抗HER2多肽衍生物作为新的诊断分子探针

技术领域

本发明涉及与人表皮生长因子受体2(HER2)结合的新多肽衍生物及其缀合物，以及它们作为诊断剂的用途，特别是用于以HER2的过表达为特征的癌症形式的早期检测、患者分层和治疗监测。

背景技术

近年来，生物标志物的发现因其在诊断和治疗领域中鉴定病理状态的最早事件的潜能正在成为一种动态而强大的方法。开发能够识别参与疾病状态的分子途径的靶标的探针也变得极具挑战性。这些探针必须能够改善诊断程序，以便更好地应用当前的治疗方案，改善治疗效果并减少患者的过度治疗。

原癌基因HER2或HER2/neu(人表皮生长因子受体2)编码被称为HER2蛋白或受体的细胞表面受体的产生，它是参与控制正常细胞生长和分化的信号的传递的酪氨酸激酶受体的ErbB家族的成员。由于肿瘤细胞中DNA复制系统的错误，HER2基因可以被扩增，导致细胞表面上HER2蛋白的过表达。特别是HER2受体的过表达发生在25-30％的人乳腺原发性癌

由于这些原因，HER2代表了许多肿瘤治疗和诊断方法的重要分子靶标。在抑制肿瘤细胞表面上的HER2蛋白的方法中，一些使用单克隆抗体的人源化变体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)和帕妥珠单抗(pertuzumab))的疗法近年来已上市，用于治疗HER2阳性肿瘤；然而，尽管在临床上取得了成功，但它们的使用与一些毒性作用和对健康组织的不良副作用有关，这是一个令人担忧的原因。

一般来说，许多抗体的特征是缓慢且效率低下的肿瘤穿透、长生物分布时间和从血液的缓慢清除率，并且对于诊断应用，需要使用长寿命的放射性同位素并在后期时间点进行成像，从而使患者暴露于高辐射负担。此外，单克隆抗体可能具有免疫原性，因此排除了常规诊断程序的重复施用。

因此，仍然非常需要继续提供能够与HER2形式相互作用的新分子。

这些问题可以例如通过使用小分子来规避。

最近，已经描述了小的结合多肽(4到20kDa)，例如亲和体(affibody)、纤连蛋白和DARPin，并作为用于非侵入性成像方法的抗体的潜在替代品引起了人们的兴趣。通常，此类肽已被证明在体内是生物相容的和低免疫原性的、高度选择的并能够结合和识别特定靶标，并呈现纳摩尔范围内的亲和常数(K

此外，与抗体和其他大分子(M

特别地，结合HER2受体的新型小成像探针的开发可以在提供用于患者分层、用于预测或监测对特定抗癌疗法的反应的特定成像剂方面和甚至在通过光学成像、磁共振成像、核成像、计算机断层扫描成像、超声和多模态成像技术的肿瘤的图像引导手术中具有很大的价值。

特别地，在抗体模拟分子类别中，亲和素(affitin)是由小的单链亲和蛋白(7kDa，通常为66个氨基酸)组成的化合物，正在研究其高的组织穿透潜力。此类肽的已知实例是

此外，除了极其稳定和强健之外，亲和素多肽对于关于抗体的成像具有更好的药代动力学特征，并且可以使用重组细菌技术轻松大量生产。

例如，Goux M.等人,Bioconjugated Chem.2017,28,2361-2371

在已知的抗体模拟多肽中，已经研究了几种与HER2结合的亲和体序列，例如在WO2009/080810

在WO2012/096760

WO2017/161096

因此，尽管做出了努力，仍然需要鉴定和开发如上所述的HER2结合剂，其特征在于对靶标具有高的和特异性的亲和力，以用作HER2阳性肿瘤的诊断剂，特别是用于监测HER2阳性肿瘤的治疗。

发明内容

本发明涉及新的多肽序列，其特征在于亲和素结构，以高亲和力特异性靶向HER2受体。

具体而言，本发明涉及包含以下氨基酸序列的HER2结合多肽：

VKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREK(SEQID NO：1)。

考虑到HER2蛋白的过表达作为病理状态的标志物，与乳腺癌和许多其他类型的肿瘤有关，一旦用成像部分标记，从更有效的治疗性治疗和/或减少患者过度治疗的角度来看，本发明的HER2结合亲和素可用于早期癌症诊断和分期。

为此，它们可以有效地与标记部分缀合，从而在体外和/或体内分析过程中轻松识别和评估。这种缀合物或复合物也是本发明的目的。

发现本发明的亲和素具有适合用于诊断工具的特性，例如对靶标HER2的纳摩尔亲和力、不与白蛋白结合、低预测免疫原性、在HER2阳性细胞中的良好内化和良好的表达产率。特别地，本发明的亲和素及其缀合物能够特异性识别靶标在生理上存在的位点处(即表达HER2的细胞表面上)的靶标，因此允许其体内应用。

此外，已经发现本发明的亲和素能够识别靶标HER2的与目前用于临床治疗HER2阳性肿瘤的单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗所识别的表位不同的特定表位，因此允许例如使用本发明的亲和素作为试剂来测试响应曲妥珠单抗和/或帕妥珠单抗疗法的HER2受体表达的变化。

附图说明

参考以下发明详述和附图可以更好地理解本发明的特征，其中：

图1表示Aff04多肽的RP-HPLC色谱图，显示存在二聚体形式；

图2表示Aff04多肽在二硫键还原和烷基化后的MALDI-TOF质谱(采集范围600-20,000m/z)；

图3报告了缀合物IRDye80iCW-Aff04对HER2阳性细胞系SKBR3相对HER2阴性细胞系A431的亲和力测定；

图4报告了使用曲妥珠单抗-生物素或帕妥珠单抗-生物素相对Aff04多肽的竞争性ELISA测试的结果；

图5报告了使用曲妥珠单抗-生物素相对Aff04多肽(a)或帕妥珠单抗-生物素相对Aff04多肽(b)的不同竞争性ELISA测试的结果；

图6报告了曲妥珠单抗(a)或帕妥珠单抗(b)在存在或不存在Aff04的情况下的曲线；

图7报告了在Balb/c nu/nu小鼠中以10nmol/小鼠的剂量施用的缀合物IRDye800CW-Aff04的荧光信号曲线(平均值，标准偏差，n＝3)；

图8报告了以10nmol/小鼠的剂量注射后48小时，缀合物IRDye800CW-Aff04在健康小鼠中的离体生物分布。

序列表的简要说明

-SEQ ID NO：1列出了本发明的命名为Aff03的亲和素的64aac序列：

VKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREK；

-SEQ ID NO：2列出了对应于SEQ ID NO：1的衍生变体的77aac序列，在C末端用Cys和在N末端用六组氨酸标签进行工程改造，命名为亲和素Aff04：

MRGSHHHHHHGSVKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREKC；

-SEQ ID NO：3鉴定了与亲和素Aff04和Aff04-0的N末端相连的His

MRGSHHHHHHGS；

-SEQ ID NO：4是对应于Aff04(SEQ ID NO：2)的工程化多肽，不含C-末端半胱氨酸，命名为Aff04-0：

MRGSHHHHHHGSVKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREK；

-SEQ ID NO：5鉴定了由序列Aff04-0(SEQ ID NO：4)与假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A(Pe38)的截短部分融合形成的工程化多肽：

MRGSHHHHHHGSVKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREKKLGSAGSAAGSGEFGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPKDEL。

发明详述

本发明的一个目的是提供对人表皮生长因子受体2(HER2)具有亲和力的新试剂，特别是特征在于特异性结合HER2的多肽及其衍生物和缀合物。

因此，在第一方面，本发明提供特异性结合HER2的多肽，其包含氨基酸序列VKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREK(SEQ ID NO：1)。优选地，这样的序列具有最多100个氨基酸的长度。更优选地，它具有最多80个氨基酸的长度。

在一个优选的具体实施方案中，本发明提供了由如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽。

在不背离本发明范围的情况下，可以对以上定义的多肽进行不同的修饰和/或添加，包括例如向序列中添加另外的氨基酸，用任何接头或间隔物衍生，或与特定标记或成像部分缀合，如下文更详细描述。

例如，本发明还包括其中上述HER2结合多肽带有在一个或两个末端位置添加的额外氨基酸残基的多肽，前提是它们不改变所述肽的生物学功能。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合HER2中发挥作用，但同样可以很好地用于其他目的，例如与多肽的生产、纯化、稳定化、偶联和/或检测有关。优选地，此类额外的氨基酸残基可包含一个或多个为化学偶联目的而添加的氨基酸残基。一个优选的实施方案涉及在多肽链的第一个或最后一个位置，即在N或C末端，添加至少一个含有硫醇基团(例如半胱氨酸或同型半胱氨酸)或在侧链含有伯氨基(例如赖氨酸)或羧酸基团(例如谷氨酸或天冬氨酸)的氨基酸。

在另一个实施方案中，这种用于化学偶联的残基也可以通过替换蛋白质结构域表面上(优选地在不参与靶结合的一部分表面上)的另一个氨基酸来引入。

在一些实施方案中，所述适合于偶联的残基还可以由合成或非天然氨基酸或功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸模拟物表示。非限制性实例选自β

额外的氨基酸残基还可以包含用于纯化、分离或检测多肽的“标签”，例如六组氨酰标签，或与对标签具有特异性的抗体相互作用的“myc”标签或“FLAG”标签，或本领域技术人员熟知的其他替代物，其可以单独使用或与结合靶标偶联。

因此，在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种HER2结合多肽，其包含氨基酸序列MRGSHHHHHHGSVKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREKC(SEQ ID NO：2)，对应于通过在C末端添加Cys和在N末端添加带His

在一个优选的实施方案中，本发明提供了由如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的HER2结合多肽。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种HER2结合多肽，其包含氨基酸序列MRGSHHHHHHGSVKVKFGHMGEEKEVDTSKIYAVNRAGKFVHFAYDDNGKFGSGSVPEKDAPKELLDMLARAEREK(SEQ ID NO：4)，对应于通过在N末端添加带His

在另一个实施方案中，本发明提供了由如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的HER2结合多肽。

特别地，在肽的N末端的额外的六组氨酸标签可用于按照已知程序通过Ni-NTA柱纯化蛋白质，例如如Bornhorst J.A.等人,Methods Enzymol.2000,326,245-254

本发明还涵盖包含序列SEQ ID NO：1的多肽的多聚体，例如二聚体。例如，在一个实施方案中，本发明提供了包括两个包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽的同源二聚体分子或包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽和对HER2或其他靶分子具有高结合亲和力的不同多肽的异二聚体分子，以产生可用于多种生物技术应用的多特异性试剂。

根据本发明的这种多聚体中的连接的多肽“单元”可以使用已知的有机化学方法通过共价偶联连接，或者表达为在用于多肽重组表达的系统中的一种或多种融合多肽，或者以任何其他方式直接或通过接头例如氨基酸接头连接。

在多种应用中，所有上述定义的多肽都可以被认为是针对HER2的抗体的合适替代物。因此，本发明的一个方面涉及如上所述的HER2结合多肽，其与化合物缀合或被标记以形成报告部分，其适用于由HER2过表达引起和/或与HER2过表达相关的癌症疾病的诊断或成像。

“报告部分”是指可以通过成像技术直接或间接检测的分子，其中本发明的HER2结合多肽与至少一种可检测的标记或材料(例如其光学性质可以测量的染料；包含磁性颗粒的造影剂；或包含囊泡的气体)连接。例如当报告部分仅通过与环境或改变其可检测性的其他材料相互作用而变得可检测时，报告部分是不可直接检测的。

用于检测此类报告部分的合适成像技术包括例如磁共振、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、超声(US)、光声成像(PAI)、近红外荧光(NIRF)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或与光学成像(OI)相关的技术。

特别地，PET成像技术还包括immunoPET，其中通过直接靶向感兴趣的受体(例如用抗体或抗体模拟分子)获得疾病的特定生物标志物信息。

对于成像应用，本发明的多肽与通常选自以下的标记连接：能够产生荧光信号的荧光团部分，例如荧光素、FITC、Alexa染料、花青染料、DyLight染料、IRDye染料或VivoTag染料；光学部分，包括可用于使用光学成像产生对比度或信号的试剂；磁性或顺磁性部分，包括能够与顺磁性金属离子形成稳定络合物的用于磁共振的螯合剂，顺磁性金属离子包括例如Gd(III)、Mn(II)、Cr(III)、Cu(II)、Fe(III)、Pr(III)、Nd(III)、Sm(III)、Tb(III)、Yb(III)、Dy(III)、Ho(III)和Er(III)；放射性标记同位素，包括例如

优选地，在用放射性核素标记的情况下，使用螯合剂或多齿配体进行这种络合，形成螯合物(特别是与放射性金属)。这种螯合剂的非限制性例子是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)；2,2’,2”-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酸(NOTA)；2-[双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙酸(DTPA)；乙二胺四乙酸(EDTA)，10-(2-羟丙基)-1,4,7-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸(HP-DO3A)；1,4-双(羧甲基)-6-[双(羧甲基)]氨基-6-甲基全氢-1,4-二氮杂卓(AAZTA)及其衍生物。

因此，在一个优选的实施方案中，本发明包括放射性标记的多肽，其由上述HER2结合多肽的螯合物和放射性核素如放射性金属组成。更优选地，放射性金属是

在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽与选自花青染料的荧光团部分(例如IRDye800CW、IRDye650、IRDye680、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ZW800-1、AlexaFluor750AlexaFluor790，及其类似物和衍生物)缀合。

此外，可以使用标签系统连接多肽和标记，包括生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉亲和素和生物素/中性抗生物素蛋白。

因此，在另一个优选的方面，本发明提供了与亲和标记例如生物素连接的如上定义的多肽。

本发明的靶向多肽与标记或成像部分之间的偶联可以通过本文实施例中描述的方法或本领域技术人员熟知的其他方法进行。例如，它们可以共价或非共价连接，任选地通过插入合适的接头或间隔物，用于标记。

通常，此类接头或间隔物可单独或组合包含氨基酸或核酸序列或反应性部分，包括例如氨氧基、叠氮基、炔基、硫醇基或马来酰亚胺基。

此类接头优选包含两个功能部分，一个提供快速和有效的标记，另一个能够快速和有效地与本发明的多肽偶联，例如通过胺基团或优选通过半胱氨酸的硫醇基团。例如，马来酰亚胺基团与硫醇基团反应形成稳定的硫醚键。优选地，最终复合物通过首先使标记与接头反应，然后与多肽的硫醇基团反应而形成。

本发明的多肽(适当地与标记缀合以形成报告部分)可用于HER2相关状态、病症、功能障碍、病况或疾病的诊断和分期，并用于监测这样的状态下的治疗反应，特别是用于在临床环境下靶向以HER2蛋白过表达为特征的癌症疾病。示例性应用包括诊断与HER2表达相关的癌症疾病，例如乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌和胃肠道肿瘤。

因此，在另一方面，本发明提供如上定义的多肽缀合物，用于诊断或可视化由HER2过表达引起和/或与之相关的癌症疾病，即用于通过评估患者病史、检查和审查实验室数据来鉴定或确定HER2相关的疾病的性质和原因的过程中。特别地，此类多肽缀合物可用于对过表达HER2的身体组织或器官系统进行成像。更优选地，它可以用于确定治疗前后的HER2表达，这可以通过获取治疗前后的图像来完成，以及用于确定HER2表达的程度或解剖学内容，例如用于手术目的或用于患者分层。

在又一方面，本发明提供了如上所述的多肽缀合物在制备用于检测以HER2过表达为特征的癌组织或器官的成像剂中的用途。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含如本文定义的多肽或多肽缀合物以及一种或多种合适的药学上可接受的承载体、赋形剂、稀释剂和/或添加剂。组合物的成分可以根据预期用途而变化，无论是用于诊断还是成像应用。这种组合物还可以包含一种或多种选自防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂的佐剂。

该组合物可以进一步包含一种或多种不同的成像剂。

在一个实施方案中，本发明提供了用于对带有HER2的靶组织进行成像的如上所述的组合物，其中该组合物包含与如上定义的用成像部分缀合或标记的本发明的多肽。该组合物可以例如也是脂质体或纳米颗粒的形式，并且可以适用于不同类型的施用。优选地，所述成像使用选自磁共振、正电子发射断层扫描(PET)、计算机断层扫描(CT)、超声(US)、光声成像(PAI)、近红外荧光(NIRF)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或与光学成像(OI)相关的成像技术进行。

在一个实施方案中，该组合物适用于肠胃外施用，优选静脉内或皮下施用，例如以用于制备无菌注射溶液、分散体或乳液制剂的无菌水溶液或分散体或粉末的形式。在另一个实施方案中，上述组合物可以局部施用或通过吸入施用。

所述组合物被提供用于与成像技术一起使用，以可视化表达HER2的肿瘤，例如乳腺癌。

在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含在一个或多个容器中的至少一种本发明的多肽，优选地用成像部分标记或缀合，以及使用说明书。

本发明还提供了对患有以HER2过表达为特征的癌症的哺乳动物受试者，优选人的至少一部分进行体内成像的方法，该方法包括以下步骤：

-向受试者施用如上所述的组合物；

-任选地监测组合物向受试者的递送；

-使用诊断设备对受试者进行成像；和

-任选地诊断患有HER-2相关疾病状况的受试者。

本发明的多肽可以通过重组表达获得，即通过在表达质粒(其可以在例如大肠杆菌中表达)中进行序列克隆，并通过亲和层析纯化，例如按照Huet S.等人,PLoS ONE 2015,10(11):e0142304

例如，预培养物可以在37℃下在含有葡萄糖和抗生素的培养基中生长过夜。预培养物可以在含有葡萄糖和抗生素的培养基中稀释，并在37℃生长至对数中期。然后，可以通过添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷来诱导蛋白质表达，并将培养物在30℃下摇动过夜。细菌可以通过离心沉淀，然后重新悬浮在裂解缓冲液中。可以在室温下进行细胞裂解，持续1小时，并将悬浮液离心以去除细胞碎片。然后可以使用镍树脂和含有250mM咪唑的洗脱缓冲液，通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)从上清液中纯化Histag蛋白。

本发明的另一方面涉及编码上述多肽的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种表达载体，其包含上述核酸分子和任选地其他核酸元件，其使得能够通过核酸分子的表达产生根据本发明的多肽。

此外，本发明涉及包含所述表达载体的宿主细胞(例如真核细胞、原核细胞或植物细胞)。

上述方面代表了本领域技术人员熟知的用于生产本发明多肽的重组技术。

可替代地，本发明的多肽也可以通过其他已知方式产生，包括化学合成，例如使用标准固相合成技术，或在不同宿主例如植物和转基因动物中表达。

现在将通过对根据本发明执行的实施例的描述来详细说明本发明。

实验部分

提供以下实施例仅用于举例说明并且不应解释为限制本发明。

设备

根据以下实施例制备的本发明的序列及其缀合物通过UV/VIS(光密度)、SE-HPLC、RP-HPLC和MALDI-TOF MS分析数据通过使用以下方法之一进行表征：

SE-HPLC：尺寸排阻HPLC分析在30℃下使用Sepax Zenix SEC-80 4.6x 300mm柱(进样量：10μL)以1ml/min的流速进行。该仪器配备有280/780nm的UV/VIS检测器。流动相是150mM磷酸盐缓冲液，pH7.0。

RP-HPLC：除非另有说明，否则HPLC分析是在40℃下使用Jupiter Proteo(Phenomenex)4.6x 250mm柱(进样量：10μL)以1.2ml/min的流速进行的。该仪器配备有280/780nm的UV/VIS检测器。流动相A是水中的0.1％TFA，流动相B是乙腈中的0.1％TFA。梯度报告如下：

MALDI-TOF MS：通过MALDI-TOF Ultraflex II质谱仪(Bruker Daltonics)获得质谱。样品通过装载到10μL移液器吸头C18 ZipTip上进行预处理，以去除盐分并以10μL体积洗脱。在样品纯化后，使用最终浓度为100μM的样品在600至20,000的m/z范围内获得质谱。

流式细胞术分析(FACS)使用BD Accuri

亲和实验通过生物层干涉(BLI)测定法进行，使用Octet系统和蛋白A生物传感器(FortéBio)。重组人蛋白hHER2购自R&D Systems(Minneapolis,US)。

体内成像实验使用IVIS光谱体内成像系统(Perkin Elmer Inc.)进行，该系统配备跨越430–850nm的10个窄带激发滤光片(30nm带宽)和18个窄带发射滤光片(20nm带宽)。

在配备有3100质量检测器、600四元泵梯度模块、2767样品管理器和2487紫外/可见光检测器的Waters AutoPurification系统上，通过制备型HPLC进行Aff04-AAZTA缀合物的纯化。使用Atlantis

产物的纯度通过分析型HPLC监测，该分析型HPLC采用配备Waters 2998光电二极管阵列检测器的Waters 2695Alliance分离模块并使用：

(对于AAZTA衍生物)Waters Atlantis DC18 5μm(4.6X150 mm)柱。梯度曲线：10％B 0分钟、10％B 5分钟、65％B 15分钟、100％B20分钟、100％B 25分钟。流速；1mL/min；λ：210nm；或者

(对于Aff04-AAZTA缀合物)Waters Xterra RP8 5μm，4.6x150mm柱。梯度曲线：25％B 0分钟、25％B 5分钟、33％B 11分钟、33％B 15分钟、80％B 17分钟、95％B 18分钟、95％B 20分钟。

缩略语表

HER2 人表皮生长因子受体2

kDa 千道尔顿

HSA 人血清白蛋白

MSA 小鼠血清白蛋白

BSA 牛血清白蛋白

ELISA 酶联免疫吸附测定

BLI 生物层干涉

K

aac 氨基酸

RT 室温

Pe38 假单胞菌外毒素A的截短部分

TCEP 三(2-羧乙基)膦

UV/VIS 紫外/可见分光光度法

SE-HPLC 尺寸排阻高效液相色谱

RP-HPLC 反相高效液相色谱

DTT 二硫苏糖醇

MALDI-TOF 基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱

PBS 磷酸盐缓冲液

TBS-T Tris缓冲盐水–吐温20

TMB 四甲基联苯胺

TCEP 三(2-羧乙基)膦

HRP 辣根过氧化物酶

DIPEA N,N-二异丙基乙胺

HATU 1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐

TFA 三氟乙酸

TIS 三异丙基硅烷

单个氨基酸残基的缩写是常规的：例如，Cys或C是半胱氨酸，Asp或D是天冬氨酸，Gly或G是甘氨酸，Arg或R是精氨酸。除非另有说明，否则本文所指的氨基酸应理解为具有L-异构体构型。

实施例

实施例1：根据本发明的亲和素的制备

为了选择性地靶向HER2受体，已通过几轮连续筛选(多至6轮)针对靶标富集了亲和素文库。在任何选择轮次后，通过ELISA测定监测来跟踪抗HER2亲和素的富集，还控制与人(HSA)、鼠(MSA)和牛(BSA)血清白蛋白的可忽略不计的结合的条件。在选择过程结束时，已发现命名为Aff03(SEQ ID NO：1)的亲和素对HER2具有纳摩尔亲和力，不与白蛋白结合并且具有低的计算机模拟免疫原性。

通过对筛选步骤中鉴定的选定克隆进行测序获得多肽Aff04。按照Huet S.等人,PLoS ONE 2015,10(11):e0142304

这样衍生的亲和素被命名为Aff04(SEQ ID NO：2)。

实施例2：测定亲和素Aff03的细胞内化

Aff03的细胞内化使用专门的基于细胞的测定进行评估。简而言之，Aff03用SEQID NO：3标记(即形成序列Aff04-0)，然后融合到假单胞菌外毒素A的截短部分，其中该毒素的细胞内化结构域被去除，从而形成具有如SEQ ID NO：5所示序列的最终肽。这种截短形式(Pe38)需要通过Aff03内化以保持其细胞毒性活性。

然后，为了测试内化，在不同的nanofitin浓度下测量了乳腺癌细胞系SK-BR-3(过表达HER2受体)和乳腺癌细胞系MCF-7(低表达HER2受体)的活力。在SK-BR-3细胞上观察到剂量依赖性细胞毒性诱导，而相反，在MCF-7细胞上未观察到显著变化。由于Aff03触发内化，细胞死亡诱导证明了Pe38通过HER2受体的有效转运。

实施例3：亲和素Aff04与IRDye800CW-马来酰亚胺的偶联

购买IRDye800CW-马来酰亚胺(Li-CorInc.,USA)以将这种荧光团IRDye800CW的活化形式与亲和素Aff04(SEQ ID NO：2)的C末端的反应性半胱氨酸标签缀合。

由于末端游离半胱氨酸具有高反应性，它还导致在储备溶液中形成蛋白质的二聚体形式。在氧的存在下确实形成两个单体的Cys末端残基之间的二硫键。因此，在缀合之前对Aff04储备溶液进行了还原步骤。通过与温和还原剂(TCEP)一起孵育，将Aff04储备溶液在磷酸盐缓冲液(0.02M磷酸盐、0.054M KCl、0.274M NaCl、pH7.4)中还原。具体而言，将50μL 0.5M的TCEP添加到5mg的亲和素Aff04中，并在室温下孵育1-16小时(优选1-2小时)。使用脱盐柱(例如，Zeba脱盐旋转柱,Thermo Scientific)从过量的还原剂纯化获得的单体蛋白质。

然后将纯化的Aff04与5mg IRDye800CW-马来酰亚胺(溶解在500μL DMSO中)在室温下在黑暗条件(以避免漂白)下孵育1-3小时，优选2小时。在反应结束时，如上所述，在脱盐柱上纯化命名为IRDye800CW-Aff04的缀合物。

收集含有缀合物IRDye800CW-Aff04的级分，并通过UV/VIS分光光度法测量其230至830nm的光密度和通过SE-HPLC(参见图1)和RP-HPLC来表征。产生的IRDye800CW-Aff04的浓度为1.71mg/mL(摩尔消光系数：12051.52M

还进行了RP-HPLC分析以检查二聚体蛋白质的还原。二聚体和与IRDye800CW缀合的Aff04的色谱图表明，二硫键的还原在缀合之前有效地进行。

通过流式细胞术在细胞表面上测试荧光探针的有效性。

实施例4：亲和素Aff04与AAZTA螯合剂的偶联

螯合剂1,4-双(羧甲基)-6-[双(羧甲基)]氨基-6-甲基全氢-1,4-二氮杂卓(AAZTA)根据以下反应方案1制备：

简而言之，在10mL圆底烧瓶中，将50mg(tBu)4-AAZTA-C4-COOH(0.0744mmol)溶解在5mL二氯甲烷中并将DIPEA(3eq.,0.223mmol,39μL)和HATU(0.9eq.,0.0670mmol,25.5mg)添加到反应溶液中。10分钟后，将1.1eq.的1-(2-氨基乙基)马来酰亚胺盐酸盐(0.0819mmol，14.5mg)加入所得溶液中。1小时后，将溶液用水(3x2mL)和盐水(1x1mL)洗涤，在Na

HPLC纯度：99％，p：11.84mg，总产率：28％。

ESI-MS(m/z)：计算值：对于C

缀合步骤：

在氩气氛下，向Aff04亲和素溶液中加入5eq的TCEP。30分钟后，HPLC分析证实二硫键完全还原。将10eq的AAZTA-N-乙基马来酰亚胺加入溶液中并将反应在室温下搅拌45分钟。HPLC分析证实完全转化为所需产物。该溶液在Zeba旋转脱盐柱7K MWCO上纯化两次，以从Aff04-AAZTA溶液中分离所有AAZTA-N-乙基马来酰亚胺。通过紫外分光光度法在280nm(ε2980cm

HPLC纯度98％

计算的MW：9243.22；(M(H+)12/12)：771.28；实验MW(M(H+)12/12)：771.25

实施例5：分析表征

非缀合的亲和素Aff04的分析表征通过MALDI-TOF质谱在上文所述的条件下进行。在用10μL移液器吸头C18 ZipTip进行预处理以去除盐分后，样品(10μL)用2μL DTT(PBS中的20mM)处理以还原两个C末端Cys之间的硫化桥，将反应在50℃下孵育15分钟，然后在冰上冷却。然后将获得的单体烷基化以避免进一步二聚化。为此，加入2μL碘乙酰胺(PBS中的40mM)，并将反应在室温下孵育15分钟。然后，再次将样品装载到10μL移液器吸头C18ZipTip上用于进行纯化。

对于未缀合多肽在m/z范围600至20,000上获得的MS光谱显示在m/z 8677和17405处存在两个主要峰，第一个峰与单体肽有关，第二个峰与二聚肽有关，通过创建硫化桥形成。在亲和素Aff04的还原和烷基化后，第一个峰的贡献增加，而第二个峰减少，如图2所示。

实施例6：未标记的亲和素Aff04-0对HER2受体的体外亲和力测定

本发明的多肽对靶标HER2的亲和力通过生物层干涉测定法测量。为此，将蛋白质A生物传感器(FortéBio)用人HER2(hHER2)重组蛋白进行包被。用PBS短暂洗涤后，将包被的传感器相对不同浓度(即10000、500、250、125、62.5、31.3、15.6和0nM)的亲和素Aff04-0进行测定。

然后进行曲线拟合分析以确定解离平衡常数。使用带有1：1结合拟合模型的Octet数据分析软件8.2(FortèBio)分析传感图，以确定解离平衡常数(K

所得动力学曲线显示纳摩尔范围内的与Aff04-0亲和素相关的K

表1–hHER2-Aff04-0复合物的解离平衡常数

实施例7：IRDye800CW-Aff04缀合物与HER2受体的体外亲和力测定

IRDye800CW-Aff04缀合物对靶标HER2的亲和力通过生物层干涉测定法测量。为此，将蛋白质A生物传感器(FortéBio)用人HER2(hHER2)重组蛋白进行包被。用PBS短暂洗涤后，将包被的传感器相对不同浓度(即10000、1000、100、10、1、0.1ng/mL)的IRDye800CW-Aff04缀合物进行测定。

进行稳态分析以确定解离平衡常数。使用具有1：1结合拟合模型的Octet数据分析软件8.2(FortèBio)分析传感图以确定解离平衡常数(K

这些数据表明，与未标记的Aff04-0相比，荧光团与亲和素Aff04的C末端半胱氨酸的偶联没有显著改变K

表2–复合IRDye800CW-Aff04缀合物/hHER2的解离平衡常数

实施例8：亲和素IRDye800CW-Aff04缀合物对细胞的体外亲和力

为了评估缀合物IRDye800CW-Aff04的结合特异性，对两种不同类型的人类癌细胞系进行流式细胞术分析(FACS)，特别是过表达HER2受体(HER2+)的乳腺癌细胞系SK-BR-3，以及不表达HER2受体(HER2-)的表皮样癌细胞系A431。将细胞保持在冰上(4℃)进行整个程序，以评估缀合物IRDye800CW-Aff04结合暴露受体的能力。简而言之，将每个样品200,000个SK-BR3(HER2+)和A431(HER2-)细胞分布在1.5mL eppendorf管中的50μL FACS缓冲液(PBS/0.5％BSA/0.1％NaN

通过在4℃下450RCF离心5分钟在FACS缓冲液中洗涤3次后，使用640nm(激发波长)和Em 670LP(长通滤波器)进行流式细胞术分析以检测IRDye800CW荧光团。记录的荧光值通过GraphPad Prism 7软件使用非线性回归拟合进行分析。

所得动力学曲线显示与缀合物IRDye800CW-Aff04相关的Kd为22.4±3.0x10

实施例9：Aff04多肽相对曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的竞争性ELISA

开发了竞争性ELISA测定以研究Aff04多肽识别的HER2/Neu抗原的表位是否与实际用于治疗性治疗HER2阳性肿瘤的人源化单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗识别的表位不同。

旨在评估测定的质量的第一个实验是在曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-生物素之间进行的竞争性ELISA测定。简而言之，用TBS pH7.4中的2.5μg/mL HER2/Fc嵌合蛋白包被(64孔)Medisorp透明塑料板(96孔，Thermo Scientific)(室温下1小时)。孔用TBS中的0.5％BSA封闭(室温下1小时)。

然后在TBS+0.1％吐温20(TBS-T)中以一式三份将不同浓度的曲妥珠单抗(1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025和0μg/mL)与每孔中的0.2μg/mL曲妥珠单抗-生物素一起孵育(室温下1小时)。在孵育结束时，将板用250μL TBS-T洗涤3次，并在TBS-T中与链霉亲和素-HRP 1:10000一起孵育(室温下1小时)。将板用TBS-T再次洗涤3次，并用TMB试剂(100μL)显色5分钟。用50μL 2M硫酸阻断反应，并在450nm处读数。

然后在使用Aff04相对曲妥珠单抗-生物素或帕妥珠单抗-生物素的三种替代测定中进行了相同的实验：

测定a)将不同浓度的Aff04(10000、1000、100、10、1、0.1和0.01ng/mL)与0.2μg/mL曲妥珠单抗-生物素或帕妥珠单抗-生物素一起在每个孔中以一式三份孵育。作为阳性对照，使用抗体抗RSGH TAG-HRP(1:4000)代替链霉亲和素-HRP重复相同的实验，以评估Aff04对HER2受体的曲线亲和力。绘制在图4的图中的ELISA结果表明，曲妥珠单抗-生物素、帕妥珠单抗-生物素和Aff04都是HER2受体的结合剂，但曲妥珠单抗和帕妥珠单抗识别的表位与Aff04亲和素识别的表位不同。

测定b)在固定Aff04浓度的存在下，使用变化的曲妥珠单抗-生物素和帕妥珠单抗-生物素浓度进行额外的竞争性ELISA实验。简而言之，用TBS pH7.4中的2.5μg/mL Her2/Fc嵌合蛋白包被(64孔)Medisorp透明塑料板(96孔，Thermo Scientific)(室温下1小时)。孔用TBS中的0.5％BSA封闭(室温下1小时)。然后将不同浓度的曲妥珠单抗-生物素(20000、2000、200、20、2、0.2、0.02和0ng/mL)与10μg/mL Aff04一起在TBS+0.1％吐温20(TBS-T)中在每孔中以一式两份孵育(室温下1小时)。在孵育结束时，将板用300μL TBS-T洗涤3次，并在TBS-T中与链霉亲和素-HRP 1:10000或抗RSGH TAG-HRP 1:4000一起孵育(室温下1小时)。将板用TBS-T再次洗涤3次，并用TMB试剂(100μL)显色5分钟。用50μL 2M硫酸阻断反应，并在450nm处读数。从ELISA结果可以清楚地看出，当曲妥珠单抗-生物素或帕妥珠单抗-生物素增加时，用抗RSGH-Tag Ab检测的Aff04的曲线具有可忽略不计的响应降低(分别参见图5a和5b)。

测定c)在上次竞争ELISA的相同实验条件下，使用不同浓度的曲妥珠单抗-生物素和帕妥珠单抗-生物素针对缓冲液(无竞争)和Aff04(竞争)在相同条件下进行另一竞争性ELISA测定。

总体而言，结果显示在靶向的分子之间没有竞争，因为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的曲线在存在或不存在Aff04亲和素的情况下是相等的(分别参见图6a和6b)。

从图中可以清楚地看出，Aff04保留了与HER2的结合特性，并且其对受体的特异性不受两种参考抗体的存在的影响。事实上，竞争研究表明，Aff04识别的表位与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗单克隆抗体识别的表位是分开的和不同的，因此它们不会竞争与HER2的结合。

实施例10：缀合物IRDye800CW-Aff04的体内生物分布

在健康小鼠中评估了IRDye800CW-Aff04的体内光学成像生物分布。在以10nmol/小鼠的剂量在0.2mL的施用体积中施用IRDye800CW-Aff04后，使用IVIS Spectrum系统对三只健康小鼠进行光学成像实验。在静脉内施用缀合物后15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、24小时和48小时进行实验。

在每个时间点的每个荧光图像的小鼠参考背景健康区域(后腿肌肉)和全身上绘制感兴趣区域(ROI)，以评估组织中的信号强度，表示为平均辐射效率(参见图7，报告了在Balb/c nu/nu小鼠中以10nmol/小鼠施用的IRDye800CW-Aff04的荧光信号曲线)。

通过使用单指数衰减模型进行信号的药代动力学分析以评估被测产品的半衰期，结果见表3：

表3–IRDye800CW-Aff04在肌肉和全身中的半衰期值

由此获得的两个计算的半衰期值是一致的，给出3.23小时的平均值。

这样的生物半衰期值使Aff04缀合物可能适合作为用于快速成像方案的替代工具，例如用于光学成像。

处死后，收集几个器官用于测量残余荧光(48小时后)。荧光信号强度的测量值是从每个器官的分析中获得的，在每个样品的中心选择一个感兴趣的区域(ROI)。分析的器官是：肾脏、肺、脾脏、肝脏、肌肉和心脏。

图8显示了IRDye800CW-Aff04在以10nmol/小鼠的剂量注射后48小时在健康小鼠中的离体生物分布。肾脏中较高的IRDye800CW-Aff04摄取表明它优选通过肾脏途径而不是肝胆途径清除。

参考资料

1.Slamon D.J.等人,Science 1989,244,707-712

2.McAfee J.G.等人,Biochemistry 1995,34,10063-10077

3.Mouratou B.等人,PNAS 2007,104(46),17983-17988

4.Goux M.等人,Bioconjugated Chem.2017,28,2361-2371

5.WO2009/080810A1

6.Orlova A.等人,Cancer Res.2006,66(8),4339-4348

7.WO2012/096760A1

8.WO2017/161096A1

9.Bornhorst J.A.等人,Methods Enzymol.2000,326,245-254

10.Huet S.等人,PLoS ONE 2015,10(11):e0142304

序列表

<110> 伯拉考成像股份公司

<120> 抗HER2多肽衍生物作为新的诊断分子探针

<130> B0723

<150> EP19217623.8

<151> 2019-12-18

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> 嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)

<400> 1

Val Lys Val Lys Phe Gly His Met Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Thr

1 5 10 15

Ser Lys Ile Tyr Ala Val Asn Arg Ala Gly Lys Phe Val His Phe Ala

20 25 30

Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Phe Gly Ser Gly Ser Val Pro Glu Lys Asp

35 40 45

Ala Pro Lys Glu Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu Lys

50 55 60

<210> 2

<211> 77

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程改造的HER2结合多肽

<400> 2

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Val Lys Val Lys

1 5 10 15

Phe Gly His Met Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Thr Ser Lys Ile Tyr

20 25 30

Ala Val Asn Arg Ala Gly Lys Phe Val His Phe Ala Tyr Asp Asp Asn

35 40 45

Gly Lys Phe Gly Ser Gly Ser Val Pro Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu

50 55 60

Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu Lys Cys

65 70 75

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成6xHis标签衍生物

<400> 3

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程改造的HER2结合多肽

<400> 4

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Val Lys Val Lys

1 5 10 15

Phe Gly His Met Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Thr Ser Lys Ile Tyr

20 25 30

Ala Val Asn Arg Ala Gly Lys Phe Val His Phe Ala Tyr Asp Asp Asn

35 40 45

Gly Lys Phe Gly Ser Gly Ser Val Pro Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu

50 55 60

Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu Lys

65 70 75

<210> 5

<211> 434

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 工程改造的HER2结合多肽

<400> 5

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Val Lys Val Lys

1 5 10 15

Phe Gly His Met Gly Glu Glu Lys Glu Val Asp Thr Ser Lys Ile Tyr

20 25 30

Ala Val Asn Arg Ala Gly Lys Phe Val His Phe Ala Tyr Asp Asp Asn

35 40 45

Gly Lys Phe Gly Ser Gly Ser Val Pro Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu

50 55 60

Leu Leu Asp Met Leu Ala Arg Ala Glu Arg Glu Lys Lys Leu Gly Ser

65 70 75 80

Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe Gly Gly Ser Leu Ala Ala

85 90 95

Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg

100 105 110

His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro

115 120 125

Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn

130 135 140

Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly

145 150 155 160

Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu

165 170 175

Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly

180 185 190

Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Ser Gly Pro Ala Asp Ser Gly

195 200 205

Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly

210 215 220

Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr

225 230 235 240

Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr

245 250 255

Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile

260 265 270

Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp

275 280 285

Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala

290 295 300

Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu

305 310 315 320

Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr

325 330 335

Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu

340 345 350

Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu

370 375 380

Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val

385 390 395 400

Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile

405 410 415

Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp

420 425 430

Glu Leu