一类对硝基苯胺类化合物的制备方法

技术领域

本发明属于氨基酸对硝基苯胺类化合物合成技术领域，涉及一类对硝基苯胺类化合物的制备方法，尤其涉及氨基酸类对硝基苯胺的制备方法。

背景技术

对硝基苯胺显色底物是研究蛋白酶动力学和筛选酶抑制剂的一类重要生化试剂，其经过特定酶水解产生的游离对硝基苯胺在405nm波长具有明显吸收峰，且具有整个过程中所需的显色试剂用量少、灵敏度高、稳定性好等优点，因此在科学研究及体外诊断领域得到广泛应用。

该类显色底物中最常用的有L-吡咯烷酮酰对硝基苯胺、L-亮氨酸对硝基苯胺、L-精氨酸对硝基苯胺、丙氨酰-苯丙氨酰-脯氨酸对硝基苯胺、焦谷氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸对硝基苯胺、BOC-亮氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺盐酸盐等氨基酸对硝基苯胺类底物。

但由于发色体对硝基苯胺结构中氨基对位硝基的强吸电子作用的大幅降低了氨基的亲核性，导致上述底物合成过程中采用经典的多肽合成缩合剂进行对硝基苯胺的酰胺化非常困难，且很少有文献对该类底物的合成方法进行报道。

目前已有报道中采用DCC、EDCI、HATU等缩合剂或酸酐法直接缩合效率都很低，甚至采用剧毒的氯甲酸乙酯进行工艺改进的效果依旧不甚理想，报道常见收率多介于0～30％之间，不利于该类底物的扩大生产。再如，专利CN102936207提供了一种通过三氯氧磷法制备L-亮氨酸对硝基苯胺的方法，收率可达到80％左右，但由于多数氨基酸对三氯氧磷、二氯亚砜等酰卤化试剂较为敏感，故该方法应用局限性较大。

因此，如何找到一种更为适宜的氨基酸对硝基苯胺类化合物的制备路线，解决现有技术中存在的上述问题，更加有利于工业化的推广和应用，一直是业内诸多一线研究人员广为关注的焦点之一。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一类对硝基苯胺类化合物的制备方法，特别是一类氨基酸类对硝基苯胺的制备方法。本发明提供的制备方法针对对氨基酸对硝基苯胺类化合物适用性强，所得目标物纯度高，收率高，工艺简单，可控性强，更加有利于工业化生产扩大化的推广和应用。

本发明提供了氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，包括以下步骤：

1)将对硝基苯胺、BOC-氨基酸和六氯三聚磷腈经过研磨反应后，静置，再与溶剂混合进行加热后，过滤得到BOC-氨基酸对硝基苯胺；

2)将上述步骤得到的BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，脱BOC反应后再纯化，得到氨基酸对硝基苯胺；

或者：

经过上述步骤1)和2)，得到氨基酸对硝基苯胺；

3)将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺；

或者：

经过上述步骤1)、2)和3)，再重复步骤3)，得到多肽对硝基苯胺。

优选的，所述步骤1)中，BOC-氨基酸包括BOC-吡咯烷酮酸、BOC-L-亮氨酸、BOC-L-脯氨酸或BOC-L-精氨酸；

所述步骤1)中，对硝基苯胺与BOC-氨基酸的摩尔比为1：1；

所述步骤1)中，对硝基苯胺与六氯三聚磷腈的摩尔比为1：(0.35～0.65)。

优选的，所述研磨反应的温度为20～55℃；

所述研磨反应的时间为10～90min；

所述静置的时间为5～30min。

优选的，所述步骤1)中的溶剂包括饱和食盐水；

所述步骤1)中，研磨反应后的混合物与所述溶剂的质量比为1：(3～20)；

所述加热的温度为50～90℃；

所述加热的时间为5～40min。

优选的，所述过滤后还包括固相洗涤步骤；

所述洗涤的试剂包括饱和食盐水和/或50％～95％乙醇溶液；

所述步骤1)中的BOC-氨基酸对硝基苯胺为纯度在96％以上的BOC-氨基酸对硝基苯胺纯品。

优选的，所述酸性溶液包括含0.5mmol/L～3mol/L HCl的30％～75％的乙醇溶液；

所述酸性溶液的使用量为BOC-氨基酸对硝基苯胺质量的5～50倍；

所述步骤2)中的氨基酸对硝基苯胺为纯度在98％以上的氨基酸对硝基苯胺纯品。

优选的，所述步骤2)中，脱BOC反应的温度为20～55℃；

所述步骤2)中，脱BOC反应的时间为0.5～6h；

所述步骤2)中，纯化的方式包括重结晶。

优选的，所述步骤3)中的BOC-氨基酸包括BOC-丙氨酸、BOC-苯丙氨酸、BOC-脯氨酸、BOC-吡咯烷酮酸、BOC-甘氨酸或BOC-亮氨酸；

所述步骤3)中的BOC-氨基酸的选择方法包括根据氨基酸断肽链延长需求，选择相应的BOC-氨基酸。

优选的，所述助剂包括缩合剂、缚酸剂和反应溶剂中的一种或多种；

所述缩合剂包括EDCI/NHS、EDCI/HOBt、DCC/DMAP、HATU和HBTU中的一种或多种；

所述缚酸剂包括TEA、DIPEA和吡啶中的一种或多种；

所述反应溶剂包括DMF和/或DCM。

优选的，所述氨基酸类对硝基苯胺，具有式I-1至I-6所示的结构：

本发明提供了氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，包括以下步骤，首先将对硝基苯胺、BOC-氨基酸和六氯三聚磷腈经过研磨反应后，静置，再与溶剂混合进行加热后，过滤得到BOC-氨基酸对硝基苯胺；然后将上述步骤得到的BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，脱BOC反应后再纯化，得到氨基酸对硝基苯胺；或者，经过上述步骤1)和2)，得到氨基酸对硝基苯胺；再将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺；或者，经过上述步骤1)、2)和3)，再重复步骤3)，得到多肽对硝基苯胺。与现有技术相比，本发明采用对硝基苯胺为原料，首先与BOC保护的氨基酸通过研磨反应制备相应的BOC-氨基酸对硝基苯胺，经简单洗涤纯化后得到纯度在98％以上的BOC-氨基酸对硝基苯胺，然后根据需要通过酰胺缩合剂进行氨基酸对硝基苯胺肽链的延长。

本发明合成方法以原料氨基酸与对硝基苯胺的酰胺化为第一步工艺方案，然后根据需要对氨基酸进行肽链延伸，得到二肽、三肽等对硝基苯胺类发色底物，具备反应收率高、底物纯度高、且对氨基酸对硝基苯胺类底物合成具备一定应用普遍性，可实现大批量生产等技术优势。本发明制备的对硝基苯胺类化合物具有式I-1至I-6所示的多种结构，其显色效果佳，可满足科学研究及体外诊断领域中酶活性检测应用需求。

实验结果表明，采用本发明提供的氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，所制备的目标物HPLC纯度普遍高于98％。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。

本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯或满足氨基酸对硝基苯胺类化合物制备领域相关的纯度标准即可。

本发明所有原料，其来源和简称均属于本领域常规来源和简称，在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或常规方法制备得到。

本发明提供了氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，包括以下步骤：

1)将对硝基苯胺、BOC-氨基酸和六氯三聚磷腈经过研磨反应后，静置，再与溶剂混合进行加热后，过滤得到BOC-氨基酸对硝基苯胺；

2)将上述步骤得到的BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，脱BOC反应后再纯化，得到氨基酸对硝基苯胺；

或者：

经过上述步骤1)和2)，得到氨基酸对硝基苯胺；

3)将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺；

或者：

经过上述步骤1)、2)和3)，再重复步骤3)，得到多肽对硝基苯胺。

本发明首先将对硝基苯胺、BOC-氨基酸和六氯三聚磷腈经过研磨反应后，静置，再与溶剂混合进行加热后，过滤得到BOC-氨基酸对硝基苯胺。

在本发明中，所述步骤1)中，BOC-氨基酸优选包括BOC-吡咯烷酮酸、BOC-L-亮氨酸、BOC-L-脯氨酸或BOC-L-精氨酸。

在本发明中，所述步骤1)中，对硝基苯胺与BOC-氨基酸的摩尔比优选为1：1。

在本发明中，所述步骤1)中，对硝基苯胺与六氯三聚磷腈的摩尔比优选为1：(0.35～0.65)，更优选为1：(0.4～0.6)，更优选为1：(0.45～0.55)。

在本发明中，所述研磨反应的温度优选为20～55℃，更优选为25～50℃，更优选为30～45℃，更优选为35～40℃。

在本发明中，所述研磨反应的时间优选为10～90min，更优选为25～75min，更优选为40～60min。

在本发明中，所述静置的时间优选为5～30min，更优选为10～25min，更优选为15～20min。

在本发明中，所述步骤1)中的溶剂优选包括饱和食盐水。

在本发明中，所述步骤1)中，研磨反应后的混合物与所述溶剂的质量比优选为1：(3～20)，更优选为1：(7～16)，更优选为1：(11～12)。

在本发明中，所述加热的温度优选为50～90℃，更优选为55～85℃，更优选为60～80℃，更优选为65～75℃。

在本发明中，所述加热的时间优选为5～40min，更优选为10～35min，更优选为15～30min，更优选为20～25min。

在本发明中，所述过滤后还优选包括固相洗涤步骤。

在本发明中，所述洗涤的试剂优选包括饱和食盐水和/或50％～95％乙醇溶液，更优选包括饱和食盐水或50％～95％乙醇溶液，更优选为饱和食盐水或60％～85％乙醇溶液，更优选为饱和食盐水或70％～75％乙醇溶液。

在本发明中，所述步骤1)中的BOC-氨基酸对硝基苯胺优选为纯度在96％以上的BOC-氨基酸对硝基苯胺纯品。

本发明再将上述步骤得到的BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，脱BOC反应后再纯化，得到氨基酸对硝基苯胺。

在本发明中，所述酸性溶液优选包括含0.5mmol/L～3mol/L HCl的30％～75％的乙醇溶液，更优选为含1mmol/L～2.5mol/L HCl的30％～75％的乙醇溶液，更优选为含1.5mmol/L～2mol/L HCl的30％～75％的乙醇溶液，更优选为含0.5mmol/L～3mol/L HCl的40％～65％的乙醇溶液，更优选为含0.5mmol/L～3mol/LHCl的50％～55％的乙醇溶液。

在本发明中，所述酸性溶液的使用量优选为BOC-氨基酸对硝基苯胺质量的5～50倍，更优选为15～40倍，更优选为25～30倍。

在本发明中，所述步骤2)中的氨基酸对硝基苯胺优选为纯度在98％以上的氨基酸对硝基苯胺纯品。

在本发明中，所述步骤2)中，脱BOC反应的温度优选为20～55℃，更优选为25～50℃，更优选为30～45℃，更优选为35～40℃。

在本发明中，所述步骤2)中，脱BOC反应的时间优选为0.5～6h，更优选为1～5h，更优选为2～4h。

在本发明中，所述步骤2)中，纯化的方式优选包括重结晶。具体的，所述重结晶只需要进行简单的碱洗、水洗即可。

本发明还提供了氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，包括以下步骤：

经过上述步骤1)和2)，得到氨基酸对硝基苯胺；

3)将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺。

即，1)将对硝基苯胺、BOC-氨基酸和六氯三聚磷腈经过研磨反应后，静置，再与溶剂混合进行加热后，过滤得到BOC-氨基酸对硝基苯胺；

2)将上述步骤得到的BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，脱BOC反应后再纯化，得到氨基酸对硝基苯胺；

3)将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺。

本发明上述制备方法中，步骤1)和2)与前述制备方法中的步骤1)和2)的具体工艺，参数选择以及相应的优选原则，可以进行一一对应，再次不再赘述。

本发明经过上述步骤1)和2)，得到氨基酸对硝基苯胺，最后将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺。

在本发明中，所述步骤3)中的BOC-氨基酸优选包括BOC-丙氨酸、BOC-苯丙氨酸、BOC-脯氨酸、BOC-吡咯烷酮酸、BOC-甘氨酸或BOC-亮氨酸。

在本发明中，所述步骤3)中的BOC-氨基酸的选择方法优选包括根据氨基酸断肽链延长需求，选择相应的BOC-氨基酸。

在本发明中，所述助剂优选包括缩合剂、缚酸剂和反应溶剂中的一种或多种，更优选为缩合剂、缚酸剂或反应溶剂。

在本发明中，所述缩合剂优选包括EDCI/NHS、EDCI/HOBt、DCC/DMAP、HATU和HBTU中的一种或多种，更优选为EDCI/NHS、EDCI/HOBt、DCC/DMAP、HATU或HBTU。

在本发明中，所述缚酸剂优选包括TEA、DIPEA和吡啶中的一种或多种，更优选为TEA、DIPEA或吡啶。

在本发明中，所述反应溶剂优选包括DMF和/或DCM，更优选为DMF或DCM。

本发明还提供了氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，包括以下步骤：

经过上述步骤1)、2)和3)，再重复步骤3)，得到多肽对硝基苯胺。

即，1)将对硝基苯胺、BOC-氨基酸和六氯三聚磷腈经过研磨反应后，静置，再与溶剂混合进行加热后，过滤得到BOC-氨基酸对硝基苯胺；

2)将上述步骤得到的BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，脱BOC反应后再纯化，得到氨基酸对硝基苯胺；

3)将上述步骤得到的氨基酸对硝基苯胺、BOC-氨基酸和助剂通过催化酰胺化法进行肽链延长，得到BOC-二肽对硝基苯胺，再将BOC-二肽对硝基苯胺通过步骤2)的方法，脱BOC后，得到二肽对硝基苯胺；

再重复步骤3)，得到多肽对硝基苯胺。

本发明经过上述步骤1)、2)、3)得到二肽对硝基苯胺，再重复步骤3)，得到多肽对硝基苯胺。即，根据肽链长短，循环操作步骤3)，获得所需目标物。

本发明上述制备方法中，步骤1)、2)、3)与前述制备方法中的步骤1)、2)、3)的具体工艺，参数选择以及相应的优选原则，可以进行一一对应，再次不再赘述。重复循环步骤3)时，通过选择相应的BOC-氨基酸，获得所需目标产物。

在本发明中，所述氨基酸类对硝基苯胺，优选具有式I-1至I-6所示的结构：

本发明为完整和细化整体技术方案，更好的保证目标产物的结构和参数，进一步提高反应的收率和产率，上述一类对硝基苯胺类化合物的制备方法具体可以包括以下步骤：

本发明还提供了所述的氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，其特征在于，包括：

1)、在适当温度下，将一定量的对硝基苯胺、BOC-氨基酸、六氯三聚磷腈固体置于研钵中研磨反应一定时间，并于室温下放置一定时间后，用适量的饱和食盐水将混合物转移至锥形瓶中并加热一定时间，然后减压过滤、洗涤即可得到相应的纯度在96％以上的BOC-氨基酸对硝基苯胺纯品；

2)、将BOC-氨基酸对硝基苯胺置于酸性溶液中，一定温度下反应一定时间后过滤洗涤即可得到纯度在98％以上的氨基酸对硝基苯胺纯品；

3)、根据氨基酸断肽链延长需求，选择相应的BOC-氨基酸通过酰化剂催化酰胺化方案进行肽链延长，进而得到所需目标物；

4)、对进行肽链延长后的底物，进一步采用步骤2)方案进行二肽对硝基苯胺的制备；

5)根据肽链长短，循环操作步骤3)、4)，获得所需目标物。

具体的，所述步骤1)研磨化反应中适当反应温度介于20℃～55℃。

具体的，所述步骤1)研磨化反应中一定量的对硝基苯胺、BOC-氨基酸、六氯三聚磷腈固体，摩尔比介于1:1:0.35～1:1:0.65。

具体的，所述步骤1)研磨化反应中BOC-氨基酸包括BOC-吡咯烷酮酸(即BOC-L-焦谷氨酸)、BOC-L-亮氨酸、BOC-L-脯氨酸、BOC-L-精氨酸。

具体的，所述步骤1)研磨化反应时间介于10min～90min。

具体的，所述步骤1)研磨化反应完成后需于室温下静置的时间介于5min～30min。

具体的，所述步骤1)研磨化反应中转移反应混合物所用饱和食盐水为混合物总量的3～20倍，浆液加热温度介于50℃～90℃。

具体的，所述步骤1)研磨化反应中洗涤滤饼所用液体有饱和食盐水、50％～95％乙醇溶液。

具体的，所述步骤2)脱BOC反应所用酸性溶液为含0.5mmol/L～3mol/L HCl的30％～75％乙醇溶液，使用量为BOC-氨基酸对硝基苯胺质量的5～50倍。

具体的，所述步骤2)脱BOC反应温度介于20℃～55℃。

具体的，所述步骤2)脱BOC反应时间介于0.5h～6h。

具体的，所述步骤2)脱BOC反应纯化方案为重结晶，只需要进行简单的碱洗、水洗即可。

具体的，所述步骤3)肽链延长反应所用的BOC-氨基酸包括BOC-丙氨酸、BOC-苯丙氨酸、BOC-脯氨酸、BOC-吡咯烷酮酸(即BOC-L-焦谷氨酸)、BOC-甘氨酸、BOC-亮氨酸。

具体的，所述步骤3)肽链延长反应所用的缩合剂包括EDCI/NHS、EDCI/HOBt、DCC/DMAP、HATU、HBTU，缚酸剂为TEA、DIPEA或吡啶，反应溶剂为DMF或DCM。

具体的，所述步骤4)脱BOC反应所用酸性溶液为含0.5mmol/L～3mol/L HCl的30％～75％乙醇溶液，使用量为BOC-氨基酸对硝基苯胺质量的3～50倍。

具体的，所述步骤4)脱BOC反应温度介于20℃～55℃。

具体的，所述步骤4)脱BOC反应时间介于0.5h～6h。

具体的，所述步骤4)脱BOC反应纯化方案为重结晶，只需要进行简单的碱洗、水洗即可。

具体的，一类氨基酸类对硝基苯胺，具有式I-1至I-6所示的结构：

本发明上述内容提供了一类对硝基苯胺类化合物的制备方法。本发明采用对硝基苯胺为原料，首先与BOC保护的氨基酸通过研磨反应制备相应的BOC-氨基酸对硝基苯胺，经简单洗涤纯化后得到纯度在98％以上的BOC-氨基酸对硝基苯胺，然后根据需要通过酰胺缩合剂进行氨基酸对硝基苯胺肽链的延长。

本发明合成方法以原料氨基酸与对硝基苯胺的酰胺化为第一步工艺方案，然后根据需要对氨基酸进行肽链延伸，得到二肽、三肽等对硝基苯胺类发色底物，具备反应收率高、底物纯度高、且对氨基酸对硝基苯胺类底物合成具备一定应用普遍性，可实现大批量生产等技术优势。本发明制备的对硝基苯胺类化合物具有式I-1至I-6所示的多种结构，其显色效果佳，可满足科学研究及体外诊断领域中酶活性检测应用需求。

实验结果表明，采用本发明提供的氨基酸类对硝基苯胺的制备方法，所制备的目标物HPLC纯度普遍高于98％。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一类对硝基苯胺类化合物的制备方法进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。

实施例1

L-吡咯烷酮酰对硝基苯胺的制备

1.1称取对硝基苯胺(13.8g,100mmol)、BOC-L-焦谷氨酸(22.7g,100mmol)、六氯三聚磷腈(17.4g,50mmol)于研钵中，50℃研磨30min，并于室温下放置20min后用300mL饱和食盐水将混合物转移至1000mL锥形瓶中搅拌加热至65℃，20min后减压抽滤，用100mL75％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得浅黄色固体28.9g，HPLC纯度99.1％，收率82.06％。

所得BOC-L-焦谷氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):350.09[M+H]

1

1.2称取25.0g BOC-L-焦谷氨酰-对硝基苯胺置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应1.5h，减压抽滤并用100mL50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得15.31g类白色固体，HPLC纯度98.5％，收率84.48％。

所得L-焦谷氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):250.12[M+H]

1

实施例2

L-亮氨酸对硝基苯胺的制备

2.1称取对硝基苯胺(13.8g,100mmol)、BOC-L-亮氨酸(23.1g,100mmol)、六氯三聚磷腈(17.4g,50mmol)于研钵中，室温下研磨35min，并于室温下放置20min后用300mL饱和食盐水将混合物转移至1000mL锥形瓶中搅拌加热至65℃，20min后减压抽滤，用100mL75％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得浅黄色固体31.2g，HPLC纯度96.5％，收率85.78％。

所得BOC-L-亮氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):352.14[M+H]

1

2.2称取25.0g BOC-L-亮氨酰-对硝基苯胺置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应1.5h，减压抽滤并用100mL 50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得14.10g类白色固体，HPLC纯度99.3％，收率78.30％。

所得L-亮氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):252.10[M+H]

1

实施例3

L-精氨酸对硝基苯胺的制备

3.1称取对硝基苯胺(13.8g,100mmol)、BOC-L-精氨酸(27.4g,100mmol)、六氯三聚磷腈(17.4g,50mmol)于研钵中，40℃下研磨35min，并于室温下放置30min后用300mL饱和食盐水将混合物转移至1000mL锥形瓶中搅拌加热至80℃，20min后减压抽滤，用100mL85％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得浅黄色固体30.5g，HPLC纯度97.8％，收率75.71％。

所得BOC-L-精氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):395.15[M+H]

1

3.2称取25.0g BOC-L-精氨酰-对硝基苯胺置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含2.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL60％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得15.24g类白色固体，HPLC纯度98.1％，收率80.16％。

所得L-精氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):255.09[M+H]

1

实施例4

丙氨酰-苯丙氨酰-脯氨酸对硝基苯胺的制备

4.1称取对硝基苯胺(13.8g,100mmol)、BOC-L-脯氨酸(21.5g,100mmol)、六氯三聚磷腈(17.4g,50mmol)于研钵中，室温下研磨25min，并于室温下放置15min后用300mL饱和食盐水将混合物转移至1000mL锥形瓶中搅拌加热至50℃，20min后减压抽滤，用100mL75％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得浅黄色固体29.55g，HPLC纯度96.8％，收率85.39％。

所得BOC-L-脯氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):336.07[M+H]

1

4.2称取25.0g BOC-L-脯氨酰-对硝基苯胺置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL60％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得15.08g类白色固体，HPLC纯度98.5％，收率84.69％。

所得L-脯氨酰-对硝基苯胺的质谱数据如下：MS-ESI(m/z):255.09[M+H]

4.3称取L-脯氨酰-对硝基苯胺(11.75g,50mmol)、EDCI(14.3g,75mmol)、NHS(8.63g,75mmol)、BOC-L-苯丙氨酸(15.9g,60mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(13mL,75mmol)及400mLDCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×500mL、有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩除去溶剂得到浅黄色固体状BOC-L-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺21.38g，备用。

4.4称取BOC-L-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺(19.3g,40mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得类白色固体状L-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺12.92g，备用。

4.5称取L-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺(9.55g,25mmol)、EDCI(7.15g,37.5mmol)、NHS(4.32g,37.5mmol)、BOC-L-丙氨酸(5.67g,30mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(6.5mL,37.5mmol)及200mLDCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×300mL、有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩除去溶剂得到浅黄色固体状BOC-L-丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺11.52g，备用。

4.6称取BOC-L-丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺(11.0g,20mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥后柱层析纯化得白色固体状丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺7.55g，HPLC纯度98.4％，收率：77.39％。

所得L-丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):454.15[M+H]

1

实施例5

焦谷氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸对硝基苯胺

5.1称取实施例3所得L-精氨酰-对硝基苯胺(14.71g,50mmol)、EDCI(14.3g,75mmol)、NHS(8.63g,75mmol)、BOC-L-脯氨酸(12.91g,60mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(13mL,75mmol)及400mLDCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×500mL、有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩除去溶剂得到浅黄色粘稠状BOC-L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺23.36g，备用。

5.2称取BOC-L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯(19.7g,40mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得类白色固体状L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯12.27g，备用。

5.3称取L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯(9.78g,25mmol)、EDCI(7.15g,37.5mmol)、NHS(4.32g,37.5mmol)、BOC-L-焦谷氨酸(6.81g,30mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(6.5mL,37.5mmol)及200mL DCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×300mL、有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩除去溶剂得到浅黄色发泡状固体BOC-L-焦谷氨酸-L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺13.41g，备用。

5.4称取BOC-L-焦谷氨酸-L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺(12.05g,20mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥后柱层析纯化得白色固体状丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酰-对硝基苯胺7.47g，HPLC纯度99.0％，收率：73.59％。

所得L-焦谷氨酸-L-脯氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):503.18[M+H]

1

实施例6

BOC-亮氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺

6.1称取实施例3所得L-精氨酰-对硝基苯胺(14.71g,50mmol)、EDCI(14.3g,75mmol)、NHS(8.63g,75mmol)、BOC-L-甘氨酸(10.51g,60mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(13mL,75mmol)及400mLDCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×500mL、有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩除去溶剂得到浅黄色粘稠状BOC-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺21.32g，备用。

6.2称取BOC-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯(18.05g,40mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入150mL含1.5mol/L的HCl的50％乙醇溶液，室温下反应2h，减压抽滤并用100mL50％乙醇溶液洗涤滤饼，真空干燥得类白色固体状L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯10.81g，备用。

6.3称取L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯(8.78g,25mmol)、EDCI(7.15g,37.5mmol)、NHS(4.32g,37.5mmol)、BOC-L-亮氨酸(6.94g,30mmol)加入1000mL圆底烧瓶中，加入DIPEA(6.5mL,37.5mmol)及200mLDCM，室温下搅拌反应18h，反应完成后用纯化水萃取3×300mL、有机相经无水硫酸钠干燥、柱层析纯化后得到白色固体状BOC-亮氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺10.37g，HPLC纯度98.5％，收率：72.39％。

所得BOC-亮氨酰-L-甘氨酰-L-精氨酸-对硝基苯胺的质谱及核磁氢谱数据如下：

MS-ESI(m/z):565.21[M+H]

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以上对本发明提供的氨基酸类对硝基苯胺的制备方法进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。