一种乳酸菌快速计数方法

技术领域

本发明涉及乳酸菌计数领域，更为具体的，涉及一种乳酸菌快速计数方法。

背景技术

现有技术中，例如公开号为CN101659982A的中国专利申请公开了一种乳酸菌活菌总数快速计数方法，包括步骤：取次甲基蓝0.1-1g，碳酸钠0.5-2g，蒸馏水100ml，混匀，静置0.5-2h后，过滤，静置2h；称取1克菌粉或移取1ml乳酸菌培养液，用无菌水进行10-100倍稀释，制成菌悬液；移取菌悬液，用无菌水进行10倍梯度稀释；吸取5μl菌悬液置于载玻片上，加5μl上述染液，盖上盖玻片；选择10～20个视野计算乳酸菌活菌总数，并乳酸活菌数平均值；计算每克菌粉/每毫升菌液中含有的乳酸活菌数为上述公式，其中，C为盖玻片的面积，B为一个视野的面积，A为每个视野中乳酸活菌数平均值等。该专利申请方案采用次甲基蓝和碳酸钠配成的染色液1:1染色，由于乳酸菌是革兰氏阳性菌，在观察对紫色菌进行计数时，可能会存在误把阴性菌也作为乳酸菌进行计数的问题，影响计数的准确性。

现有国家标准GB 4789.35-2016乳酸菌检验对乳酸菌的计数需要时间72h±2h左右，这是因为一个乳酸菌吸收营养、增殖，最终达到肉眼可见的菌落进行计数需要较长时间。并且，乳杆菌为厌氧菌，嗜热链球菌为兼性厌氧菌，二者培养条件不同，故只能分开检测，耗费人力和培养基。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种乳酸菌快速计数方法，可直接数出乳杆菌和链球菌的数量，将检测时间缩短至1小时，解决了国标方法耗时较长的缺点，同时使用的试剂较少，为企业节约成本等。

本发明的目的是通过以下方案实现的：

一种乳酸菌快速计数方法，包括步骤：

S1，对待检样品以设定稀释梯度F进行稀释处理；

S2，吸取稀释后的待检样品涂抹在载玻片上的设定区域M，用结晶紫染色液染色，水洗，再用革兰氏碘液染色，再水洗，用乙醇脱色，再水洗，加沙黄染色液或番红染色液进行复染，干燥后上显微镜镜检；

S3，在载玻片设定区域M内镜检多个不同的视野，并记录每个视野的紫色活菌数，求出每个视野的平均活菌数n。

进一步地，包括步骤：

S4，采用测微仪测出物镜的面积s1，设定区域M面积/s1＝N，计算出载玻片设定区域M内有多少个物镜大小N。

进一步地，包括步骤：

S5，计算设定区域M内活乳酸菌总数q＝N×n。

进一步地，包括步骤：

S6，计算待检样品稀释前的活乳酸菌总数Q＝q×F。

进一步地，所述稀释梯度F在10

进一步地，用结晶紫染色液染色1～2mins。

进一步地，再用革兰氏碘液染色1min。

进一步地，用乙醇脱色20～30s。

进一步地，复染1～2mins。

进一步地，在载玻片设定区域M内镜检10个不同的视野。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过显微镜对乳酸菌进行计数，利用结晶紫染色液染色，水洗，革兰氏碘液染色，再水洗，用乙醇脱色，加沙黄染色液或番红染色液进行复染等，可直接数出乳杆菌和链球菌的数量，将检测时间缩短至1小时，解决了国标方法耗时较长的缺点，同时使用的试剂较少，为企业节约成本。

(2)本发明用革兰氏染色，因为乳酸菌是革兰氏阳性菌，颜色为紫色，而阴性菌为红色。在观察时，只需要对紫色菌进行计数就可以了，这样不会误把阴性菌也作为乳酸菌进行计数了，提高了检测的准确性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的方法步骤流程图；

图2为本发明中载玻片的正面结构示意图；

图3为本发明中载玻片的侧面结构示意图。

具体实施方式

本说明书中所有实施例公开的所有特征(包括任何附加权利要求、摘要和附图)，或隐含公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合或替换。

如图1～3所示，一种乳酸菌快速计数方法，包括步骤：

S1，对待检样品以设定稀释梯度F进行稀释处理；

S2，吸取稀释后的待检样品涂抹在载玻片上的设定区域M，用结晶紫染色液染色，水洗，再用革兰氏碘液染色，再水洗，用乙醇脱色，再水洗，加沙黄染色液或番红染色液进行复染，干燥后上显微镜镜检；

革兰氏阳性菌细胞壁比较厚，用结晶紫和碘液染色后，再用乙醇洗涤，这样阳性菌细胞壁就会脱水收缩，使染液阻留在细胞壁内；而革兰氏阴性菌细胞壁比较薄，乙醇洗涤，会使细胞壁上出现较大缝隙，结晶紫和碘液染液会流出，细胞呈无色，再用沙黄染液复染，就使阴性菌呈现红色。阳性菌还是紫色，这样就可以分辨阳性菌和阴性菌。

S3，在载玻片设定区域M内镜检多个不同的视野，并记录每个视野的紫色活菌数，求出每个视野的平均活菌数n。

进一步地，包括步骤：

S4，采用测微仪测出物镜的面积s1，设定区域M面积/s1＝N，计算出载玻片设定区域M内有多少个物镜大小N。

进一步地，包括步骤：

S5，计算设定区域M内活乳酸菌总数q＝N×n。

进一步地，包括步骤：

S6，计算待检样品稀释前的活乳酸菌总数Q＝q×F。

进一步地，所述稀释梯度F在10

进一步地，用结晶紫染色液染色1～2mins。

进一步地，再用革兰氏碘液染色1min。

进一步地，用乙醇脱色20～30s。

进一步地，复染1～2mins。

进一步地，在载玻片设定区域M内镜检10个不同的视野。

每次水洗是为了冲洗掉结晶紫、碘液染液和乙醇。

实施例

1、对待检样品25g，选择10

2、吸取10ul匀液，均匀涂抹在载玻片10×10mm区域内，即设定区域M为图2中所示10×10mm区域，用结晶紫染色液染色1min，水洗，再用革兰氏碘液染色1min，用水洗，用95％的乙醇脱色30s，水洗，加沙黄染色液或番红染色液，复染1min，干后上显微镜镜检；

3、在10×10mm区域内镜检10个不同的视野，并记录每个视野的紫色活菌数，紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌，而乳杆菌和嗜热链球菌为革兰氏阳性菌，根据颜色能够快速求出每个视野的平均活菌数n。

4、用测微仪测出物镜的面积s1，计算出10×10mm区域有多少个物镜大小N；

5、计算设定区域M内活乳酸菌总数q＝N×n；

6、计算活乳酸菌总数Q(个/ml)＝N×n×F。

除以上实例以外，本领域技术人员根据上述公开内容获得启示或利用相关领域的知识或技术进行改动获得其他实施例，各个实施例的特征可以互换或替换，本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。