清除腺病毒的CRISPR-Cas9重组载体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种清除腺病毒的CRISPR-Cas9重组载体及其应用。

背景技术

人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)分为A-G 7个类别，100多种不同的血清型。其中，B类(HAdV-3、-7、-14和-55)和E类(HAdV-4)与ARDS高度相关，并且会导致更高的发病率和死亡率。腺病毒在免疫力低下的患者中可引起多器官感染，包括咽结膜热、肺炎、流行性角膜结膜炎、胃肠炎、肝炎、膀胱炎、脑炎等，严重的可危及生命。此外，HAdV可引起潜伏感染，在免疫抑制患者中，它可以在严重疾病或死亡后重新激活。未经治疗的严重HAdV肺炎或播散性疾病的死亡率可超过50％。

目前，CRISPR-Cas基因组编辑系统已成为基础生物医学研究和疾病治疗中最强大的平台之一。CRISPR-Cas9是一种由sgRNA引导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术，它几乎可以靶向任何一种基因，实现基因组的定点突变、敲除或插入。这种方法已被证明在靶向多个基因方面具有高度特异性和高效率。目前已有研究成功的将CRISPR-Cas9系统应用于病毒学领域，如高危人乳头瘤病毒、乙肝病毒、流感病毒等。

迄今为止，将CRISPR-Cas9系统高效递送至体内靶细胞仍然是一个挑战。尽管病毒载体已广泛用于CRISPR-Cas9系统的体外和体内递送，但病毒载体的固有缺点，如致癌风险、插入大小的限制、免疫反应和大规模生产的困难等，严重限制了它们的应用。鉴于这些担忧，非病毒基因传递已成为一种有前途的替代方法。随着非病毒载体的快速发展，在用于制造非病毒载体(脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、肽纳米颗粒和无机纳米颗粒)的多种不同材料中，阳离子聚合物纳米材料由于具有极低的细胞毒性已显示出用于递送CRISPR/Cas系统的巨大潜力。因此，针对腺病易造成潜伏感染、散播性感染，且无有效的治疗药物和预防性疫苗等问题，对目前人感染腺病毒流行型别(HAdV-7)，急需建立针对腺病毒的清除技术。

发明内容

本发明所要解决的主要问题是如何清除人腺病毒，建立人腺病毒清除技术。

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组载体。

本发明提供的重组载体为表达sgRNA和核酸酶Cas9的表达载体，所述sgRNA的靶标为人腺病毒-7型保守蛋白的编码基因。

上述重组载体中，所述人腺病毒-7型保守蛋白为HAdV-7六邻体蛋白(Hexon)。所述HAdV-7Hexon的氨基酸序列为genbank号：OP815345。(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OP815345)

上文中，所述重组载体含有核苷酸序列为5’-AAAATGGGCGGGGCGGCCGT-3’、5’-CAATGCTGGCCTACGCTACC-3’、5’-AGAGTGCACCAGCCACACCG-3’所示的sgRNA基因。

上文中，所述重组载体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

在一个具体实施例中，所述重组载体可为重组载体CRISPR-Cas9-19220。重组载体CRISPR-Cas9-19220表达靶向于腺病毒Hexon基因的sgRNA，靶序列为：5’-GGAAACTCCAGACAGCCAT-3’，该sgRNA的靶点位于HAdV-7Hexon基因，该sgRNA的靶点的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第246-265位。CRISPR-Cas9-19220含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的第1-347位的sgRNA基因表达盒，sgRNA靶序列如序列表的SEQ IDNo.1的第246-265位核苷酸所示，第1-241位核苷酸为启动sgRNA基因转录的启动子，第342-347位核苷酸为终止sgRNA基因转录的终止子。

为了解决上述问题，本发明还提供了如下生物材料，所述生物材料为如下任一种：

1)含有前文所述重组载体的重组微生物；

2)含有前文所述重组载体的重组细胞；

3)含有前文所述重组载体的动物细胞系；

4)含有前文所述重组载体的动物组织；

5)含有前文所述重组载体的动物器官。

在具体实施例中，构建前文所述的重组载体的方法可为如下：将前文所述的sgRNA与出发载体连接，获得能够表达靶向人腺病毒-7型保守蛋白的编码基因的sgRNA的重组载体。

所述出发载体可为CRISPR-Cas9载体2X_pX458_pSpCas9(BB)-2A-GFP。

本发明所述的重组微生物中，所述重组微生物可为大肠杆菌DH5α。

为了解决上述问题，本发明还提供了一种人腺病毒抑制剂。

本发明提供的人腺病毒抑制剂含有前文所述的重组载体。

上文中，所述人腺病毒抑制剂还含有聚合物纳米载体。

上文中，所述聚合物纳米载体为jetOPTIMUS阳离子聚合物纳米材料。

上文所述重组载体或所述生物材料在制备人腺病毒抑制剂中的应用也属于本发明要求保护的范围。

上述应用中，所述人腺病毒抑制剂为抑制人腺病毒复制的制剂。

本发明还提供了上文所述重组载体或所述生物材料在制备预防和/或治疗人腺病毒药物或制备抗人腺病毒药物中的应用。

本文中，所述人腺病毒为人腺病毒HAdV-7株(GenbankID:OP815345)。

本研究对目前人感染腺病毒流行型别(HAdV-7)，建立针对腺病毒的CRISPR-Cas9系统清除技术。通过寻找高效的sgRNA靶点，建立腺病毒多靶点CRISPR-Cas9系统。并在此基础上利用阳离子聚合物纳米材料实现对腺病毒清除系统的高效递呈。通过体内外验证CRISPR-Cas9系统的清除效果，最终建立利jetOPTIMUS阳离子聚合物纳米材料递呈CRISPR-Cas9系统清除腺病毒的治疗策略，不仅为腺病毒的防治提供新策略和新技术，也能为其它病毒感染新型治疗方法的研发提供理论和技术上的支撑。

附图说明

图1为HAdV结构图。腺病毒蛋白衣壳包含3种主要蛋白(Hexon、Penton、fiber)。

图2为重组载体CRISPR-Cas9-sgRNA结构示意图。

图3为重组载体CRISPR-Cas9-sgRNA的PCR验证。

图4为SnapGene3.2.1测序后比对结果图(SEQ ID No.1部分序列)。第一行为pX458-Cas9质粒部分序列，第二行第三行为靶点附近测序结果。

图5为转染24h后A549细胞正置显微镜观察结果图(10×/0.25Ipc)其中A.对照组：未转染jetOPTIMUS-DNA复合体的A549细胞生长状态，B.实验组：JetOPTIMUS-DNA复合体转染到A549细胞后的细胞生长状态。

图6为荧光显微镜成像图(1000um)。其中A对照组：未转染jetOPTIMUS-DNA复合体的A549细胞细胞光学显微镜成像图，B.实验组：jetOPTIMUS-DNA复合体转染到A549细胞光学显微镜成像图。

图7为CCK法转染前后细胞活性检测结果图。其中实验组为：jetOPTIMUS-DNA复合体转染到A549细胞的细胞活性；对照组为：未转染jetOPTIMUS-DNA复合体的A549细胞的细胞活性。

图8为染毒24h后A549细胞正置显微镜下观察结果图。A：实验组(转染jetOPTIMUS-DNA复合体+染毒)的A549细胞的细胞形态；B:对照组1(转染jetOPTIMUS+染毒)的A549细胞的细胞形态；C:对照组2(仅染毒)的A549细胞的细胞形态。

图9为sgRNA(SEQ ID No.19220)应用后病毒清除qPCR验证结果。其中A：实验组(转染jetOPTIMUS-DNA复合体+染毒)的qPCR结果；B:对照组1(转染jetOPTIMUS+染毒)的qPCR结果和C:对照组2(仅染毒)的qPCR结果。

图10为递呈CRISPR-Cas9清除系统后免疫荧光进行病毒清除效果验证。其中A：实验组(转染jetOPTIMUS-DNA复合体+染毒)的IF结果图；B:对照组1(转染jetOPTIMUS+染毒)的IF结果图和C:对照组2(仅染毒)的IF结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。

本发明实施例中人腺病毒HAdV-7已记载于：Genebank ID:OP815345，公众可以从中国人民解放军疾病预防控制中心获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

本发明实施例中CRISPR-Cas9载体2X_pX458_pSpCas9(BB)-2A-GFP购于AddGenePlasmid，货号：#172221。

实施例1、清除腺病毒HAdV的CRISPR-Cas9重组载体的构建

1、剪切HAdV的高效gRNA靶点筛选

从NCBI数据库以及本地腺病毒测序数据中查找人腺病毒7型(简称HAdV-7)的序列信息，利用序列比对分析软件对各型别腺病毒序列的保守区和亚型的特异性序列进行分析，根据CRISPR-Cas9系统中靶点序列及间隔序列的限制要求，以及转录CRISPR-Cas9系统靶点时对序列长度、序列GC含量、二级结构的相关要求，同时排除与人源基因序列相近的靶点序列，从而筛选设计相应的靶序列，建立腺病毒清除靶点数据库。结构蛋白Hexon(六邻体)进行靶点设计(图1)。对腺病毒的制备包含目标序列(20bp)和原型间隔子相邻基序(PAM)序列的100-bp dsDNA插入片段，使用了一组寡核苷酸并使用T4 PNK。dsDNA片段被纯化并插入到带有T7 DNA连接酶(NEB)的gRNA克隆载体的BbsI位点。利用http://crispor.tefor.net/、http://crispr.stanford.edu/等网站设计针对HAdV-7(GenebankID:OP815345)Hexon的特异性sgRNA靶点。

设计了10个sgRNA靶点，如下表1所示，后续对sgRNA进行剪切效果验证。

表1.本发明涉及的HAdV-7sgRNA靶点

2、重组载体CRISPR-Cas9-sgRNA的构建

sgRNA质粒载体构建过程采用Golden Gate技术，利用IIS型限制酶(Bpi1)识别非回文序列，并在识别序列外部切割DNA产生粘性末端从而与进行退火程序后形成的sgRNA双链进行相连，从而成功将sgRNA质粒片段插入到目的质粒2X_pX458_pSpCas9(BB)-2A-GFP中，得到重组载体CRISPR-Cas9-sgRNA。重组载体CRISPR-Cas9-sgRNA的结构示意图见图2。

以重组载体CRISPR-Cas9-sgRNA中的CRISPR-Cas9-19220为例，其他重组载体与CRISPR-Cas9-19220仅在于sgRNA序列(详见表1)不同，具体构建步骤如下：

1)质粒克隆

2X_pX458_pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒从AddGene获得，下文简称pX458-Cas9质粒。

合成2条sgRNA互补单链DNA寡核苷酸:F:5’-CACCGGAAACTCCAGACAGCCATG-3’，R:5’-AAACCATGGTGTCTGGAGTTTCC-3’，各取1μL上游引物(100μM)、1μL(100μM)下游引物、1μLT4 DNA Ligase Reaction Buffer(美国NEB：B0202S)、0.5μL的T4Polynuleotide Kinase(美国NEB：M0201V)和7.5μL无酶水混合后进行退火反应，退火条件如下：37℃/30min，95℃/5min，然后以6℃/min的下降速度降温至4℃完成退火反应，得到退火产物sgRNA-19220。

使用Golden Gate(北京康为世纪生物科技有限公司:CW0655M)技术，将退火产物sgRNA-19220与pX458-Cas9质粒骨架进行酶切酶连反应，配置如下体系：1μL退火反应产物、0.6μL BpiI(BbsI)(美国Thermo ER1012)、0.5μL T7 DNA连接酶(美国NEB M0318S)和1μLpX458-Cas9质粒骨架，将上述体系溶液轻微震荡混匀后并短暂离心，将得到的体系溶液置于PCR仪中执行以下程序：在37℃/5min和16℃/5min条件下进行5个循环，将退火后双链DNA插入pX458-Cas9 crRNA质粒骨架中，完成酶切酶连步骤。

2)质粒转染培养

取0.4μL的步骤1)获得的酶切连接产物加入到100μL冰浴中融化后的DH5α感受态细胞(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0808H)中，吹打混匀后置于冰面上冰浴30min并将冰浴后的溶液在42℃水浴锅中热击90s使得质粒进入感受态细胞中，热击后迅速转入冰面冷却3min，随后加入900μL无抗性的LB液体培养基并置于37℃摇床中以180rpm/min的速度培养45min后完成菌体的复苏。取100μL复苏后的菌液均匀涂布于带有氨苄西林抗性的LB固体培养板中用以培养和筛选目的单菌落，将涂布好的LB培养板置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

挑取数个生长状况良好的单菌落溶于25μL Es Taq Master Mix、2μL上游引物：5’-CACCGGAAACTCCAGACAGCCATG-3’、2μL下游引物：5’-AAACCATGGTGTCTGGAGTTTCC-3’和21μL无酶水混合液中，振荡混匀并短暂离心置于PCR仪中执行以下程序：95℃/10min完成变性步骤，94℃/30s，60℃/30s，72℃/30s共进行35个循环完成退火步骤，最后72℃/5min完成延伸步骤，实现对目的片段的PCR扩增，2％浓度的凝胶电泳对PCR产物进行验证，结果如图3所示，PCR产物成功扩增出长度为200bp左右的扩增产物，表明crRNA已成功插入CRISPR-Cas9质粒骨架中。

将扩增后的PCR产物送北京天一辉远生物公司测序：上游引物(5’-GGAAAGTCCCTATTGGCGTTA-5’)、2μL下游引物(5’-AAACCATGGTGTCTGGAGTTTCC-3’)，将测序结果与目的基因序列比对，筛选成功插入目的sgRNA的重组载体CRISPR-Cas9-19220(图4)，挑取成功构建质粒的单菌落于50mL含氨苄西林(浓度：100μg/mL)抗性的LB液体培养基中，置于37℃摇床中以180rpm/min的速度过夜培养。

3)质粒提取

使用凯杰质粒中提试剂盒(德国QIAGEN 12943)参照试剂商提供的试剂盒说明书对重组载体CRISPR-Cas9-19220进行提取，获得纯化的重组载体CRISPR-Cas9-19220以用于细胞清除实验。

重组载体CRISPR-Cas9-19220结构示意图如图2。重组质粒CRISPR-Cas9-19220结构描述如下：CRISPR-Cas9-19220的核苷酸序列是序列表中的SEQ ID No.1。CRISPR-Cas9-19220表达靶向于Hexon基因的sgRNA，靶序列为：5’-GGAAACTCCAGACAGCCATG-3，该sgRNA的靶点位于Hexon基因，该sgRNA的靶点的核苷酸序列是SEQ ID No.1的第246-265位。CRISPR-Cas9-19220含有核苷酸序列是SEQ IDNo.1的第1-347位的sgRNA基因表达盒，sgRNA靶序列如序列表的SEQ ID No.1的第246-265位核苷酸所示，第1-241位核苷酸为启动sgRNA基因转录的启动子，第342-347位核苷酸为终止sgRNA基因转录的终止子。

CRISPR-Cas9-19220含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的第849-6951位的Cas9蛋白基因表达盒，序列1中的第1779-5879位核苷酸编码Cas9蛋白，第849-1134位核苷酸为启动Cas9蛋白基因转录的启动子，第6744-6951位核苷酸为终止Cas9蛋白基因转录的终止子。

含有其它sgRNA的重组载体的构建步骤与上述重组载体的CRISPR-Cas9-19220构建步骤相同，区别仅在于SEQ ID No.1的第246-265位的sgRNA不同，具体sgRNA序列见上表1。

实施例2、CRISPR-Cas9-sgRNA对HAdV清除效果体外验证

1、A549细胞复苏、传代、铺板

将于液氮中保存的人非小细胞肺癌细胞A549细胞株(ATCC)置于37℃水浴中完全融化，并迅速将融化后的细胞液转移至15mL离心管中1800rpm/3min以获得细胞沉淀，去除上清液后向离心管中加入5mL完全培养基：90％DMEM(美国Gibco：10564029)+10％胎牛血清(美国Amresco：332-100)+1％双抗(美国Life Technologies：15140122)，完全重悬细胞后将细胞液转移至带有透气孔的T25细胞培养瓶中置于37℃二氧化碳培养箱中培养，直至细胞丰度达到80％-90％后进行细胞传代。

用PBS(美国Gibco：C10010500BT)清洗两遍细胞瓶以完全去除悬浮细胞及细胞碎片后吸净PBS残液，并滴加1mL 0.25％的EDTA胰酶(美国Gibco：25200-056)消化贴壁生长的细胞，待贴壁细胞大面积脱落时加入2mL完全培养基以终止消化防止细胞因消化过度损伤或死亡；将含消化后细胞的细胞液转移至15mL离心管中1800rpm/3min离心并去除上清液，向沉淀中加入3mL完全培养基重悬细胞，准备3个T25细胞培养瓶每瓶中加入1mL重悬后的细胞液，并加入完全培养基4mL使瓶内液体补齐至5mL，并转移至37℃二氧化碳培养箱中继续培养。

待上述细胞丰度达到80％后再次进行PBS冲洗、胰酶消化过程，消化后向细胞沉淀中加入完全培养基重悬细胞，将细胞液转移至96孔板中，使每孔细胞数约为2×10

2、jetOPTIMUS转染A549细胞效果验证

1)jetOPTIMUS转染效果验证(细胞毒性、转染效率)

将实施例1中步骤2构建的重组载体CRISPR-Cas9-sgRNA(简称CRISPR-Cas9清除系统)转染至步骤1获得的A549细胞，24h后利用荧光显微镜拍照，通过GFP荧光的强度和分布评价转染效果，随后对转染后细胞进行感染实验，验证CRISPR-Cas9-sgRNA对HAdV在细胞感染模型中的清除效果。

根据转染试剂jetOPTIMUS(法国Polyplus：101000006)推荐的方法转染：按照每孔100ng CRISPR-Cas9-sgRNA质粒稀释到12.5μL的jetOPTIMUS缓冲液中后加入0.2μL的jetOPTIMUS，轻微震荡使其混匀并短暂离心，室温孵育10min形成jetOPTIMUS-DNA复合体；等待复合物形成期间将细胞丰度达到80％的96孔板培养板从培养箱中取出去除旧的培养液并用PBS冲洗2遍完全去除悬浮细胞后，每孔各加入87.5μL的含10％血清的培养基；待jetOPTIMUS-DNA复合体形成后按照每孔12.5μL分配给孔。转染24h后在普通倒置显微镜4倍镜下观看转染后细胞形态变化，通过观察细胞形态以及是否有细胞空洞产生作为判断转染试剂细胞毒性的一个直接的依据。

结果如图5所示，图5中A显示的正常的A549细胞生长状态，图5中B是转染后的A549细胞生长状态，可知jetOPTIMUS转染重组载体CRISPR-Cas9-19220后细胞生长状态良好，未出现明显空洞，表明jetOPTIMUS细胞毒性较小(图5中B)。

将jetOPTIMUS-DNA复合体转染到A549细胞24h后，通过绿色荧光激发转染进入A549细胞内的带有GFP的质粒，通过荧光强度和丰度判断转染效果。结果如图6中A和B所示，含有重组载体CRISPR-Cas9-19220的A549细胞GFP荧光强度较高(图6中B)，递呈效果较好。说明jetOPTIMUS阳离子聚合物可有效地进行将CRISPR/Cas9递呈至细胞内。

为进一步更加客观的评价转染试剂的细胞毒性，对转染24h后的细胞进行了细胞活力检测(碧云天，C2013M，Calcein AM细胞活性检测试剂盒CCK-F)，通过Calcein-AM荧光探针标记活细胞从而简单、快速、灵敏、准确地用于细胞活性、细胞毒性或细胞增殖检测。根据荧光强度可间接判断活细胞数量从而判断转染试剂对细胞的毒性大小。

结果如图7所示。将jetOPTIMUS-DNA复合体转染到A549细胞实验组(转染)和对照组(未转染jetOPTIMUS-DNA复合体)的细胞活性检测结果显示细胞活性没有较大差异，不具有统计学意义，说明jetOPTIMUS阳离子聚合物递呈CRISPR/Cas9清除系统的细胞毒性较小。

3、CRISPR-Cas9-sgRNA对HAdV清除效果体外验证

1)HAdV-7侵染A549细胞实验

实验组处理(转染jetOPTIMUS-DNA复合体后染毒)：A549细胞转染按照本实施例步骤2中进行，转染jetOPTIMUS-DNA复合体后24小时，将7.8×10

对照组1(转染jetOPTIMUS后染毒)：A549细胞转染按照本实施例步骤2中进行，转染jetOPTIMUS后24小时，将7.8×10

对照组2(未转染仅染毒)：A549细胞未转染仅更换培养基按照本实施例步骤2中进行，放置24小时后，将7.8×10

2)CRISPR-Cas9-19220对HAdV清除效果体外验证

采用倒置显微镜下观察上述步骤1)HAdV-7侵染后不同组的细胞形态，结果如图8所示，转染后染毒的实验组(转染jetOPTIMUS-DNA复合体+染毒)(图8中A)A549细胞存活率较高，而未转染CRISPR-Cas9-sgRNA的A549细胞直接染毒的对照组1(转染jetOPTIMUS+染毒)、对照组2(仅染毒)(图8中B，C)出现了明显的细胞病变。表明实施例1中构建的重组载体CRISPR-Cas9-19220对HAdV-7的复制具有明显的抑制作用。

3)为了更好的对CRISPR-Cas9-19220系统清除效率进行定量，进一步探究其对HAdV-7细胞内复制的抑制作用。

设置实验组(转染jetOPTIMUS-DNA复合体+染毒)、对照组1(转染jetOPTIMUS+染毒)、对照组2(仅染毒)；对各组染毒24h的细胞上清液进行核酸提取(TIANGEN/天根生化：DP304-02)，引物为：上游引物：5’-AGGAGCCAGATATTGATA-3’,下游引物：5’-GAGTTACCATCAGAAGTT-3’，并将提取的核酸进行qPCR检测，具体qPCR检测引物见表2。通过对比实验组与对照组的CT值，初步判断各靶点清除效果的优劣并利用下述公式计算最终得出各靶点准确的清除率。

清除率＝(2^

表2qPCR检测引物

qPCR检测结果显示：A：实验组(转染jetOPTIMUS-DNA复合体+染毒)的Cq值明显低于B:对照组1(转染jetOPTIMUS+染毒)和C:对照组2(仅染毒)(图9)。通过计算得到不同sgRNA靶点的清除率。用A549细胞分别检测清除效果，清除效果最好的清除系统CRISPR-Cas9-19220的清除率可以达到97％(表3)。

表3不同CRISPR-Cas9-sgRNA清除率

4、通过IF检测CRISPR-Cas9系统对腺病毒蛋白表达的抑制作用

1)将5×10

24小时后，进行HAdV-7感染实验，步骤如本实施例中上述步骤3所述。细胞感染6h后，倒掉细胞培养液，1×PBS轻微振荡洗涤3次，每次5min；随后4％多聚甲醛固定细胞，室温放置20min倒掉多聚甲醛，加入适量PBS；轻微振荡洗涤3次，每次5min；加入适当体积的通透液室温放置10min，再次洗涤2次；加入适当体积的封闭液，室温放置30min；倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗(Anti-Adenovirus antibody(B025/AD51)37℃孵育60min；再次洗涤3次；加入适当体积及稀释比的荧光二抗(Solarbio，K0047R-FITC)，37℃避光孵育1h；再次洗涤3次；加入适当体积及稀释比的核染料(HARVEYBIO，Hoechst 33342)，室温反应10min，再次洗涤3次；随后在荧光显微镜下拍照观察。

染毒6h后，通过免疫荧光检测病毒蛋白(Anti-Adenovirus antibody(B025/AD51，1:1000；Abcam))的表达情况。结果如图10所示，A：实验组(转染jetOPTIMUS-DNA复合体+染毒)递呈CRISPR-Cas9清除系统的细胞染毒6h后，病毒蛋白(Hexon)的表达明显得到抑制(图10中A)，而对照组1(转染jetOPTIMUS+染毒)和对照组2(仅染毒，未递呈CRISPR-Cas9清除系统)可以明显的观察到病毒蛋白的表达(图10中B和C)。说明本发明提供的CRISPR-Cas9系统可以有效的抑制病毒蛋白的表达,且jetOPTIMUS阳离子聚合物可有效地进行细胞内CRISPR/Cas9清除系统的递呈。

综上所述，CRISPR-Cas9清除系统对HAdV-7具有清除作用，可抑制病毒基因组的复制以及病毒蛋白Hexon的表达。并且jetOPTIMUS聚合物纳米材料在体外的递呈效果较好，细胞毒性小。CRISPR-Cas9-sgRNA对腺病毒的清除率最高可达到97％，后续可继续筛选其他型别腺病毒高效sgRNA靶点以及通用型靶点，构建多靶点清除系统，并在体内进行验证。

本发明通过设计多个sgRNA，并且通过选择阳性聚合物纳米材料作为本发明的材料，将CRISPR-Cas9系统递呈至细胞，随后通过多种方法评价清除效率，最终确定了利用CRISPR/Cas9清除腺病毒的技术。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。