一种乳酸菌在制备防治放射性肠炎功能产品方面中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其是一种乳酸菌通过PI3K-AKT-mTOR通路在制备防治放射性肠炎功能产品方面中的应用。

背景技术

乳酸杆菌属的成员长期以来被认为是人类胃肠道中最丰富的微生物之一，是人体肠道中重要的有益菌。L.plantarum CGMCC8198是本课题组前期分离并筛选的，具有自主知识产权的益生菌新菌株。它除了具备耐酸、耐胆盐(专利号：201310491340.4)、耐高温、减肥降脂(专利号：201310518617.8)的作用，还能定植在小鼠结肠，发挥调节肠道的作用。但是，目前没有报道探讨该菌属对肠道类疾病的研究，对其通过何种途径改善治疗放射性肠炎的研究更少。

放射性肠炎是盆腔以及腹部肿瘤患者接受放射治疗后，常见的并发症，病症会导致患者不能足剂量足疗程的治疗，影响患者的生存周期。

临床上，2018年东南亚胃神经运动协会工作组制定的《益生菌的临床应用共识报告》明确提出益生菌能有效减少放射治疗引起的腹泻；《中国放射性直肠炎诊治专家共识(2018版)》。

2022年一篇发表在国际微生物学顶级学术期刊Microbiome(1区,IF:14.652)的文章中，率先提出靶向干预肠道菌群可能是防治肠损伤有效手段的重要论据。此外，2022年8月份Nature Reviews Endocrinology(1区，IF:44.9)发表一篇题目为“The role ofironin host-microbiota crosstalk and its effects on systemic glucose metabolism”的文章，该文中明确阐述了肠道炎症与益生菌之间存在密切关系。

因此对盆腔及腹部肿瘤患者术后并发症——放射性肠炎具有改善治疗作用的益生菌的研究对目前人类身体健康具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种乳酸菌通过PI3K-AKT-mTOR通路在制备防治放射性肠炎功能产品方面中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种乳酸菌通过PI3K-AKT-mTOR通路在制备防治放射性肠炎功能产品治疗放射性肠炎药物方面中的应用，所述乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CGMCCNo.8198。

进一步地，所述植物乳杆菌CGMCC No.8198已于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国北京市朝阳区北辰西路1号院。

进一步地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够抑制辐射肠道中的炎症因子。

进一步地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够改善辐射造成的肠屏障损伤。

进一步地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够改善辐射紊乱的肠道菌群结构。

进一步地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够显著抑制PI3K-AKT-mTOR相关因子。

进一步地，所述功能产品包括功能性食品、药品。

进一步地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6均呈降低水平。

进一步地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行HE、MASSON染色观察肠屏障损伤情况，发现其可以改善辐射造成的肠屏障损伤。

进一步地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行的16S rRNA分析，发现其可以改善由辐射造成的肠道菌群结构紊乱。

进一步地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后通过Westernblot检测PI3K、AKT等因子表达情况，发现可以抑制因辐射显著激活的PI3K-AKT-mTOR通路相关因子。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明发现了一种乳酸菌在改善放射性肠炎的应用，以植物乳植杆菌CGMCCNo.8198活菌液进行实验，实验表明其可抑制辐射造成的肠道内炎症因子的水平升高、改善辐射造成的肠屏障损伤、改善紊乱的肠道菌群结构，抑制因辐射显著激活的PI3K-AKT-mTOR相关因子，以达到改善放射性肠炎的功能。

2、本发明提供了一种乳酸菌通过PI3K-AKT-mTOR通路治疗改善的应用，以植物乳植杆菌CGMCC No.8198活菌液进行实验，实验表明其可直接降低放射性肠炎细胞中IL-6、IL-1β、PI3K、AKT等基因活性，表现出发挥防治放射性肠炎的作用。

3、本发明所用菌株为食品级的益生菌，以此进行相关药物研究具有高度的安全性。

4、本发明为放射性肠炎的治疗提供了新的理论指导。

5、本发明实验表明植物乳植杆菌可以抑制辐射造成的肠道内炎性因子水平升高、改善肠道屏障损伤、改善紊乱的肠道菌群结构、抑制通路相关因子的水平，达到改善盆腔及腹部肿瘤患者术后产生的并发症——放射性肠炎。本发明植物乳植杆菌CGMCC No.8198可用于食品、医药等领域，可用于开发相关功能性食品和药品。

附图说明

图1为本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6水平图；

图2为本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行HE、MASSON染色观察肠屏障损伤情况图；其中，第一行图片为HE染色，第二图片为MASSON染色；

图3为本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行的16S rRNA分析图；

图4为本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后通过Western blot检测PI3K、AKT等因子表达情况图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

一种乳酸菌通过PI3K-AKT-mTOR通路在制备防治放射性肠炎功能产品治疗放射性肠炎药物方面中的应用，所述乳酸菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CGMCCNo.8198。

较优地，所述植物乳杆菌CGMCC No.8198已于2013年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，中国北京市朝阳区北辰西路1号院。

较优地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够抑制辐射肠道中的炎症因子。

较优地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够改善辐射造成的肠屏障损伤。

较优地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够改善辐射紊乱的肠道菌群结构。

较优地，所述植物乳植杆菌CGMCC No.8198的活菌液能够显著抑制PI3K-AKT-mTOR相关因子。

较优地，所述功能产品包括功能性食品、药品。

较优地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6均呈降低水平。

较优地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行HE、MASSON染色观察肠屏障损伤情况，发现其可以改善辐射造成的肠屏障损伤。

较优地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后进行的16S rRNA分析，发现其可以改善由辐射造成的肠道菌群结构紊乱。

较优地，本发明中利用植物乳植杆菌CGMCC No.8198处理后通过Westernblot检测PI3K、AKT等因子表达情况，发现可以抑制因辐射显著激活的PI3K-AKT-mTOR通路相关因子。

具体地，以下实施例分别从ELISA、HE、MASSON、16S rRNA分析及Westernblot实验来说明本发明的技术方案，具体内容如下。

实施例1动物分组及处理

40只4-6周龄雄性C57BL/6小鼠，购自北京斯贝福生物科技有限公司(许可证：SCXK(湘)2017-0006)。动物随机分为空白组、放射性肠炎组、阳性药组(美沙拉嗪灌肠液)、低剂量植物乳植杆菌8198组(5×10

实施例2ELISA检测IL-1β、IL-6炎性因子水平

1.C57BL/6小鼠眼球取血，血清样本常温静置30min，按照Mouse IL-1β、IL-6ELISAKit试剂盒说明书测定血清中IL-1β及IL-6的含量。

2.利用紫外分光光度计测定OD

检测结果如图1所示，从图1中可以看出，小鼠肠道组织病理学检测ELISA结果显示，与正常组相比模型组炎症因子IL-1β含量显著增高约35pg/ml，IL-6含量显著增高约200pg/ml；治疗后，与模型组相比低剂量组IL-1β含量下降约10pg/ml，IL-6含量下降约100pg/ml；与模型组相比高剂量组IL-1β含量下降约20pg/ml，IL-6含量下降约80pg/ml；下降趋势呈剂量依赖型，且经治疗后各指标含量变化显著(p＜0.0001)。

实施例3HE、MASSON染色检测肠屏障损伤情况

1.颈椎脱臼处死小鼠后，开腹，取出直结肠，分离肠粘膜组织以全封闭组织脱水机脱水后置于二甲苯中，经过生物组织包埋机包埋后置于轮转切片机中，进行常规病理切片，脱蜡后进行水化，采用苏木素伊红(HE)染色试剂盒做HE染色(具体步骤参照说明书)，然后在显微镜下观察小鼠肠粘膜病理形态，并任意采集5个视野图像。

检测结果如图2所示，从图2中可以看出，HE染色结果显示，正常组绒毛密集，无脱落情况，隐窝结构正常，组织无出血及溃疡，形态规则，无炎性细胞浸润；模型组小鼠肠组织可见肠上皮结构不完整，细胞变性脱落，隐窝形成微脓肿，肠黏膜变薄、绒毛缩短，毛细血管扩张，肠壁黏膜充血水肿、局部或弥漫性溃疡；与模型组比较，经治疗后，肠道部分上皮细胞再生，绒毛和黏膜的凝固性坏死减少，黏膜结构较为完整，炎性细胞浸润减少，病变程度显著减轻，且缓解程度成剂量依赖性，说明L.plantarum CGMCC8198可改善急性放射性肠炎小鼠肠道黏膜组织病理损伤。

2.颈椎脱臼处死小鼠后，开腹，取出直结肠，分离肠粘膜组织以全封闭组织脱水机脱水后置于二甲苯中，经过生物组织包埋机包埋后置于轮转切片机中，进行常规病理切片，脱蜡后进行水化，采用Masson三色染色试剂盒做Masson染色(具体步骤参照说明书)，然后在显微镜下观察小鼠肠粘膜病理形态，并任意采集5个视野图像。

检测结果如图2所示，从图2中可以看出，Masson结果显示，经过辐射后，肠屏障严重损坏，但经过灌胃治疗后，肠道黏膜组织较为完整，且程度成剂量依赖性，说明L.plantarum CGMCC8198可改善急性放射性肠炎小鼠肠道黏膜组织病理损伤。

实施例416S rRNA分析

解剖小鼠取粪便，进行16S rRNA分析。

检测结果如图3所示，从图3中可以看出，通过16S rRNA测序鉴定，利用Alpha-物种多样性分析及Observed species指数分析发现，经过L.plantarum CGMCC8198治疗后改善了由辐射造成的肠道菌群丰度减少(value差异≈70)，维持了肠道微生物丛的稳定。通过热图分析发现各组之间的差异微生物菌群，并且经过灌胃L.plantarum CGMCC8198后乳酸菌属丰度较模型组升高。对差异微生物菌群TOP10进行富集分析发现，L.plantarumCGMCC8198可以保护肠道内的有益菌种，如经黏液真杆菌，抑制有害菌种，如：幽门螺杆菌。

实施例5Western blot检测PI3K、AKT因子表达

分别使用全细胞裂解测定(KeyGen Bio Tech，南京，中国，KGP2100)和二辛可宁酸(BCA)试剂盒(KeyGen Bio Tech，KGP902)制备RTAEC以提取蛋白质并测定蛋白质浓度调平后，加入buffer收集到离心管中备用。等量的蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳[10％(w/v)溶解凝胶]分离，并电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，PVDF膜置于5％牛奶中封闭，PBS清洗。然后用抗-PI3K、抗-AKT于4℃过夜孵育。回收一抗用PBS清洗后，用抗兔山根过氧化物酶二抗在25℃孵育2小时。使用Chemidoc成像系统(Bio-Rad,USA)通过电化学发光检测最终蛋白表达，并使用ImageJ软件量化每个条带的光密度。

检测结果如图4所示，从图4中可以看出，通过Western blot对PI3K-AKT-mTOR通路重要因子进行检测，结果发现与正常组相比模型组PI3K、AKT含量显著增高；治疗后，与模型组相比PI3K、AKT含量明显下降，经治疗后各指标含量变化显著，且下降趋势呈剂量依赖型。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。