倍半萜内酯Tomentosin在治疗由淋巴细胞系引起的肿瘤中的用途

技术领域

本发明涉及从黏性旋复花(Inula viscosa)的提取物中分离的倍半萜内酯在治疗肿瘤中的用途；特别是，倍半萜内酯Tomentosin在治疗淋巴组织增生性肿瘤疾病(例如由淋巴细胞系引起的血液肿瘤，例如骨髓瘤和/或淋巴瘤)中的用途。

背景技术

虽然多年以来已改善了血液肿瘤疾病的生存，但血液肿瘤疾病的治疗方法仍在不断的开发中，以响应许多仍需满足的需求。事实上，尽管在新药物的研究和开发方面取得了进展，但一些疾病(急性和慢性白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)仍显示出较高的死亡率。

因此，需要可以使恢复的同时显示较低身体毒性的新治疗方法。换句话说，仍然有必要开发除了传统的(和毒性非常大的)化疗药物之外的药品，其在疾病的分子机制下可以选择性地起作用同时保全其他器官。

特别的，急性和慢性淋巴细胞增生性疾病是影响所有年龄群体的疾病，即使它们的某些形式主要影响特定年龄群体(例如，侵袭性淋巴瘤更常见于青少年和年轻人中，而多发性骨髓瘤更常见于更老年龄的群体)。

这些疾病中的某些是可以治愈的，而另一些则被认为是无法治愈的，尽管它们可以在一定程度上被治疗；这意味着可用的治疗方法使疾病缓解和/或慢性化，但仍然显示出较高的复发率和死亡率。

自21世纪初以来，生物学知识取得了许多进展，这产生了越来越多的作用于患病细胞同时“避开”健康细胞的“靶向”疗法。在大约20年的时间里，这些疾病的生存大大改善，但其中一些仍然是无法治愈的，并且目前正在进行大量研究以试图找到可以(无论是单独还是组合)进一步提高反应和存活率的新的分子。

就目前使用的药物而言，我们已经从使用经典的化疗药物转向使用作用于免疫系统以及髓质微环境(即以提高身体对肿瘤的免疫反应的方式起作用)的越来越靶向的药物。

除了提高治疗质量外，这些成果还增加了可以利用它们的患者的数量，因为它们实际上扩大了这些药物可被使用的年龄范围。

虽然细胞代谢途径是众所周知的，但仍缺乏对肿瘤淋巴细胞的代谢途径的知识，因此，不幸的是，目前使用的几乎所有药物还影响正常淋巴细胞，这些淋巴细胞在对感染的反应中起着极为重要的作用。

出于这个原因，目标是找到对正常细胞显示低毒性的同时对肿瘤细胞具有更特异的活性的分子。

这就是为何研究集中在代谢途径和淋巴细胞与微环境之间的相互作用上的原因，这些相互作用通常地以及在肿瘤性疾病中通过交换促进疾病发展、进展、耐药性和复发的“信息”来合作。

存在许多主要作用于患病细胞或微环境的分子，但它们通常在正向的初始反应之后达到治疗的“不应性”阶段，这通常与突变和/或新肿瘤克隆的发展有关，其对在此之前使用的药物产生抗药性。这一事实导致对新的分子或具有对亲和力、构象等进行后续修改以试图重新建立和/或增加和/或提高减少的或失去的反应的“创建者”分子的变体(称为第1、2、3、......代分子)的持续寻找和/或开发。

现有技术的不足及技术问题

如上所述，仍然需要寻找(新的或经修饰的)分子，其使得有可能(无论是由于不同的作用机制还是不同的代谢参与构象)克服治疗不应性的问题；特别是针对由淋巴系细胞引起的肿瘤，其对目前的治疗具有显著的耐药性。

本发明的目的是为上述突出的技术问题提供充分的解决方案。

化合物Tomentosin和Inuvisculide是从I.viscosa(L.)Aiton分离的倍半萜内酯，由于其抗炎、驱虫、解热、抗菌和消炎特性而长期用于大众医学以及糖尿病和肺部疾病的治疗中。最近，几项研究表明倍半萜内酯具有潜在的抗癌作用，证明了Tomentosin和Inuvisculide如何对某些类型的人癌症细胞系发挥抗癌作用。例如，Rozenblat等人已经表明两种倍半萜对侵袭性人黑色素瘤细胞系的强烈促细胞凋亡作用。此外，Tomentosin主要通过细胞凋亡诱导死亡在胃癌、宫颈癌和骨肉瘤中发挥抗癌作用。

此外，Yang等人已经表明，Tomentosin通过抑制mTOR/PI3K/Akt信号传导途径而在人白血病MOLT-4细胞系中抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。

然而，就本发明人所知，尚不存在信息或描述表明Tomentosin能够有利地作用于引起淋巴血液肿瘤发生或发展的淋巴细胞系。

发明内容

鉴于上述情况，并且由于淋巴细胞增生性疾病对目前使用的药物具有较高耐药性，本发明人研究和评估了Tomentosin在该治疗领域的体外功效和毒性。

此类分子以前从未用于这种应用，并且所进行的测试可以评估其功效和作用机制以及其毒性。

令人惊讶的是，Tomentosin对健康淋巴细胞显示出很小的毒性，并且其有利地被证明在抑制肿瘤淋巴细胞增殖方面是有效的，如下文将进一步描述的那样。

因此，鉴于其在治疗由淋巴肿瘤细胞系引起的人淋巴细胞增生性疾病(血液肿瘤)中的有利的利用，这些特性使Tomentosin成为一种特别有前景的分子。

因此，本发明涉及Tomentosin和/或合适的药物组合物用于治疗由淋巴肿瘤细胞系引起的淋巴细胞增生性疾病、血液肿瘤，如所附权利要求1和2所述。

本发明的一些优选实施方案在所附的从属权利要求中列出。

如以下说明书中所列的本发明的优选实施方案仅作为示例提供，不得以任何方式限制本发明的应用范围，其对于有资质的医生将立即变得清楚。

附图简述

图1描述了接受处理的每个细胞系的细胞死亡诱导(红线)与相同细胞系的细胞增殖减少(蓝线)的比较。

图2(蓝线)仅显示了接受处理的每个细胞系的细胞增殖减少。

发明详述

因此，本发明至少涉及以下项目：

[1]倍半萜内酯Tomentosin用于治疗由淋巴肿瘤细胞系引起的淋巴细胞增生性疾病、血液肿瘤、骨髓瘤、淋巴瘤。

同样，本发明涉及：

[2]包含Tomentosin作为活性成分的药物组合物，其用于治疗如[1]所述的由淋巴肿瘤细胞系引起的淋巴细胞增生性疾病、血液肿瘤、骨髓瘤、淋巴瘤。

[3]根据[2]所述的组合物，其用于如[2]所述的治疗，其中以允许实现适合于活性成分的总共每日施用2-60mg/kg体重的药物形式的量包含Tomentosin；优选地，3-50mg/kg每日；更优选地，4-40mg/kg每日；甚至更优选地，5-30mg/kg每日。

[4]根据[3]所述的组合物，其用于如[2]所述的治疗，其中所述每日施用以单次施用发生，或者根据患者的需要分为多次施用。

[5]根据项目[2]-[4]中任一项所述的组合物，其用于如[2]所述的治疗，根据患者的需要，其以使得能够口服和/或注射施用的方式配制。

[6]根据项目[2]-[5]中任一项所述的组合物，其用于如[2]所述的治疗，根据已知技术的药物制剂技术的常规做法，进一步包含助剂、赋形剂、添加剂、佐剂、防腐剂、崩解剂、甜味剂、调味剂等。

[7]根据项目[2]-[6]中任一项所述的组合物，其用于如[2]所述的治疗，进一步包含至少另一种可用于根据[2]所述的治疗的已知活性成分。

本发明还涉及相同领域内的其它类似治疗应用，如熟练的医生将能够基于他/她自己的专业经验来鉴别。

实验部分

作为实施例并且不以任何方式限制本发明的广泛应用潜力，以下实验部分将综合说明在体外进行的一些重要测试，这些测试证明Tomentosin用于治疗如本文先前所述的淋巴细胞增生性疾病的用途和功效。当然，熟练的医生将能够基于这些信息和他/她自己的经验，将本发明的教导也用于其他可能的应用而不偏离其范围。

下面描述的测试通过使用化疗分子顺铂(其细胞毒性和化疗作用是众所周知的)作为阳性对照可以评估倍半萜分子Tomentosin和Inuvisculide的细胞毒性。

在淋巴肿瘤(骨髓瘤、淋巴瘤)细胞系培养物中，以7种不同的浓度测试分子：50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.56μM、0.75μM。

测试的细胞系：

·MM.1S(来自多发性骨髓瘤)，在RPMI-1640培养基、10％FBS、L-谷氨酰胺、AA中培养

·RPMI-8226(来自多发性骨髓瘤)，在RPMI-1640培养基、10％FBS、L-谷氨酰胺、AA中培养；

·Raji(来自Burkitt淋巴瘤)，在RPMI-1640培养基、10％FBS、L-谷氨酰胺、AA中培养；

·MRC5(来自肺成纤维细胞)，在DMEM培养基、10％FBS、L-谷氨酰胺、AA、丙酮酸钠、NEAA中培养。

MRC5细胞系用作对照以评估这些分子是否对非肿瘤细胞也有毒性。

实验设计

将细胞接种在384孔板中，并用7种不同浓度(如上所述)的Tomentosin、Inuviscolide和顺铂(阳性对照)处理。

处理48小时后，通过对使用已知方法(CellTox Green dye-Promega)染色死细胞后的荧光信号强度进行测量来估计药物诱导的细胞死亡。

随后，通过添加CellTiter Glo P(Promega)试剂来评估活细胞的数量，通过该试剂，细胞裂解和发光信号与每个样品中的ATP水平成正比。

还进行了初步测定以选择接种在平板中用于增殖测试的最合适的细胞数。

细胞培养

如上所述，使用了市售的MM.1S、RPMI-8226m、Raji和MRC5细胞。

MM.1S、RPMI-8226和Raji细胞在补充有10％FBS(Euroclone ECS0180L)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma G7513)和抗生素抗真菌溶液(AA,Sigma A5955)的RPMI1640(EurocloneECB9006L)培养基中培养。

MRC5细胞在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺(Sigma G7513)、非必需氨基酸(NEAA,Sigma M7145)、1mM丙酮酸钠(Sigma S8636)、抗生素抗真菌溶液(AA,Sigma A5955)的高葡萄糖含量的DMEM培养基(Euroclone ECM0101L)中培养。

细胞在37℃下在湿化的5％CO2的空气的存在下培养。

细胞增殖验证测试

进行初步测定以确定要接种的细胞数量，以便获得用CellTiter-Glo测定法测量的发光与培养的细胞数量之间的直接相关性。

将每个细胞系的9个连续1.35x稀释液接种在384孔板中；所述稀释范围为每孔10,000至0.0001000个细胞。对于每个条件接种四个技术重复。72小时后，向每个孔中加入CellTiter-Glo(Promega G7571)，每个样品混合5次，10分钟后读取发光。

细胞增殖和细胞毒性测试

在加入所检验的化合物之前24小时，将以足够浓度重悬的细胞接种在384孔透明平底黑色聚苯乙烯TC处理的微孔板中(Corning3764)。

每个孔含有20μL细胞悬液。第二天，将10μL的所检验分子的连续稀释液与整合的CellTox(Promega G8731)绿色染料添加到每个样品中，以获得所需的处理浓度。

使用全自动移液平台(Gilson Pipetmax)进行细胞接种、制备连续稀释液以及将分子添加至细胞。

处理后48小时，使用Biotek Cytation 5定量每个孔中的全局绿色荧光的强度。对于每个样品，拍摄四张图像以覆盖孔的整个区域。使用Gen5软件进行图像合并、处理和背景去除。荧光读数后，立即向每个孔中加入30μL刚制备的CellTiter Glo试剂(PromegaG7571)，并将每个样品混合5次。十分钟后，进行发光读数。对所检验的每个条件进行三次技术重复铺板。

关于试剂的技术说明

CellTiter-Glo是一种用于根据ATP的定量确定培养物中活细胞的数量的试剂，ATP示意代谢活性细胞的存在。

将试剂直接添加到样品中，导致细胞裂解并产生与ATP的量成比例的发光信号。使用Promega Glo-Max Discover定量发光信号。

CellTox绿色染料测量细胞死亡之后膜完整性发生的变化。该测试使用被活细胞排斥的染料，同时对死细胞的DNA进行着色。当染料与受损细胞的DNA结合时，染料的荧光特性增强，而活细胞不会产生明显的荧光增加。因此，染料产生的荧光信号与细胞毒性成比例。荧光强度(GFI)通过Biotek Cytation5宽场全自动数码显微镜、LED立方体465nm、滤光片立方激发光469±25nm、发射光525±25nm进行量化。

细胞活力计算为相对细胞计数(R)：

R＝T/U x100

其中T是处理样品中的细胞数，U是未处理样品中的细胞数。

例如，R＝70的值表示该处理浓度下的细胞数为未处理对照的70％，因此细胞数减少了30％。一般来说，R的值在80至50的范围内表示细胞数的轻微减少，在50至10的范围内的值表示细胞数的生物学显著减少，<10的值表示由处理导致的细胞数显著减少。R用于计算IC50(半最大抑制浓度)。

半最大抑制浓度(IC50)是使细胞数减少50％所必需的浓度。它是通过将线性回归模型输入到散点图中来计算的，其中x＝log2药物浓度以及y＝相对细胞数。

细胞死亡以绿色荧光强度(GFI)来测量。

R

R

当R

诱导细胞死亡

使用本领域已知的为此目的的方法计算细胞死亡(其与绿色荧光强度(GFI)成正比)。

每个细胞系显示一个基础值和一个不同的GFI值(MM.1S1.5

在所附图1中，在接受处理的每个细胞系中诱导的细胞死亡如红线所示。蓝线表示细胞增殖减少，如下一个的图2所示。

结论

所获得的结果证实顺铂(阳性对照)干扰DNA复制，并且众所周知的是，其无差别地杀死所有增殖细胞(肿瘤和非肿瘤细胞)。因此，在所有的所检验的细胞系中观察到细胞增殖减少和细胞死亡增加。作为参考，培养72小时后测定的顺铂的IC50值在MM.1S细胞中为12.3μM，在RPMI-8226细胞中为14.9μM，在Raji细胞中为25.7μM。

与其相反，Tomentosin对MM.1S和Raji细胞显示出细胞毒性作用，对RPMI-8226细胞显示出细胞抑制作用，而其对MRC5非肿瘤细胞具有较低的抗增殖活性(IC50>最大浓度)。

相反的，Inuvisculide仅对RPMI-8226细胞显示出细胞抑制作用，并且对其他细胞系显示出较低的抗增殖活性(IC50>最大浓度)。

这证明Tomentosin对淋巴肿瘤细胞系具有活性，对非肿瘤细胞无毒性，因此，它是一种非常有前景的可用于治疗淋巴细胞增生性疾病的活性成分。

本发明的工业适用性

Tomentosin已被证明在抑制淋巴肿瘤细胞系的复制方面具有显著活性。因此，其药物组合物可用于有利治疗淋巴细胞增生性疾病，例如由淋巴细胞系引起的血液肿瘤(例如骨髓瘤和/或淋巴瘤)。