养基中进行过渡暗培养一周左右。之后挑取新增殖愈伤的透明部分放于体细胞胚诱导培养及成熟培养培养基中，8周左右，愈伤表面基本布满白色和淡黄色体细胞胚，在超净工作台中将体胚挑出并进行40min的干化处理，之后将体胚放到1/2MS萌发培养基中，将平板用封口膜密封，并在平板上标记日期及靶点号，最后放到组培室进行萌发培养，过程如图5所示，其中，A为初始培养阶段，B为愈伤组织的过渡培养阶段，C为体细胞胚的诱导阶段，D为体细胞胚的成熟阶段。

其中，转化后愈伤初始培养阶段，继代培养基：BM+0.05mg/L 6-BA+0.05mg/L KT+0.1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，暗培养(全遮光)7d。过渡培养阶段，培养基：BM+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，暗培养(全遮光)7d。体细胞胚诱导培养及成熟培养阶段，培养基：BM+200mg/L IBA+30mg/L ABA+60g/L蔗糖+9g/L琼脂，暗培养(全遮光)40～50d。体细胞胚萌发和植株再生培养阶段，培养基：1/2MS培养基20g/L蔗糖+6g/L琼脂。通过对体细胞胚进行见光培养后14天后，淡黄色体细胞胚逐渐变绿，而一直未变为绿色的即白化体细胞胚，如图6所示，其中，A为对照体胚，即未进行转化的野生型植株，B和C均为白色体胚，A和B中的比例尺为10：1，C中的比例尺为20：1。最终，这些体细胞胚萌发获得了日本落叶松pds基因编辑突变株，如图7所示。其中绿色植株为野生型，白色植株、白色与绿色的嵌合体植株为所获得的突变体植株。

在该实施例中，本发明对所选择的5个靶位点都进行了以因枪介导的DNA-free方式的转化，其中，1、3和5号靶点均得到了白化的体细胞胚，白化体细胞胚的获得效率分别为1.436％、3.282％和1.023％但仅在3号位点获得了白化植株，并对其以及绿色植株均进行了DNA水平的检测，即分别以这些株系的叶片总DNA为模板，使用特异性引物PDS-T3-F：5’-GCGAGGAGTGATTATTTCGGTCAGG-3’(SEQ ID No.19)，PDS-T3-R：5’-GGAAGCTGCTGCTTTATCTGC-3’(SEQ ID No.20)进行PCR检测，反应体系见表9，反应条件见表10。对PCR产物进行1％的琼脂凝胶电泳检测，并对其胶回收纯化，纯化产物连接T载体进行测序。并通过网址

表9 PCR检测反应体系

表10 PCR检测反应体系

在该实施例中，将Cas9蛋白与落叶松目的基因gRNA混合，得到落叶松RNP复合物，因此该系统并不含有外源基因；本发明采用基因介导的转化方式，将所述落叶松RNP复合物转化到落叶松胚性愈伤组织中，完成对落叶松愈伤组织的基因编辑，最终细胞转化成无转基因成分(DNA-free)的落叶松基因编辑突变体，整个过程中不用构建Ti质粒，不涉及任何外源DNA，这种名为DNA-free的基因编辑方式更精准、更简单易行却丝毫没有降低该技术的特异性。

由以上实施例结果我们可以得出，采用本申请提供的落叶松DNA-free基因编辑方法可以实现落叶松的目的基因的DNA-free编辑，获得落叶松基因编辑突变体。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种基于CRISPR/Cas9系统的落叶松DNA-free基因编辑方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1752

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaaggcc ttctttgctt ttcaaggatg gatttgaagc cattgtctcg aagtggggca 60

ttgcctttgg ataaagtgca agggatgcat ataacagata tgaaacagag ctgcagcagt 120

ctgtcatctg cgaggagtga ttatttcggt caggttggag tttctgctat gcgctctgtg 180

aaaaagaaag ggatcgaaac gcgacgagga ggtcctttgc aggttacatg caaggactat 240

ccaaggccag atattgacaa tacagtcaat tttttggaag ctgctgcttt atctgcttca 300

ttcaggagtg caccacgtcc aaacagacca ttacaggttg tgatagcagg agcaggtttg 360

gctggcttgt caacggcaaa atacctagct gattctggtc acaaacctat actattggag 420

gcaagagatg ttcttggtgg aaaggtagct gcatggaagg atgatgatgg ggactggtat 480

gagacaggct tacatatttt ctttggagct tatcctaatg tacaaaactt gtttggagag 540

cttggaatca atgatcgatt acagtggaag gaacactcaa tgatctttgc tctgccaaat 600

aaacctggac aatttagccg ttttgatttc atggaggttc ttccagcacc cttgaatgga 660

atttgggcaa tcctaaagaa caatgagatg ttgacttggt cagaaaaatt acgctttgca 720

gttggacttt taccagcaat agttgggggt caagcttatg ttgaagccca agatggctta 780

actgtcaagg agtggatgcg taagcagggt gtaccagatc gagtaagcga tgaagtattt 840

gtagctatgt caaaagcttt aaattttatc aatccagaag agctttcaat gcaatgtatt 900

ttgatagcct tgaaccgttt ccttcaggaa aaacatgggt caaagatggc ttttctagat 960

ggaaatccac ctgagaggtt atgcaaacca attgttgatc atgtccaatc attaggtggt 1020

cagcttcaga taaattctcg actacaaaag attgagctta ataatgatgg cacagtgaaa 1080

cattttcttc tagctaatgg aagcattgtt gaaggagata tttatgtatc agcaatgcct 1140

gttgacatct taaagctagt tttaccccaa gaatggaagg aggtttccta ctttaagaaa 1200

ctggaaaagt tagtaggggt gcctgtaatc aacatccaca tttggtttga tagaaaactg 1260

aaaaacacat atgatcattt actgtttagc agaagtccta ttcttagtgt ctatgcagat 1320

atgtctgtta cttgcaagga atactatgat ccagatcggt caatgctgga gcttgtattt 1380

gcacctgcac aagaatggat tgctcgcagt gatgaggaga ttcttgaagc tacacttaag 1440

gaactctcga aactatttcc agatgaaatt gcagatgatg gaagtaaagc aaaggtttta 1500

aagtatcatg ttgttaaaac tccaaggtcc gtctacaaaa cagtacccag ttgcgagcct 1560

tgtcgtcctc tgcagaggtc acctataaag ggattttatt tagctggtga ctatacgaag 1620

cagaaatatt tagcatcaat ggagggtgca gtgctgtcag ggaagctttg tgcacaggct 1680

attttacagg attatagctt actcgcagct caagctggac agaatgaagt ggttgaagca 1740

gcctttgcat ag 1752

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagcagtct gtcatctgcg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcgctctgt gaaaaagaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagggatcg aaacgcgacg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtttggct ggcttgtcaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaggcaagag atgttcttgg 20

<210> 7

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taatacgact cactataggc agcagtctgt catctgcggt ttaagagcta tgctggaaac 60

agcatagcaa gtttaaataa gg 82

<210> 8

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taatacgact cactatagtg cgctctgtga aaaagaaagt ttaagagcta tgctggaaac 60

agcatagcaa gtttaaataa gg 82

<210> 9

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactatagaa agggatcgaa acgcgacggt ttaagagcta tgctggaaac 60

agcatagcaa gtttaaataa gg 82

<210> 10

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatacgact cactatagag gtttggctgg cttgtcaagt ttaagagcta tgctggaaac 60

agcatagcaa gtttaaataa gg 82

<210> 11

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taatacgact cactatagga ggcaagagat gttcttgggt ttaagagcta tgctggaaac 60

agcatagcaa gtttaaataa gg 82

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgcaaggcc ttctttgc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctgtctcat accagtcc 18

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggagctcatg caaggccttc tttgc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtcgaccct gtctcatacc agtcc 25

<210> 16

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttatttaaa 60

cttgctatgc tgtttccagc 80

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaaaaaagca ccgactcggt gc 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaaattaata cgactcacta tag 23

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgaggagtg attatttcgg tcagg 25

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggaagctgct gctttatctg c 21