一种多色青霉菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物和生物肥料技术领域，具体涉及一种多色青霉菌及其应用。

背景技术

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国南方最重要的速生优良用材树种，我国东南各省森林总面积的60％-80％，是经济与生态效益俱佳的木材生产物种。杉木多代连栽会导致林地生产力下降，土壤肥力降低，加上近些年来随着对杉木林滥砍滥伐，不合理经营导致林地养分耗竭的现象日益严重。当前，地力衰弱、养分供应不足是杉木资源培育中面临主要问题之一，如研究表明土壤磷的有效性已成为限制杉木人工林生产力提高的重要因素。

根际微生物是根际过程的关键参与者和调控者。根际土壤微生物通过改变土壤养分的有效性以及与植物根系共生的方式直接或间接影响植物群落结构及生产力。植物根际存在有大量微生物，其中部分微生物具有解磷、溶钾和分泌IAA等功能从而促进植物生长。解磷真菌作为土壤磷循环中一类重要的微生物，能够改善土壤的磷素供应。利用解磷微生物来提升杉木土壤磷素的吸收和提高杉木林生产力的能力，缓解了我国南方杉木林土壤磷缺乏的问题，也可解决化学肥料带来污染竹林生态环境、土壤板结等一系列问题。目前，有关杉木根际高效解磷真菌菌株的筛选及应用研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6及其在促进杉木生长中的应用。所述的多色青霉菌JX-M6对难溶性磷酸盐具有较好的溶解能力，促进杉木对土壤磷素的吸收利用，可明显促进植物，如杉木实生苗的生长发育。

本发明采取的技术方案为如下：

从江西省吉安市泰和县石溪林场杉木人工林根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷真菌多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6。已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M2020215，保藏日期为2020年6月18日。

多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6主要生物学特征：在PDA培养基平板上最佳生长温度28℃，培养5-6天，形成3-4cm的菌落，菌落灰绿色(图1)；分生孢子梗帚状枝，分生孢子椭圆形，单细胞(图2)。

多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6的ITS、BenA及CaM序列见SEQ IDNO.1～3所示。将所测ITS、BenA及CaM序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析。结果显示，菌株JX-M6与多色青霉菌(Penicillium multicolor)同源性很高，相识度达到91％。结合形态及ITS、BenA及CaM序列分析，鉴定为多色青霉菌(Penicillium multicolor)

因此，本发明的第一个目的在于提供一株多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2020215。

本发明的第二个目的是提供一种微生物制剂，其包含上述的多色青霉菌(Penicilliummulticolor)JX-M6。

优选的，所述的微生物制剂还包含能延长菌株活性时间的辅料，或其它微生物制剂可接受的辅料。

本发明的第三个目的是提供上述的多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6或微生物制剂在促进植物生长中的应用。

优选的，所述的植物为杉木。

本发明的第四个目的是提供上述的多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6或微生物制剂在溶解难溶性磷酸盐和/或难溶性钾盐中的应用。

优选的，所述的溶解难溶性磷酸盐和/或难溶性钾盐是将难溶性磷酸盐和/或难溶性钾盐转化为易于被植物吸收的可溶性磷酸盐和/或可溶性钾盐。

优选的，所述的难溶性磷酸盐包括磷酸三钙、磷酸铁、磷酸氢钙、磷酸铝或植酸钙。

本发明的第五个目的是提供上述的多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6或微生物制剂在制备生物肥料中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种生物肥料，含有上述的多色青霉菌JX-M6或微生物制剂。所述的生物肥料的剂型优选为粉剂、悬浮剂或颗粒剂。

本发明具有以下有益效果：

本发明的杉木根际高效解磷真菌多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6在液体摇培的条件下，对难溶性磷酸盐，如磷酸钙(Ca

多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6，其于2020年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020215。

附图说明

图1为JX-M6菌株在PDA培养基培养7d菌落形态。A：正面；B：反面。

图2为JX-M6菌株的分生孢子梗及分生孢子。

图3为JX-M6菌株的系统发育树。

图4为JX-M6菌株在NBRIP培养基培养8d产生的解磷圈。

图5为JX-M6菌株在不同pH条件下对5种对难溶性磷酸盐磷酸三钙(Ca3(PO

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1:菌株的分离及鉴定

从江西省吉安市泰和县石溪林场杉木人工林根际土壤中，筛选获得了一株高效解磷真菌多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6。多色青霉菌(Penicilliummulticolor)JX-M6主要生物学特征：在Potato Dextrose Agar培养基(PDA)平板上菌落圆形，后期长出灰绿色孢子，菌落背面呈黄色(图1)。分生孢子梗帚状枝，孢子球形，单细胞(图2)。多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6的ITS、BenA及CaM序列见SEQ ID NO.1～3所示。将所测ITS、BenA及CaM序列与GeneBank数据库中的序列进行比对分析(图3)。结果显示，JX-M6菌株与多色青霉菌(Penicillium multicolor)同源性很高，相识度达到91％。

JX-M6菌株的ITS片段序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

GGAAGTAAAAAATCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGA

GTGAGGGCCCTCCGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTCGTACCTTGTTGCTTCGGCA

GGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTCTGCCCCCGGGCCCGCGCCTGCCGGAGACA

ATTCTGAACGCTGTCTGAAGAATGCAGTCTGAGCGATTAGCAAAATTAGTTAAAACTTTC

AACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAATTAAT

GTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTAT

TCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGG

GCCCTGTTCCCCCGGGAACAGGCCCGAAAGGCAGTGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCG

AGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGTCGACCCCCCAA

CCTTTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCTCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGAGGAA。

JX-M6菌株的BenA片段序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：TTTGGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTCTGGTACGTGTTGCTACCCGACCTCACTTCCCCGGTCAAATCATCAATTGTTGAACCCAGGGGCATGATGCTAACTCTGATTACAGGCAGAACATTGCTAGCGAGCATGGCCTCGACGGCGAGGGCCAGTAAGTATCGATTCAGTTGGAATTGGATGTGATGAGAATGGCGGTCTGATGTTTTTTTTTCTTAGCTTCACTGGCCAGTCCGACCTCCAGCTCGAGCGCATGAACGTCTACTTCAACCACGTAAGTGTGGATTCGACACTCGATTTTCAACTTGATCTAATACAATGAATTCTCATAGGCCAGCGGTGACCGTTACGTTCCCCGTGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGATGCTGTCCGTGCCGGTCCTTTCGGCAAGCTTTTCCGTCCCGACAACTTCGTCTTCGGTCAGTCTGGTGCCTGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCACTACACTGAGGGTA。

JX-M6菌株的CaM片段序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：TGCCGACCTCTTTGACTGAAGAGCAAGTACTCCGAGTACATAGGAGGCATTCTCCCTCTTTGTAAGTGCTCCTACGCGTCGATTGGAAGACTCGTGACTGGATTTAATGCTGATGGATATGTTCTCCGGCAATAGGACAAGGATGGTGATGGTTAGTGCGACCGTCGGCGATTTTTCTGATCCAAGCCGACTGAATGATGCCCACCGGGAGAACCGAATAACTGAGACCGTACAATTATAGGACAAATCACCACCAAGGAGCTGGGCACCGTCATGCGCTCCCTCGGCCAGAACCCCTCCGAGTCCGAGCTTCAGGACATGATCAACGAGGTCGACGCCGACAACAACGGCACCATTGACTTCCCTGGTACGATTTCCTTTCCACCCGAAAGCTCCCACGCTCGGCCCCCGGACATATGTTAACATGCGGCACAGAGTTCCTTACCATGATGGCCCGTAAGATGAAGGACACCGACTCCGAGGAGGAGATCCGTGAGGCATTCAAGGTTTTCGACCGTGACAACAACGGTTTCATTTCCGCTGCTGAGCTGCGCCACGTTATGACCTCGATTGGCGAGAAGCTCACTGACGACGAGGTGGATGAGATGATCCGTGAGGCTGACCAGGATGGCGATGGCCGCATCGACTGTATGTTGCAAAACACCAGACTCAAAGTGACGAGTCTAGGCTTCACTTTTCCTCAACGCATATACTAACTTTGCCACAGACAACGAGTTCGTCCAGTTCCATGATGC。

结合形态及ITS、BenA及CaM序列分析，鉴定为多色青霉菌(Penicilliummulticolor)，命名为多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6。多色青霉菌(Penicillium multicolor)JX-M6，其于2020年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M2020215。

实施例2:多色青霉菌JX-M6在不同初始pH下生物量的测定

将活化的菌株JX-M6接种PDA液体培养基(配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，配制：将各成分溶于水，混合均匀，灭菌即得)中，25℃，120r/min振荡培养5d作为种子液，将PDA液体培养基的pH设置为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5六个梯度，分装于250mL三角瓶中，装液量为100mL。随后，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到PDA液体培养基中，各处理3个重复，25℃，120r/min振荡培养8d。菌丝过滤后在65℃下烘干48h，称重。结果见表1，JX-M6菌株在pH 1.5、2.5、3.5、4.5、5.5及6.5的不同酸性条件下生长较好，菌丝生物量并无差异，以上表明，JX-S1菌株能适应不同的酸性的环境，具备在不同酸性土壤环境中生长的能力。

表1.不同pH对JX-M6菌株菌丝生物量和发酵液pH的影响

注：同列不同小写字母表示具有显著性差异。

实施例3:多色青霉菌JX-M6解磷能力的检测

NBRIP培养基：葡萄糖10g，Ca

将灭菌后的NBRIP培养基倒入平板上，待平板内的培养基凝固后，将活化的菌株JX-M6接种到NBRIP平板上，30℃，培养5天，观察是否产生解磷圈。其结果如图4所示，从图4可以看出，多色青霉菌JX-M6菌落周围具有解磷圈，由此说明多色青霉菌JX-M6具有溶磷能力。

实施例4:多色青霉菌JX-M6在不同初始pH下解磷能力试验

解磷培养基A：葡萄糖10g，Ca

解磷培养基B：用磷酸铝(AlPO

解磷培养基C：用磷酸铁(FePO

解磷培养基D：用磷酸氢钙(CaHPO

解磷培养基E：用植酸钙(C

将活化的菌株JX-M6接种PDA培养基(配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，配制：将各成分溶于水，混合均匀，灭菌即得)中，25℃，120r/min振荡培养5d作为种子液，将种子液按1％(v/v)接种量分别接种到装有50mL且pH分别调至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5和7.2的解磷培养基A、B、C、D和E的100mL三角瓶中，以接种相同体积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理三个重复，25℃，121r/min培养8d后，发酵液4℃，10000r/min离心10min，钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，

结果见图5。从图5中可以得出，分别以难溶性磷酸盐磷酸三钙(Ca

实施例5:多色青霉菌JX-M6温室盆栽试验

(1)杉木苗的培育

杉木种子以质量分数为0.5％高锰酸钾溶液浸泡2h进行表面消毒，再用自来水冲洗1h后，播种于灭菌沙子中，置于25℃温室中培养，待其长到子叶期时进行芽苗截根移苗。

(2)盆栽基质：基质土壤采自江西农业大学校园后山，按照土壤：砂子：蛭石＝2：1：1的配比混合后，在165℃条件下灭菌2h，冷却后备用。

(3)液体菌剂的制备：将保存的菌株JX-M6接入PDA固体平板培养基中，于25℃培养6d，待菌丝长满平板，在无菌条件下，用打孔器(d＝7mm)在菌落边缘打成菌饼，再转接装有250mL PDA液体培养基的500mL三角瓶中扩繁，每瓶挑取10粒菌饼。置于培养温度25℃和培养转速120r·min

(4)液体菌剂接种的盆栽试验

采用芽苗截根法移栽杉木苗，菌剂接种量为10mL/株。具体方法如下：取适量无菌的盆栽基质装入花盆中，将杉木苗轻轻地从育苗盆中取出，尽量不伤及根系，并用清水将幼苗根部的沙子冲洗干净，用解剖刀将芽苗截去少量主根后移栽至花盆中，将液体菌剂放入杉木根际周围，压实土壤，再覆基质土浇水定根。以只接种PDA液体培养基、不接种菌的处理作为对照(CK)，每处理12个重复。置于25℃温室培养，适时浇水，统一管理。杉木接种后180d生长情况见表2，可以看出，施用菌剂JX-M6能够显著促进杉木苗的生长。与对照相比，接种菌剂JX-M6的处理在苗高和地径上的增长率分别达到了36.76％和36.42％，促生效果显著。

表2.菌株JX-M6对毛竹实生苗生长的影响

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注：P＜0.05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。