一种基于可溶性微针的蛋白递送系统

技术领域

本发明属于微针给药系统领域，更具体地，本发明涉及一种基于可溶性微针的蛋白递送系统。

背景技术

微针矩阵由一系列微米级的针尖组成，可以穿透皮肤角质层，根据微针的高度不同可以到达皮肤表皮层，甚至真皮层，通常微针的高度为50-2000μm。使用微针矩阵作为给药系统，具有无痛、低成本、方便自主给药等优点。常见的微针类型主要包括：固体金属微针、涂层型微针、空心微针，以及可溶性微针。其中，可溶性微针可在皮肤组织液内迅速溶解，从而释放包载于其中的药物，无需额外剥离工作，且可溶性微针使用后可以直接丢弃，从而减少因微针多次使用带来的交叉感染风险，此外，可溶性微针还具有相比于涂层型微针更大的载药剂量，相比于固体金属微针安全性更高等优点，因此，近年来基于可溶性微针设计经皮给药系统已经成为新的研究热点。

由于消化系统呈酸性以及蛋白酶的存在，蛋白质类药物经口服给药易降解、生物利用度低。目前，蛋白质类药物的主要给药途径是注射给药，但长期频繁的皮下注射具有较低的患者依从性，还会导致皮下组织损伤，形成瘀伤，产生感染的风险。而使用微针替代蛋白注射给药可以降低疼痛和不适感，改善患者依从性。

CN111450403A公开了一种用于蛋白质类药物快速透皮递送的微针阵列及其制备方法，所述的微针阵列是通过浸泡吸附的方式，将含有蛋白质溶液(例如胰岛素)吸附于微针表面，重复循环，干燥后得到表面负载蛋白的微针矩阵。然而，在该方法中，蛋白分子通过吸附作用包裹于微针表面，这对于蛋白载药量存在一定程度的限制。另外，由于蛋白质类药物多为液体制剂，液体状态下蛋白质类药物容易失活和变性，因此提高蛋白质类药物生物制品稳定性最常用的方法就是将其转化为固态，从而降低分子的流动性，以保证蛋白制品的活性。在蛋白制品干燥和制备的过程，温度、剪切应力等可能会对蛋白制品的活性产生影响，而包裹于微针表面的蛋白在干燥和制备过程中容易发生降解，从而影响其稳定性。

因此，本领域亟需解决上述技术问题，探究一种基于可溶性微针的蛋白递送系统，以提高蛋白药物稳定性，从而有利于蛋白药物的递送和治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组合物，包含：(a)两亲性聚合物材料，其中所述两亲性聚合物材料包含小分子糖和胆固醇；(b)蛋白药物，和(c)微针基质材料，其中所述微针基质材料包含普鲁兰糖和透明质酸。

在本发明的第一方面，提供一种组合物，包含：(a)两亲性聚合物材料，其中所述两亲性聚合物材料包含小分子糖和胆固醇；(b)蛋白药物，和(c)微针基质材料，其中所述微针基质材料包含普鲁兰糖和透明质酸。

在一种或多种实施方式中，所述微针基质材料由普鲁兰糖和透明质酸组成。

在一种或多种实施方式中，透明质酸和普鲁兰糖的体积比为1:2～2:1。

在一种或多种实施方式中，以组合物的总体积计，所述透明质酸的质量分数为3～10wt％(例如为5wt％)，所述普鲁兰糖的质量分数为10～20wt％(例如为15wt％)。

在一种或多种实施方式中，所述小分子糖包括或为：海藻糖、葡聚糖、菊糖、甘露醇、乳糖。

在一种或多种实施方式中，所述两亲性聚合物材料由小分子糖和胆固醇组成。

在一种或多种实施方式中，所述小分子糖和胆固醇的摩尔比为1:2～2:1。

在一种或多种实施方式中，所述蛋白药物包括：胰岛素、半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、血清白蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、白细胞介素-2、重组人干扰素、单克隆抗体。

在一种或多种具体的实施方式中，所述蛋白药物为胰岛素或其生物活性衍生物，例如，所述胰岛素或其生物活性衍生物可以包括或选自：人胰岛素、重组人胰岛素、来自非人动物的胰岛素、速效胰岛素、速效胰岛素类似物、中效胰岛素和/或长效胰岛素。

在一种或多种具体的实施方式中，所述蛋白药物为半乳糖苷酶或其生物活性衍生物，例如，所述半乳糖苷酶或其生物活性衍生物可以包括或选自：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶。

在本发明的第二方面，提供一种制备负载蛋白药物的纳米粒的方法，包括：

(1a)提供两亲性聚合物材料的溶液，其中所述两亲性聚合物材料包括小分子糖和胆固醇；

(1b)提供蛋白药物的溶液；

(1c)将(1a)所述溶液与(1b)所述溶液混合；和

(1d)使用旋转蒸发法除去混合溶液中的溶剂，形成负载蛋白药物的纳米粒。

在一种或多种实施方式中，步骤(1a)中的小分子糖包括或为：海藻糖、葡聚糖、菊糖、甘露醇、乳糖。

在一种或多种实施方式中，步骤(1a)中的两亲性聚合物材料溶解于有机溶剂中，形成两亲性聚合物材料的溶液，所述有机溶剂包括：二氯甲烷、四氢呋喃、三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯。

在一种或多种实施方式中，步骤(1c)中，采用超声的方式进行混合(例如在功率30％～60％条件下超声1～5分钟)。

在一种或多种实施方式中，步骤(1c)中，(1a)所述溶液与(1b)所述溶液的体积比为6:1～3:1，例如为4:1。

在一种或多种实施方式中，所述蛋白药物包括：胰岛素、半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、血清白蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、白细胞介素-2、重组人干扰素、单克隆抗体。

在一种或多种实施方式中，所述蛋白药物为胰岛素、半乳糖苷酶或其生物活性衍生物。

在一种或多种实施方式中，所述胰岛素或其生物活性衍生物包括：人胰岛素、重组人胰岛素、来自非人动物的胰岛素、速效胰岛素、速效胰岛素类似物、中效胰岛素和/或长效胰岛素。

在一种或多种实施方式中，所述半乳糖苷酶或其生物活性衍生物包括：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶。

在本发明的第三方面，提供一种制备用于蛋白药物递送的微针阵列的方法，包括：

(2a)将负载蛋白药物的纳米粒的溶液与微针基质溶液混合，获得混合溶液；

(2b)将(2a)所述溶液分散于包含多个微针空腔的模具中，从而提供填充的模具；

(2c)干燥填充的模具而除去溶剂；和

(2d)去除模具以提供微针阵列。

在一种或多种实施方式中，步骤(2a)中，负载蛋白药物的纳米粒的溶液与微针基质溶液(例如由透明质酸和普鲁兰糖组成)的体积比为1:2～2:1。

在一种或多种实施方式中，步骤(2b)中，模具的填充在真空下进行和/或包括离心模具。

在一种或多种实施方式中，步骤(2c)中，模具在干燥器或真空干燥器中进行干燥。

在一种或多种实施方式中，步骤(2b)和(2c)中，模具包含硅酮；更佳地，所述硅酮为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

在本发明的第四方面，提供一种纳米粒，其包含两亲性聚合物材料，其中所述两亲性聚合物材料包括小分子糖和胆固醇。

在一种或多种实施方式中，所述小分子糖和胆固醇的摩尔比为1:2～2:1。

在一种或多种实施方式中，所述小分子糖包括或为：海藻糖、葡聚糖、菊糖、甘露醇、乳糖。

在一种或多种实施方式中，所述纳米粒还包含蛋白药物。

在一种或多种实施方式中，所述蛋白药物包括：胰岛素、半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、血清白蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、白细胞介素-2、重组人干扰素、单克隆抗体。

在一种或多种实施方式中，所述蛋白药物为胰岛素、半乳糖苷酶或其生物活性衍生物。

在一种或多种实施方式中，所述胰岛素或其生物活性衍生物包括：人胰岛素、重组人胰岛素、来自非人动物的胰岛素、速效胰岛素、速效胰岛素类似物、中效胰岛素和/或长效胰岛素。

在一种或多种实施方式中，所述半乳糖苷酶或其生物活性衍生物包括：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶。

在一种或多种实施方式中，所述纳米粒包含本发明任一实施方式所述的组合物。

在一种或多种实施方式中，所述纳米粒为通过如本发明所述的方法制备获得。

在本发明的第五方面，提供一种微针或微针阵列，其包含本发明任一实施方式所述的组合物，或包含本发明任一实施方式所述的纳米粒。

在一种或多种实施方式中，所述微针或微针阵列为通过如本发明所述的方法制备获得。

在本发明的第六方面，提供本发明所述的组合物，或包含本发明所述的纳米粒的用途，用于制备递送蛋白药物的微针或微针阵列。

在一种或多种实施方式中，所述微针或微针阵列中蛋白药物的稳定性提高。

在本发明的第七方面，提供本发明所述的微针或微针阵列的用途，用于制备治疗或预防疾病的药物。

在一种或多种实施方式中，所述微针或微针阵列中蛋白药物的稳定性提高。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、胆固醇、葡聚糖、胆固醇/葡聚糖聚合物核磁共振氢谱图。

图2、葡聚糖/胆固醇空白纳米粒(A)、负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒(B)的粒径分布图。

图3、负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的透明质酸/普鲁兰糖微针，在扫描电镜观察下的表面形态(A)，以及微针的针尖高度(B)。标尺＝100μm。

图4、质构仪分析负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的透明质酸微针、普鲁兰糖微针、透明质酸/普鲁兰糖微针的断裂力随位移增加的变化图。

图5、使用负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的透明质酸/普鲁兰糖微针按压于小鼠皮肤，再用0.4％台盼蓝染色10min后，微针刺皮效果图。

图6、负载胰岛素的透明质酸微针、普鲁兰糖微针、透明质酸/普鲁兰糖微针中胰岛素的含量。

图7、负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的粒径变化。

图8、可溶性微针中负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的粒径变化。

图9、β-半乳糖苷酶(空白对照组)、负载β-半乳糖苷酶的葡聚糖/胆固醇纳米粒、负载β-半乳糖苷酶的聚乙二醇-聚丙交酯-乙交酯纳米粒和负载β-半乳糖苷酶的葡聚糖/胆固醇纳米粒的可溶性微针中的β-半乳糖苷酶的稳定性对比。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，提供了一种组合物，包含：(a)两亲性聚合物材料，其中所述两亲性聚合物材料包含小分子糖和胆固醇；(b)蛋白药物，和(c)微针基质材料，其中所述微针基质材料包含普鲁兰糖和透明质酸。

通过将蛋白药物包载入由胆固醇与葡聚糖形成的聚合物纳米粒，能够显著提高组合物中蛋白药物的稳定性，防止蛋白药物在干燥和制备过程中被降解破坏。将包载蛋白药物的纳米粒负载入可溶性微针，相比于利用吸附作用使蛋白药物包裹于微针表面的包裹型微针，载药量更大，有利于蛋白药物的递送和治疗。

术语

术语“聚合物”是指具有重复单元(即，给定化学亚结构的多个拷贝)的化学结构。如本文所用，聚合物可以是指具有多于5个、8个、10个或更多的重复单元的基团。聚合物可以由可聚合单体形成。可聚合单体是包含一个或多个可以与其他分子反应形成键的反应性部分(例如卤素)的分子。通常，每个可聚合单体分子可以键合到两个或多个其它分子。在一些情况下，可聚合单体仅与另一个分子键合，形成聚合物材料的末端。

术语“两亲性”是指含有亲水基团和疏水基团两者的分子或聚合物。

术语“蛋白药物”是指以蛋白形式存在的药物(治疗性或预防性药物)。在一些实施方式中，蛋白药物是本领域已知的稳定性较差，例如容易发生降解的蛋白药物，包括但不限于：胰岛素、半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、血清白蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、白细胞介素-2、重组人干扰素、单克隆抗体。在一些实施方式中，蛋白药物是一种或多种蛋白或蛋白衍生物的组合。

术语“胰岛素”是指来自人或其他哺乳动物的胰岛素。在一些实施方式中，术语“胰岛素”是指人胰岛素。在一些实施方式中，术语“胰岛素”是指重组人胰岛素。

术语“半乳糖苷酶”包括α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶或其混合物。

术语“小分子糖”是指具有较小的分子量，可以在蛋白表面形成致密的分子间包裹，从而抑制蛋白分子扩散和降低其流动性，提高蛋白稳定性的糖类。所述小分子糖包括(但不限于)：海藻糖、菊糖、甘露醇、乳糖、葡聚糖。在一些具体的实施方式中，“小分子糖”是葡聚糖或海藻糖。

术语“微”(例如，在“微针”中)是指具有至少一个具有小于约1,000微米(μm)的尺寸的区域的结构。在一些实施方式中，术语“微”是指具有约1微米至约1,000微米的尺寸的结构。

术语“纳米粒”是指具有至少一个具有小于约1000nm的尺寸(例如，长度，宽度，直径等)的区域的结构。在一些实施方式中，尺寸更小(例如，小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm或甚至小于约250nm)。

组合物

本发明提供了一种组合物，包含：(a)两亲性聚合物材料，其中所述两亲性聚合物材料包含小分子糖和胆固醇；(b)蛋白药物，和(c)微针基质材料，其中所述微针基质材料包含普鲁兰糖和透明质酸。

在一些实施方式中，所述两亲性聚合物材料由小分子糖和胆固醇组成。在一些实施方式中，所述小分子糖和胆固醇的摩尔比为1:2～2:1，例如为1:1。在一些实施方式中，小分子糖和胆固醇氯甲酸酯通过酰化反应(优选采用催化剂，例如采用4-二甲氨基吡啶催化)形成所述两亲性聚合物材料。

应理解，虽然本发明实施例中仅以葡聚糖和海藻糖为例，但本领域技术人员知晓，小分子糖都可以通过本领域的常规方法(例如酰化反应)合成小分子糖/胆固醇的两亲性聚合物材料。

在一些实施方式中，所述两亲性聚合物材料以冻干的形式储存。在另一些实施方式中，采用溶剂(例如但不限于二氯甲烷、四氢呋喃)溶解所述两亲性聚合物材料，形成的聚合物溶液可以用于负载所述蛋白药物。

在一些实施方式中，所述蛋白药物包括但不限于：胰岛素、半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、血清白蛋白、表皮生长因子、神经生长因子、白细胞介素-2、重组人干扰素、单克隆抗体。

在一些具体的实施方式中，所述蛋白药物为胰岛素或其生物活性衍生物，如人胰岛素、重组人胰岛素、来自非人动物源(例如，牛、猪)的胰岛素或任何其它胰岛素，包括胰岛素衍生物。在一些实施方式中，胰岛素是与预期的接受者相同的物种的胰岛素，例如用于治疗人的人胰岛素。胰岛素或其生物活性衍生物可以包含不同胰岛素和/或衍生物的混合物。胰岛素或其生物活性衍生物可以包括速效胰岛素，速效胰岛素类似物、中效胰岛素和/或长效胰岛素。在一些实施方式中，胰岛素或其生物活性衍生物是速效胰岛素。

在一些具体的实施方式中，所述蛋白药物为半乳糖苷酶或其生物活性衍生物，例如α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶。在一些实施方式中，半乳糖苷酶或其生物活性衍生物可以包含不同半乳糖苷酶和/或衍生物的混合物。

对于蛋白药物的稳定性评价，本领域技术人员已知，根据蛋白药物的不同，稳定性评价指标也不同。例如，在本发明的实施例中，当蛋白药物为胰岛素时，可以通过负载蛋白药物的纳米粒的粒径大小、是否泄漏等指标评价胰岛素在纳米粒以及可溶性微针中的稳定性；而当蛋白药物为β-半乳糖苷酶时，可以通过测定其酶活性评价其在纳米粒以及可溶性微针中的稳定性。

在一些实施方式中，所述微针基质材料包含普鲁兰糖和透明质酸。在一些实施方式中，所述微针基质材料由普鲁兰糖和透明质酸组成。在一些具体的实施方式中，所述普鲁兰糖和透明质酸的体积比为1:2～2:1，例如为1:1。在一些具体的实施方式中，以组合物的总体积计，所述透明质酸的质量分数为3-10wt％，例如5wt％。在一些具体的实施方式中，以组合物的总体积计，所述普鲁兰糖的质量分数为10-20wt％，例如15wt％。

纳米粒及其制备方法

在一些实施方式中，所述蛋白药物负载于所述两亲性聚合物材料中，形成纳米粒，例如两亲性聚合物材料包封或包埋于纳米粒内部(例如，在纳米粒内的孔隙或其它内部空间中)。在一些实施方式中，纳米粒具有约50至约500nm的平均直径。在一些实施方式中，平均直径为约50至约300nm。在一些实施方式中，平均直径为约200至约250nm(例如，约200、210、220、230、240、245或250)。在一些实施方式中，纳米粒具有约220至约240nm的平均直径(例如，通过动态光散射法测量的)。在一些实施方式中，纳米粒可以是单分散的或接近单分散的(例如，其中至少约80％的分布位于中值粒径的15％，10％或5％内)。

本发明还提供了制备负载蛋白药物的纳米粒的方法，包括：

(1a)提供本发明所述两亲性聚合物材料的溶液；

(1b)提供蛋白药物的溶液；

(1c)将(1a)所述溶液与(1b)所述溶液混合；和

(1d)使用旋转蒸发法除去混合溶液中的溶剂，形成负载蛋白药物的纳米粒。

在一些实施方式中，所述步骤(1a)中的两亲性聚合物材料溶解于有机溶剂中，形成两亲性聚合物材料的溶液。所述有机溶剂包括但不限于：二氯甲烷、四氢呋喃、三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯。

在一些实施方式中，所述步骤(1c)中，采用超声的方式进行混合。超声可以采用本领域熟知的方法进行，例如在功率30％～60％条件下超声1～5分钟。

在一些实施方式中，所述步骤(1c)中，(1a)所述溶液与(1b)所述溶液的体积比为10:1～1:1、8:1～2:1或6:1～3:1，例如为5:1。

微针、微针阵列及其制备方法

在一些实施方式中，所述组合物，例如负载蛋白药物的纳米粒，可以用于制备递送蛋白药物(例如，胰岛素、半乳糖苷酶或其生物活性衍生物)的微针或微针阵列。

在一些实施方式中，微针阵列可以包括多个微针，其中所述多个微针中的每个微针具有约20至约1000微米(例如，约20、50、100、150、200、250、3300、350、400、450、500、450、600、650、700、750、800、650、900、950或约1000微米)的长度。在一些实施方式中，每个微针可以具有近似圆锥形或金字塔形的形状。在一些实施方式中，微针的尖端可以小于约100微米、小于约75微米、小于约50微米、小于约40微米、小于约30微米、或小于约20微米。

微针阵列可以包括多个微针，其中微针的基部以任何合适的二维图案排列。微针可以以规则的阵列(例如，正方形、矩形、圆形、椭圆形或其他形状的图案)排布，其中各个微针之间的距离保持相同或以重复的方式变化，或以不规则阵列(例如，其中各个微针之间的距离以不可识别的重复方式变化)排布。

在一些实施方式中，微针阵列可以作为皮肤贴片的一部分提供。在一些实施方式中，微针阵列可以包括一个或多个背衬层，例如，以保护微针阵列免受湿气或物理损伤(例如，划伤)。在一些实施方式中，微针阵列可以包括从阵列向外延伸(例如，与阵列的基底共面)的层，其包括用于辅助阵列附着于皮肤的皮肤相容性粘合剂。

本发明还提供了制备用于蛋白药物递送的微针阵列的方法(简称为微模具浇铸法)，包括：

(2a)将负载蛋白药物的纳米粒的溶液与微针基质溶液混合，获得混合溶液；

(2b)将(2a)所述溶液分散于包含多个微针空腔的模具中，从而提供填充的模具；

(2c)干燥填充的模具而除去溶剂；和

(2d)去除模具以提供微针阵列。

在一些实施方式中，步骤(2a)中，负载蛋白药物的纳米粒的溶液与微针基质溶液(例如由透明质酸和普鲁兰糖组成)的体积比为1:1～1:20、1:5～1:15或1:5～1:20，例如1:10。

在一些实施方式中，步骤(2b)中的模具的填充可以在真空下进行和/或可以包括离心模具(例如，以有助于有效的和/或增加的微针空腔中纳米粒的填充)。在一些实施方式中，模具可以在干燥器或真空干燥器中进行干燥。

在一些实施方式中，模具可以包含聚合物，如硅酮(例如，聚二甲基硅氧烷(PDMS))。模具可以包含约10、50、100、250、500、1000或更多个的微腔。微腔尖端之间的尖端到尖端的间隔可以为约100至约1000微米(例如，700、750、800、850、900、950或约1000微米)。

在一些实施方式中，可以对制备获得的微针或微针阵列进行评价。评价的指标包括但不限于：硬度、穿刺性。

在一些实施方式中，制备的微阵列可以进行包装，例如，用于储存或运输。例如，包装可以包括聚合物膜，如水分和/或气体不透过的聚合物膜。阵列可以单个包装，或以多阵列组包装。

利用微针阵列递送蛋白药物的方法

本发明提供了将蛋白药物，如胰岛素、半乳糖苷酶或其衍生物递送至对其需要的受试者的方法，包括向受试者给予本发明所述的组合物(例如，负载蛋白药物的纳米粒)或给予本发明所述的微针或微针阵列。

所述给予可以通过任何合适的途径(例如，经皮给予)。

本发明的组合物可以以治疗有效量提供于任何合适的药用载体(例如，水)，媒介或稀释剂中。

在一些实施方式中，所述方法包括将所述微针阵列应用于受试者的皮肤表面。在一些实施方式中，可以将多于一个微针阵列，例如同时或依次地施加于受试者的皮肤表面。例如，可以依次每几个小时施加微针阵列。

在一些实施方式中，受试者是人类受试者，但是应当理解的是，本文的方法对于所有动物物种都是有效的，包括但不限于：除了人之外的哺乳动物。

本发明的优势在于：

(1)本发明将蛋白药物负载于两亲性聚合物材料中获得的可溶性微针，相比于利用吸附作用使蛋白药物包裹于微针表面的包裹型微针，具有更大的载药量；

(2)通过将蛋白药物包载入由胆固醇与小分子糖形成的聚合物纳米粒，可以在蛋白表面形成致密的分子间包裹，从而抑制蛋白分子扩散和降低其流动性，能够显著提高组合物中蛋白药物的稳定性，防止蛋白药物在干燥和制备过程中被降解破坏。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1小分子糖/胆固醇聚合物的合成

小分子糖/胆固醇聚合物的合成，通常以小分子糖和胆固醇氯甲酸酯为原料，采用酰化反应合成。本实施例以海藻糖和葡聚糖为例，给出了小分子糖/胆固醇聚合物的合成方法。应理解，其他小分子糖也可以按照与之类似的方法合成。

(1)海藻糖/胆固醇聚合物的合成

以海藻糖(上海楷洋生物技术有限公司，T0048货号)和胆固醇氯甲酸酯(上海麦克林生化科技股份有限公司，C804850)为原料，采用酰化反应合成。海藻糖和胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1：1，取海藻糖76mg，胆固醇氯甲酸酯100mg，及催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)13.5mg，，置于25ml圆底烧瓶中，加入溶剂10ml二氯甲烷后，室温下磁力搅拌24h。反应结束后，在40℃下真空旋转蒸发除去二氯甲烷，再加入20ml蒸馏水进行水化，待圆底烧瓶壁上固体溶解后，常温下，8000转离心30min，取上清液冻干，待用。

(2)葡聚糖/胆固醇聚合物的合成

以葡聚糖(上海麦克林生化科技股份有限公司，D872035货号)和胆固醇氯甲酸酯(上海麦克林生化科技股份有限公司，C804850)为原料，采用酰化反应合成。葡聚糖和胆固醇氯甲酸酯的摩尔比为1：1，取葡聚糖111.4mg，胆固醇氯甲酸酯50mg，及催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)6.8mg，置于25ml圆底烧瓶中，加入溶剂10ml二氯甲烷后，室温下磁力搅拌24h。反应结束后，在40℃下真空旋转蒸发除去二氯甲烷，再加入20ml蒸馏水进行水化，待圆底烧瓶壁上固体溶解后，常温下，8000转离心30min，取上清液冻干，待用。

取葡聚糖/胆固醇聚合物适量，以CDCl

图1的结果显示，以生物相容性高的胆固醇对葡聚糖进行修饰，已成功制备获得葡聚糖/胆固醇聚合物。

实施例2负载蛋白药物的小分子糖/胆固醇纳米粒的制备及粒径测定

本实施例中，以葡聚糖/胆固醇聚合物为例，制备负载蛋白药物(以胰岛素为例)的葡聚糖/胆固醇纳米粒。由于葡聚糖/胆固醇聚合物以葡聚糖为亲水端，胆固醇为疏水端，能够负载亲水亲脂性药物。

采用逆向蒸发法制备负载胰岛素的纳米粒，称取冻干后的葡聚糖/胆固醇聚合物10mg，加入2mL二氯甲烷溶解，获得葡聚糖/胆固醇聚合物溶液。使用400μL盐酸(0.01mol/L)溶解2.5mg胰岛素(西安瑞禧生物科技有限公司,R-YDS-COW)并与葡聚糖/胆固醇聚合物溶液相混合。使用50％功率探头超声2min，每超声2秒停2秒，之后继续重复此循环直至超声结束。超声结束后，使用旋转蒸发法除去二氯甲烷，得到具有浅蓝色乳光的葡聚糖/胆固醇聚合物纳米粒溶液。

作为对照，本实施例中还制备了葡聚糖/胆固醇空白纳米粒。称取冻干后的葡聚糖/胆固醇聚合物10mg，加入2mL二氯甲烷溶解，获得葡聚糖/胆固醇聚合物溶液。加入400μL双蒸水，使其与葡聚糖/胆固醇聚合物溶液相混合。使用50％功率探头超声2min，每超声2秒停2秒，之后继续重复此循环直至超声结束。超声结束后，使用旋转蒸发法除去葡聚糖/胆固醇聚合物溶液中的二氯甲烷，获得葡聚糖/胆固醇空白纳米粒。

用粒径测定仪(马尔文，Nano-ZS90)，采用动态光散射技术，使用ZetaSize软件对结果进行处理，分别测得葡聚糖/胆固醇空白纳米粒、负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的平均粒径为232.4、221.2nm，粒径分布结果见图2。

实施例3基于透明质酸/普鲁兰糖的负载蛋白药物的可溶性微针矩阵的制备及形态评价

本实施例中，采用微针模具浇铸法制备负载蛋白药物(以胰岛素为例)的可溶性微针矩阵。微针模具包括微针阴模和阳模。微针阴模性状为四棱锥状，槽内含有排列成阵列的微针凹形结构，所述微针凹形结构与微针针体的形状相适配，单片微针片含有225个微针，阵列为15×15排列，针体排列整齐。

使用透明质酸(上海麦克林生化科技股份有限公司，H909935)与普鲁兰糖(北京索莱宝科技有限公司，P6960)作为可溶性微针的基质材料，称取1.0g透明质酸,使用10mL去离子水溶解，称取3.0g普鲁兰糖,使用10mL去离子水溶解，分别取5mL透明质酸与5mL普鲁兰糖溶液相混合，使用750rpm速率磁力搅拌30min。作为对照，使用单独的透明质酸或普鲁兰糖作为可溶性微针的基质材料。称取3.0g普鲁兰糖，使用10mL去离子水溶解，使用750rpm速率磁力搅拌30min，即获得单独浓度为30wt％的普鲁兰糖溶液。称取1.0g透明质酸,使用10mL去离子水溶解，使用750rpm速率磁力搅拌30min，即获得单独浓度为10wt％的透明质酸溶液。

将5mL透明质酸溶液与5mL普鲁兰糖溶液相混合，使用750rpm速率磁力搅拌60min，得到透明质酸/普鲁兰糖混合溶液(1:1)；再将5mL负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒与5mL透明质酸/普鲁兰糖混合溶液相混合，微针组合物混合液中，透明质酸的浓度为5wt％，普鲁兰糖的浓度为15wt％。使用750rpm速率磁力搅拌60min。混合充分以后，将500μL混合溶液加入微针PDMS阴模(Micropoint科技公司，ST-06)中，使用0.3bar压力抽去空气，将溶液和PDMS模具置于真空条件下，抽真空45min，5000rpm离心45min。随后，25℃干燥24h，将微针从PDMS阴模中剥离即可得到负载胰岛素的透明质酸可溶性微针，普鲁兰糖可溶性微针，以及透明质酸/普鲁兰糖可溶性微针。

使用扫描电镜(ZEISS GeminiSEM 300)观察该可溶性微针的形貌特征，将微针阵列表面涂覆了一层金属以增加其表面导电性，在15kV电压下，并在50至400倍率下拍摄微针形貌图像，微针针尖高度约为600μm，结果见图3。

实施例4可溶性微针的硬度和穿刺性评价

使用实施例3的方法制备获得透明质酸可溶性微针、普鲁兰糖可溶性微针、透明质酸/普鲁兰糖可溶性微针，对三种微针的硬度，穿刺性进行评价，具体方法如下：

(1)微针硬度测试

将已制备的透明质酸/普鲁兰糖可溶性微针矩阵15×15(225个针)，针尖向上放置于Universal TA质构仪(上海腾拔仪器科技有限公司)的测试平台上，通过P/25柱形探头，以稳定的0.05mm/sec的速度，施加轴向垂直力，分析仪记录探头接触针尖直到达到下压距离500μm期间的力学变化。通过测量微针发生断裂时所施加的力，即断裂力来评估微针的硬度和机械强度，微针的硬度越大，使其断裂所需的力就越大，微针的机械强度就越高，机械强度是微针能实现透皮及经皮递送的基础。微针的断裂力及位移测试图如图4所示。

从图4可以看出，透明质酸和普鲁兰糖的组合作为可溶性微针的基质材料，相比于单独的透明质酸、普鲁兰糖，能够显著提升制备获得的可溶性微针的硬度。

(2)微针的穿刺性评价

将已制备的透明质酸/普鲁兰糖可溶性微针矩阵按压于小鼠腹部皮肤上，15min后，将微针贴片揭掉，随后用0.4％的台盼蓝溶液对皮肤进行台盼蓝染色10分钟，用0.9％生理盐水将皮肤表面清洗干净，用光学显微镜观察皮肤样品的台盼蓝染色效果。结果见图5。

实施例5可溶性微针中胰岛素的载药量评价

使用高效液相色谱测定负载胰岛素的可溶性微针矩阵中胰岛素的含量，采用反相C18色谱柱，流动相为0.2mol/L硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠28.4g加水溶解后，加磷酸2.7mL，乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000mL)-乙腈(74：26)，柱温为40℃，检测波长为214nm。胰岛素在可溶性微针矩阵中的含量如图6所示。

现有的微针贴片(CN114569706A)中胰岛素的含量约为17.3μg/mL，而本发明中每片贴片中的胰岛素含量约为81.2μg/mL，胰岛素的载药量更高。

实施例6可溶性微针中胰岛素稳定性评价

使用粒径测定仪(马尔文，Nano-ZS90)，采用动态光散射技术，测定在4℃下负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的粒径随时间的变化。如图7所示，纳米粒的粒径在4℃下保存7天仍能保持稳定，粒径约为220nm左右，说明胰岛素在包载入葡聚糖/胆固醇纳米粒后，无泄漏和渗出，保持稳定。

将包载有载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒的可溶性微针溶解于PBS(pH＝7.4)中，通过检测纳米粒的粒径，可以测定负载胰岛素的葡聚糖/胆固醇纳米粒是否有胰岛素的析出和渗漏，从而可以检测在4℃下保存不同时间负载胰岛素的纳米粒在可溶性微针中的稳定性。如图8所示，说明在4℃保存后，负载于可溶性微针中的葡聚糖/胆固醇纳米粒可以在至少7天内保持稳定，无泄漏和渗出。

实施例7负载β-半乳糖苷酶葡聚糖/胆固醇纳米粒的可溶性微针稳定性评价

本实施例中，以β-半乳糖苷酶作为蛋白药物的实例，验证葡聚糖/胆固醇纳米粒对β-半乳糖苷酶稳定性的影响。负载β-半乳糖苷酶葡聚糖/胆固醇纳米粒及其可溶性微针制备方法同实施例2和3。

使用葡聚糖/胆固醇纳米粒包载β-半乳糖苷酶并载入可溶性微针后与空白β-半乳糖苷酶、仅有葡聚糖/胆固醇纳米粒包载的β-半乳糖苷酶、聚乙二醇-聚丙交酯-乙交酯纳米粒(SIGMA-ALDRICH西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,764752)包载的β-半乳糖苷酶对比，通过使用邻硝基苯-β-D-半乳糖苷为底物，将4组样品在37℃下保存15天，分别于第5、10、15天检测样品中β-半乳糖苷酶的活性，测定4组样品中β-半乳糖苷酶将无色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷转化成黄色产物邻硝基苯酚的速率，通过考察β-半乳糖苷酶的酶活，从而评价4组样品中β-半乳糖苷酶的稳定性。

β-半乳糖苷酶活性的检测方法为标准曲线法，具体如下：将样品使用含有0.1％牛血清蛋白和1mM氯化镁的50mM磷酸盐缓冲液溶解，使其含有5μg/mL的β-半乳糖苷酶。随后，将20μL样品加入96孔板中，再加入200μL氯化镁溶液(使用1.4mM氯化镁溶液于0.1M磷酸盐缓冲液中配制)。将96孔板至于37℃下孵育10分钟后，在孔中加入20μL的50mM的邻硝基苯-β-半乳糖苷溶液。使用酶标仪在37℃、405nm吸光度条件下，间隔30秒连续测量15分钟，可以测量出底物邻硝基苯-β-半乳糖苷转化为黄色产物邻硝基苯酚的转化速率。根据标准曲线和样品测得的底物转化速率，获得有活性的β-半乳糖苷酶的浓度，再通过计算获得β-半乳糖苷酶的活性：β-半乳糖苷酶的活性＝有活性的β-半乳糖苷酶的浓度×反应体积/样品中β-半乳糖苷酶的含量。

如图9所示，空白β-半乳糖苷酶组在37℃下保存15天后基本完全失去活性，而经过葡聚糖/胆固醇纳米粒包载并载入可溶性微针后，β-半乳糖苷酶的活性还能维持在62.9％(37℃下保存15天)。与聚乙二醇-聚丙交酯-乙交酯纳米粒相对比，经过葡聚糖/胆固醇纳米粒包载可以明显提高β-半乳糖苷酶的活性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。